生物组织样本的串行块面扫描电子显微镜 （SBF-SEM）

串行块面扫描电子显微镜提供了前所未有的三维组织超结构视图，可以回答许多以前不可能或极其难以追求的问题。该技术允许快速和可重复地生产具有最小组织充电和人工制品的三维数据集。更重要的是，它允许每天自动捕获数千张图像。

标准传输电子显微镜提供出色的蜂窝超结构。但是，这些图像缺乏三维上下文，可能难以解释。串行块面扫描电子显微镜提供了三维上下文，允许对复杂过程进行解释。

虽然此协议是可靠且可重复的，但某些步骤需要精确性，并且对于此方法的成功至关重要。此视频将详细演示这些关键步骤。将样品固定在含有2.5%谷氨酸和2毫升氯化钙的0.1摩尔碳酸钠缓冲液中后，样品应切成不超过两毫米的方块，用含有两毫米氯化钙的0.1摩尔钠可可酸酸钠缓冲液清洗。

然后，组织按顺序沾染铁氰化钠、硫化氢和二氧化硫化钠。在二氧化钠孵育后，在4摄氏度的温度下用1%的尿素醋酸盐治疗组织。第二天早上，溶解0.066克硝酸铅在10毫升0.03摩尔阿斯巴酸溶液中，并使用一种普通氢氧化钾将沃尔顿铅分方溶液的pH值调整为5.5。

在烤箱中加热溶液后，每次在室温下洗涤五次，每次洗涤三分钟，双蒸馏水，然后将组织转移到 60 摄氏度加热 Walton 的铅分离溶液中，在 60 摄氏度下加热 30 分钟。在孵化结束时，洗涤组织，使其脱水，在上升的冰冷的乙酮系列中，然后在室温乙酮中孵育10分钟。然后将组织置于血酮中硬混合树脂的 1:3 比例中，在旋转平台上渗透 4 小时，然后在旋转平台上以 1:1 的树脂与 Acetone 溶液的比例进行 8 小时或夜间渗透，然后在旋转平台上以 3:1 的比例对树脂与 Acetone 进行夜间渗透。

第二天早上，在旋转平台上，在室温下以100%树脂渗透组织，进行4至8小时、1个通宵和4小时室温渗透。第二天早上，用木棍将少量树脂与炭黑粉混合，直到树脂与粉末饱和，但仍是液体，不会变粒状。住宅应类似于厚墨水，并且能够在没有可见团的情况下缓慢滴落 将组织样本置于硅橡胶模具中，并捕获图像，以便以后参考树脂块内的样品方向。

当样品到位时，覆盖硅胶模具末端碳黑饱和树脂中的组织，标签指示树脂另一端的模具中的实验和组织细节。然后，将模具放入 65 摄氏度的烤箱中，在斜坡上放置约一小时。当碳黑注入树脂已充分固化，从烤箱中取出霉菌，并开始与空井，填充模具的其余部分与透明树脂，注意标签保持可见。

当样品被透明树脂覆盖时，将硅胶模具放回 65 摄氏度的烤箱中，而不是倾斜，48 小时，然后去除霉菌。要准备成像块，将树脂嵌入的标本放在一个微原子夹头上，锥形末端从夹头中伸出大约五到六毫米。用螺丝将标本锁定到位，并将标本置于热灯下。

几分钟后，将夹头放入立体显微镜支架中，并使用新的双刃剃须刀刀片使薄块与块面平行，直到组织可见，与没有组织的树脂部分相比，反射和粒状的要小一些。在修剪销架中固定铝标本销，并在针脚表面制作几个深而纵横交错的划痕，为用于固定标本的胶水提供更大的表面积。将标本放在热灯下，将剃须刀直接推入树脂块，然后进行第二次垂直切入块中，以修剪组织样本中多余的树脂，使该块直径约为三毫米，高度为两到三毫米。

进行初始修剪后，再次加热热灯下的方块，并使用新的双刃剃须刀刀片在单次平滑切割中将树脂块的顶部切开约一毫米。将包含切割铝销的修剪销架放在立体显微镜插座中，并将薄薄的氰丙烯酸胶粘在销面上，使其完全覆盖销，而不会形成可见的半月板。使用钳子将修剪过的组织块压在标本针面的中心几秒钟，并让胶水固定几分钟。

当胶水彻底干燥后，将组织定位在树脂块的凸起部分，并使用双刃剃须刀将含有组织样本的树脂的凸起部分修剪到不超过一平方毫米的区域。慢慢地小心地去除尽可能多的过量树脂，使方块在一个维度上稍长一些，并使用最终的金属文件将包含组织样本的凸起部分以外的区域的多余树脂向下倾斜到针脚边缘。在将薄薄的银漆和金色溅到整个样品块表面之前，先从准备好的样品中去除树脂颗粒和灰尘。

涂层后，从块面表面修剪多余的银漆，并将安装和修剪的块放在定制的转移移液管的球状末端，并附上适当的标签。利用 SBF-SEM 成像技术，在成年小鼠角膜中确定了无弹性蛋白微纤维束网络。该网络以不同的层组织，纤维与角细胞紧密相连，甚至位于角蛋白表面的浅层入侵中。

该协议的应用导致发现了以前未知的中央角膜神经群，这些角膜神经与基底上皮细胞在上皮边界融合。中央角膜的 SBF-SEM 成像揭示了肢体血管、神经束和相关细胞的存在，这些细胞可以手动分割用于 3D 重建。此成像过程的一些陷阱包括使用过长的像素停留时间，这可能导致后续图像波浪和扭曲，从块面小放电的电子，导致线条的快速对比变化，刀划痕块面由于损坏的刀或碎片堆积在刀的边缘，当样品仍在成像室中时，来自扩展电子束的人工制品聚焦在块面上，组织固定不当，导致细胞结构和结缔组织分离，以及组织内大量充电或树脂块导致图像跳过。

切割组织块时，必须很好地了解组织位于块内的位置，以免意外地修剪掉任何重要的样本区域。如果需要特定细胞结构或相互作用的更高分辨率图像，则可以停止成像，从显微镜中取出方块，并在超显微镜上切割部分，以便在传输电子显微镜中查看这些图像，连续块面扫描电子显微镜可完全独到地查看生物组织。使用此协议，我们能够快速获取高质量的数据集，并扩展我们可以探索的组织范围。