隔离和成像现场， 通过颤音分割老鼠肾佩尔维斯的精致起搏器区域

此协议的目标是使用振动切除隔离小鼠肾骨盆的完整心脏起搏器区域。然后，这些部分可用于原位 Ca²⁺ 成像，以阐明心脏起搏器细胞和振动切片中其他间质细胞的 Ca²⁺ 瞬态特性。

该协议产生肾脏骨盆的完整心脏起搏器区域，肾脏内的平滑肌肉器官，将尿液泵入输尿管和膀胱。与将细胞与肾骨盆隔离不同，这种方法为肾骨盆起搏器区域提供了完整的原位环境，并为研究肾骨盆起搏提供了更生理的准备。从未执行过此技术的个人可能难以切割均匀的部分。

首次使用者必须确保肾脏在振动器阶段水平，并且不会加快切割过程。使用内组织钳和内部解剖剪刀，捏肠，并解除他们从腹壁。同时切开肠道底部从身体的近端十二指肠和远端结肠，以获得包含肾脏的复古腹膜空间。

用组织钳轻轻捏合并抬起尿管的基端。使用解剖剪刀，将捏紧的尿道下方切向肾脏，直到肾脏从周围的结缔组织中解放出来。一旦肾脏暴露，单独提取。

用冰冷的 KRB 溶液填充硅弹性体涂层盘。将肾脏转移到解剖盘中，并确保完全淹没。使用细弹簧剪刀和内钳从肾脏底部取出脂肪组织，以暴露远角肾骨盆或RP和近身输尿管。

使用细弹簧剪刀和钳子将近似尿管和部分远点 RP 从底座中取出。用细尖钳刺穿外肾胶囊，将尖端从肾脏身体中取出。用钳子用每只手，捏胶囊的松散末端，并剥开它们，直到剩余的肾胶囊膜被完全去除。

将剃须刀刀片插入振动器的刀片支架，并将刀片间隙角度调整到约 18 度。调整文本手稿中提到的刀片参数，确保肾脏部分厚度不超过 150 微米，这将对钙离子成像实验产生负面影响。使用钝端钳子轻轻地抓住并从冰冷的KRB溶液中取出准备好的肾脏。

立即将肾脏放在吸水纸上约两到四秒钟，以去除多余的外部水分。轻轻地将肾脏滚动到吸附纸上，以确保肾的四面都干燥，使肾脏与振动器阶段有最佳粘附。立即将一层薄薄的氰化硅酸酯胶水涂抹在振动器标本板的底座上，并使用钝端钳子将肾脏输尿管侧向下置于胶水覆盖的区域。

用钳子的平边轻轻地将向下压力施加到肾脏顶部约 10 到 20 秒，以干燥胶水。牢固地将标本板固定在缓冲盘底部，并调整 KRB 溶液的水平，使肾脏顶部完全浸入。对于自动颤音切除，选择离肾脏 0.5 到 1 厘米的颤音刀片切割周期的起始和结束位置，以确保整个肾脏平面被分割。

启动自动切割过程，确保刀片与肾脏接触。使用钳子，收集从肾脏中解放出来的部分，并立即将其转移到各个水井。继续剖腹产方案，使用光显微镜识别肾脏切片中的PKJ区域，直到PKJ区域变得更加明显。

用冰冷的 KRB 溶液填充硅弹性体涂层成像盘。将单个肾片转移到盘子中。将米努蒂安针插入肾脏切片的外围，将部分固定到成像盘的底座上。

将成像盘放在直立旋转盘共聚焦显微镜的舞台上，并立即开始与 KRB 溶液进行香水处理。使用低放大倍率浸水客观透镜定位肾片。使用地标将成像场集中在 PKJ 所在的切片区域。

一旦PKJ定位，使用更高的放大水浸入客观透镜放大感兴趣的区域。区分PKJ壁中不同类型的钙离子瞬态持续时间中感兴趣的不同细胞。一旦发现感兴趣的细胞，调整激光强度，产生良好的信号与噪声比，并以 16 到 32 赫兹之间的时间采样频率记录图像。

整个肾脏部分的光微观图像显示了单个 PKJ 区域的注释地标。多个PKJ区域出现在靠近内美杜拉和离心肾的地方。PKJ 肾动脉和 PKJ 边界的位置显示在这里。

此处显示了小鼠在 PDGFR 阿尔法阳性细胞中表达 GCaMP 的 PKJ 部分。悬浮在腹膜组织之间的薄PKJ壁可以使用肾动脉等地标来区分。GCaMP6f在这个特定的转基因组织中的表达分布在整个PKJ的宽度，横跨肌肉和冒险层。

在PDGFR阿尔法GCaMP6f阳性肾片中，通常延伸到PKJ壁宽度的细胞网络是荧光的，并显示不同持续时间和频率的振荡钙离子瞬时。在SMC GCAMP3阳性肾片中，肌肉层中存在一层GCAMP3阳性细胞。空间图显示，位于PKJ冒险的PDGFRα阳性细胞引起长期低频钙离子瞬时，而SMC发射更短的持续时间钙离子瞬时更频繁。

同样，在SMC中也观察到收集管道和振荡钙离子瞬态内及周围一系列荧光钙离子信号。在尝试此程序时，重要的是肾脏在颤音切除过程中尽可能平整，以确保均匀的肾脏切片从块中解放。在此程序之后，可以进行其他方法，如单细胞隔离、免疫造血术和分子研究，以增进我们对肾骨盆心脏起搏器机制的了解。