通过振动切片法分离与成像小鼠肾盂完整起搏区域的活体组织

本方案可获得完整的肾盂起搏区域，即肾脏内将尿液泵入输尿管并进入膀胱的平滑肌器官。与从肾盂中分离细胞不同，该方法提供了肾盂起搏区域完整的原位环境，更符合生理条件，适用于研究肾盂的起搏活动。从未操作过该技术的人员可能难以切出均匀的切片。

初次使用者必须确保肾脏在振动切片机载物台上保持水平，并且不要加快切片过程。使用组织内镊子和解剖剪，夹住肠道并将其从腹壁提起。同时在近端十二指肠和远端结肠处剪开肠道的下方，使其与身体分离，从而暴露包含肾脏的腹膜后腔隙。

用组织镊轻轻夹住输尿管远端并提起。使用解剖剪在被夹住的输尿管下方朝肾脏方向剪开，直至将其从周围结缔组织中游离出来。暴露肾脏后，逐一取出。

用冰冷的KRB溶液填充硅胶弹性体包被的培养皿。将肾脏转移至解剖皿中，并确保其完全浸没。使用精细弹簧剪和内用镊子去除肾脏基部的脂肪组织，以暴露远端肾盂（RP）和近端输尿管。

使用精细的弹簧剪和镊子从基部切除近端输尿管和部分远端 RP。用尖头镊子刺穿外层肾包膜，镊尖朝向远离肾实质的方向倾斜。双手各持镊子，夹住包膜松动的末端，将其逐渐剥离，直至完全去除残留的肾包膜组织。

将剃须刀片插入振动切片机的刀片架中，并将刀片的间隙角调整至约18度。按照文稿中所述调整刀片参数，确保肾组织切片厚度不超过150微米，以免对钙离子成像实验产生不利影响。使用钝头镊子轻轻夹取并从冰冷的KRB溶液中取出已准备好的肾脏组织。

将肾脏立即置于吸水纸上，约两到四秒，以去除多余的外部水分。轻轻滚动肾脏，使其所有侧面的实质组织均干燥，以确保肾脏与振动切片机载物台之间达到最佳粘附。立即在振动切片机样品板底部涂上一层薄薄的氰基丙烯酸酯胶水，并使用钝头镊子将肾脏的输尿管面朝下放置于涂有胶水的区域。

用镊子的平边轻轻向下按压肾脏顶部，持续约10至20秒，以干燥胶水。将标本板牢固地固定在缓冲槽底部，并调节KRB溶液的液面高度，使肾脏顶部完全浸没。对于自动振动切片，选择振动切片刀切割循环的起始和终止位置，距离肾脏0.5至1厘米，以确保整个肾脏平面被切片。

启动自动切片程序，确保刀片与肾脏接触。使用镊子收集从肾脏上分离下来的切片，并立即转移至各个孔中。继续切片操作，并使用光学显微镜识别肾切片中的PKJ区域，直至PKJ区域变得更加明显。

用冰冷的KRB溶液填充涂有硅酮弹性体的成像培养皿。将单个肾组织切片转移至培养皿中。在肾组织切片周围插入微型固定针，以将切片固定在成像培养皿底部。

将成像培养皿置于直立式转盘共聚焦显微镜的载物台上，并立即开始用KRB溶液灌注。使用低倍水浸物镜定位肾组织切片。利用解剖标志物，将成像视野中心对准切片中存在近端小管连接段（PKJ）的区域。

确定浦肯野纤维网（PKJ）位置后，使用高倍水浸物镜放大感兴趣区域。区分PKJ壁内具有不同类型钙离子瞬变持续时间的感兴趣细胞。一旦确定了感兴趣细胞，调整激光强度以获得良好的信噪比，并以16至32赫兹的时间采样频率记录图像。

全肾切片的光学显微图像显示了单个皮质髓质交界区（PKJ）的标注解剖标志。多个PKJ区域位于内髓质附近及肾脏远端。此处展示了PKJ区肾小动脉及PKJ边界的定位。

显示的是在PDGFRα阳性细胞中表达GCaMP的小鼠的PKJ切片。利用肾小动脉等解剖标志，可以辨识出悬于实质组织之间的薄PKJ壁。在此特定转基因组织中，GCaMP6f的表达遍布整个PKJ，跨越肌层和外膜层的全宽度。

在PDGFRα GCaMP6f阳性的肾组织切片中，可见一个通常横跨肾盂输尿管连接部（PKJ）管壁宽度的细胞网络，该网络具有荧光信号，并表现出持续时间与频率各异的钙离子振荡瞬变。在SMC GCaMP3阳性的肾组织切片中，肌层内存在一层GCaMP3阳性细胞。时空图谱显示，位于PKJ外膜的PDGFRα阳性细胞产生持续时间较长但频率较低的钙离子瞬变，而平滑肌细胞（SMCs）则更频繁地产生持续时间较短的钙离子瞬变。

类似地，还可观察到集合管内部及周围存在一系列荧光钙离子信号，以及平滑肌细胞（SMCs）中振荡的钙离子瞬变。在进行该操作时，使用振动切片机切片过程中应尽量保持肾脏处于水平位置，以确保从组织块中分离出厚度均匀的肾组织切片。在完成该操作后，可进一步开展单细胞分离、免疫组织化学以及分子生物学研究等其他方法，以加深对肾盂起搏机制的理解。