Name: 生物组织样本的串行块面扫描电子显微镜 （SBF-SEM） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: 学习串行块面扫描电子显微镜技术，用于生物组织样本的三维超微结构成像。该方法通过精确的固定、染色和成像设置，实现高质量的三维数据集重建，助力研究人员深入解析复杂的细胞生物学过程。

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我们感谢 Sam Hanlon 博士、Evelyn Brown 和 Margaret Gondo 提供出色的技术支持。本研究部分由美国国立卫生研究院（NIH）R01 EY-018239 和 P30 EY007551（国家眼科研究所）、部分由 Lions 视力基金会、部分由 NIH 1R15 HD084262-01（国家儿童健康与人类发展研究所）资助。 &amp;#38; 人类发展）

所有动物的处理均遵循《视力与眼科研究协会关于在视力与眼科研究中使用动物的声明》以及休斯顿大学视光学院动物处理指南中所述的规定。所有动物实验程序均已获得相应机构的批准：小鼠、大鼠、兔、豚鼠和非人灵长类动物的实验程序已获休斯顿大学动物护理与使用委员会批准，斑马鱼实验程序已获德堡大学动物护理与使用委员会批准，猪的实验程序已获贝勒医学院动物护理与使用委员会批准。所有人体组织的处理均遵循《赫尔辛基宣言》关于人体组织研究的规定，并已获得相应的机构审查委员会批准。
1. 组织处理
<ol>
	<li>通过将二甲胂酸钠粉末溶于ddH₂O中，配制0.4 M二甲胂酸钠缓冲液的储备液。2O. 充分混匀缓冲液，并将溶液pH值调节至7.3。该缓冲液用于配制固定液（组成见下文步骤1.3）、洗涤缓冲液，以及四氧化锇和亚铁氰化钾溶液。 
	注意：对于SBF-SEM研究，灌注固定通常是最佳的固定方法，因为该方法可实现快速且全身范围内的固定。如果研究设计中无法进行灌注固定，请跳至步骤1.3。</li>
	<li>以适合该动物模型的生理压力进行灌注固定24,25,26通过经心脏依次灌注肝素化生理盐水和固定液完成，灌注液置于高于动物体特定高度（例如100 cm，相当于该动物模型循环系统生理压力），使固定液流入左心室，并从右心房的切口流出。随着血液被固定液取代，目标组织将逐渐变苍白；若全部或部分组织未出现褪色，则表明组织可能未得到充分固定，超微结构可能无法良好保存。</li>
	<li>使用剃须刀片或锋利的解剖刀将组织样本切成不超过 2 mm × 2 mm × 2 mm 的小块。如果跳过了步骤 1.2，则应迅速操作，以便尽快进行浸没固定。
	<ol>
		<li>或者，在固定液中解剖组织，然后转移至新鲜固定液中以完成浸没固定过程。固定液的最终组成为含2.5%戊二醛和2 mM氯化钙的0.1 M卡考基酸钠缓冲液。固定时间至少在室温下进行2小时，或在4 °C下最长过夜。如有可能，固定期间使用摇床或倾斜板轻轻振荡样品。</li>
		<li>或者，如果有逆变微波炉可用，可在真空条件下使用上述固定剂，以150瓦功率进行微波固定，共4个循环，每个循环1分钟开启、1分钟关闭。对于步骤1.3，推荐采用微波固定法，因其可快速固定组织并良好保存组织超微结构。27. 
		注意：在本实验方案中，组织切片绝不能干燥，应迅速将组织从一种溶液转移至下一种溶液，避免暴露在空气中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在含有2 mM氯化钙的0.1 M二甲胂酸钠缓冲液中，室温下清洗固定组织，每次3分钟，共5次（总计15分钟）。</li>
	<li>新鲜配制以下铁氰化锇溶液，最好在前一步洗涤过程中进行。将4%的四氧化锇溶液（用ddH₂O配制）与1.25%的亚铁氰化钾溶液等体积混合。2O) 与等体积的含有4 mM氯化钙的3%亚铁氰化钾-0.2 M卡可基酸缓冲液混合。上一步洗涤后，将组织置于该溶液中，于冰上避光并在通风橱中孵育1小时。 
	注意：四氧化锇为黄色结晶物质，封装于安瓿瓶中。配制四氧化锇溶液时，需打开安瓿瓶，加入ddH₂O。2O，并在避光条件下超声处理3-4小时，直至晶体完全溶解。四氧化锇溶液为澄清黄色溶液，若溶液呈黑色，则表明四氧化锇已被还原，不应继续使用。</li>
	<li>在组织于铁氰化锇溶液中孵育的同时，开始配制硫代碳酰肼（TCH）溶液。该溶液需新鲜配制，并在1小时铁氰化锇固定步骤结束时立即可用。将0.1 g硫代碳酰肼与10 mL ddH₂O混合2O，并将该溶液置于60 °C烘箱中1小时。为确保溶液充分溶解，每10分钟轻轻摇动一次。使用前，用0.22 µm注射器滤器过滤该溶液。</li>
	<li>在TCH中孵育之前，用室温ddH₂O洗涤组织2每次5分钟，共3次（总计15分钟）。</li>
	<li>将组织置于过滤后的 TCH 溶液中，室温下孵育总时长为 20 分钟（图1A- C).</li>
	<li>在TCH中孵育后，用室温ddH₂O洗涤组织，每次3分钟，共洗5次（总计15分钟）。2O.</li>
	<li>将组织置于ddH₂O中2用含2%四氧化锇（非用亚铁氰化钾还原的锇）的溶液在室温下固定30分钟。该步骤需在通风橱内并避光条件下进行，因为四氧化锇可被光照还原（例如，用铝箔包裹避光）。图1D- F).</li>
	<li>四氧化锇孵育后，于室温 ddH₂O 中洗涤组织，每次 3 分钟，共洗涤 5 次（总计 15 分钟）2O.</li>
	<li>将组织置于1%的醋酸铀酰水溶液中（将醋酸铀酰粉末溶于ddH₂O）2O）在4 °C冰箱中过夜。</li>
	<li>从冰箱中取出组织前，立即配制新鲜的Walton's铅天冬氨酸溶液。首先，将0.066 g硝酸铅溶解于10 mL 0.03 M天冬氨酸溶液（0.04 g天冬氨酸溶于10 mL蒸馏水中）中，然后用1 N KOH（0.5611 g溶于10 mL蒸馏水中）调节pH至5.5。 
	警告：调节 pH 值时可能形成沉淀，此情况不可接受。
	<ol>
		<li>使用搅拌子，在监测pH的同时缓慢滴加1 N KOH。将配制好的澄清酒石酸铅溶液置于60 °C烘箱中预热30分钟。若出现沉淀，则该溶液不可使用，需重新配制。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从冰箱中取出组织，在室温 ddH₂O 中清洗 5 次，每次 3 分钟（共 15 分钟）2O.</li>
	<li>洗涤后，将组织置于预热的Walton's lead aspartate溶液中，在60 °C下孵育30分钟。</li>
	<li>在Walton's铅天冬氨酸溶液中孵育后，用室温ddH₂O洗涤组织5次，每次3分钟（共15分钟）。2O (图1G- I).</li>
	<li>通过冰冻丙酮梯度（30%、50%、70%、95%、95%、100%、100% 和 100% 丙酮（溶于 ddH₂O））对组织进行脱水2必要时，每步操作允许10分钟。</li>
	<li>冰冻脱水处理后，将组织置于室温丙酮中10分钟。
	<ol>
		<li>在此期间，配制 Embed 812 ACM 树脂。使用 &#34;硬混合&#34; 配方，因为它更耐电子束损伤。充分混合树脂后，将组织置于 Embed 812:丙酮（1:3 混合）中 4 小时，随后置于 Embed 812:丙酮（1:1 混合）中 8 小时或过夜，最后置于 Embed 812:丙酮（3:1 混合）中过夜。进行这些树脂渗透步骤&#160;室温下进行步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第二天，将组织置于100% Embed 812中4–8小时，随后在新鲜的100% Embed 812中过夜，最后再转入新鲜的100% Embed 812中4小时。进行这些树脂浸润步骤&#160;室温下进行步骤。
	<ol>
		<li>包埋前，取少量树脂放入混合容器中，缓慢加入炭黑粉末并搅拌（可用木棒搅拌），直至树脂被粉末饱和但仍保持流动性，且不结成颗粒。混合物应呈浓稠的墨汁状，能从木棒上缓慢滴落，无明显结块。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将组织样本置于硅胶模具中进行定向，并拍照记录样本在树脂块中的位置，以便后续参考。在硅胶模具尖端用饱和碳黑树脂覆盖样本，然后将模具放入65 °C的烘箱中加热约1小时。
	<ol>
		<li>将模具倾斜放置，使树脂聚集在模具末端覆盖组织样本的一端。在模具中树脂相反的一端放置带有实验/组织样本编号的标签图2A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从烤箱中取出硅胶模具，用透明树脂（不含炭黑）填充模具的剩余部分，确保标签仍清晰可见。将掺有炭黑的树脂充分固化，以防止其与透明树脂轻易混合。
	<ol>
		<li>在模具中预留一个不包含组织的额外孔。从该额外孔开始，用透明树脂填充模具的其余孔位。</li>
		<li>如果炭黑浸渍树脂开始渗入透明树脂，请将硅胶模具重新放回烤箱中继续加热（例如，15分钟）。</li>
		<li>待所有组织样本均被透明树脂覆盖后，将硅胶模具放回烘箱中（水平放置，无倾斜），于65 °C下加热48小时，以完成固化过程。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 区块制备
注意：该方法取决于样本在包埋块中的方向以及切片的方式。然而，最常见的组织定向方式是将组织置于树脂包埋块尖端的中心位置，并与树脂包埋块的长轴方向垂直。
<ol>
	<li>大多数情况下，首先修剪包埋块的末端以定位组织：将样本块放入切片机的夹头中，使锥形端向上伸出夹头约 5–6 mm。用固定螺钉锁紧，并将其置于加热灯下。</li>
	<li>数分钟后，包埋块将变得柔软且易于修剪。将夹头放入体视显微镜的支架中，使用新的双刃剃须刀片平行于包埋块表面进行薄切，直至组织可见。通过斜向照射包埋块表面的光线可最佳观察：与不含组织的树脂部分相比，组织样本反光较少且呈颗粒状。可参考在加入饱和炭黑树脂前拍摄的组织样本照片，以了解组织的位置和形态。</li>
	<li>预留一个样品针 holder 专门用于修剪。该针座从不放入扫描电镜（SEM）腔室，因此可不戴手套操作，此针座称为修剪用针座。任何将要放入成像腔室的样品 holder 均不得在未戴手套的情况下触碰，以避免将油脂和油污带入显微镜腔室。</li>
	<li>将一根铝制样品针插入修剪用针座中，并稍微拧紧固定螺钉，使针的端面（平面）高出针座 3–4 mm。</li>
	<li>在针端面上制作若干深而交叉的划痕，以增大用于固定样本的胶水的接触面积。若使用铝针，建议使用小型钢制平头螺丝刀完成此步骤（图 2B）。</li>
	<li>将含有组织样本的夹头重新置于加热灯下，直至树脂变软并具有可塑性，然后将其放回体视显微镜下的夹头插槽中。</li>
	<li>使用双刃剃须刀片修剪掉含组织样本的树脂块部分的多余树脂。最终固定在针上的组织块直径约为 3 mm，高度为 2–3 mm。
	<ol>
		<li>小心地将刀片垂直插入树脂块约 1–2 mm 深，然后在同一深度水平方向小心地将刀片推入树脂块中。此操作应缓慢且谨慎进行，以免损坏或切掉含组织样本的部分。当两次切割交汇时，多余树脂将从块体上分离。持续去除树脂，直至仅剩一个 3 mm × 3 mm 的凸起区域。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>完成初步修剪后，将包埋块（仍置于夹头中）再次置于加热灯下数分钟。</li>
	<li>当树脂变软并具有可塑性后，将包埋块重新放回体视显微镜下。使用新的双刃剃须刀片，以一次平滑的切割动作，从已修剪部分下方约 1 mm 处切去树脂块顶部。应尽量获得一个平整的表面，因为该表面将用于粘接到样品针上。操作时需小心，防止样本丢失，因为此步骤需要一定力度，可能导致被切除的部分飞出。将切好并修剪过的样本暂置一旁。</li>
	<li>将装有已切割铝针的修剪用针座放入体视显微镜的插槽中。在针端面涂上一层薄薄的氰基丙烯酸酯胶水，使其完全覆盖针面但不形成可见的弯月面。用镊子夹取已修剪好的组织块，将其放置在针端面上。将组织样本居中对准样品针，轻轻压下并保持数秒。让胶水固化数分钟。</li>
	<li>待胶水完全干燥后，将修剪用针座重新置于体视显微镜下。使用细锉刀锉去多余的树脂，确保无树脂悬垂于针外。树脂形状应与圆形针头相似。</li>
	<li>在树脂块的凸起部分上定位组织，斜向照明对此步骤有帮助。使用双刃剃须刀，将含组织样本的树脂凸起部分修剪至面积不超过 1 mm2。如有可能，可将块面修剪得更小，这有助于减轻对金刚石刀的应力并延长其使用寿命。
	<ol>
		<li>尽可能去除多余树脂，使块体在一个维度上略长一些。此操作应缓慢且小心进行，因为若施力过大，含组织样本的树脂部分可能断裂脱落。虽然推荐使用刀片，但也可使用细金属锉完成此步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用细金属锉，将含组织样本的凸起区域以外的多余树脂向针边缘方向斜向锉低（图 2C）。</li>
	<li>在涂覆银漆并进行金溅射前，清除制备好的样本表面的树脂颗粒和灰尘。将银漆与丙酮混合，使其成为易于涂抹的液体，类似指甲油（但不可过稀以致从涂抹工具上滴落），然后在整个样本块表面涂上一层薄薄的银漆。丙酮挥发迅速，因此当银漆开始变稠时，可能需要补充少量丙酮。
	<ol>
		<li>涂覆银漆后，需在载入显微镜前过夜干燥。 
		&#8203;注意：银层必须足够薄，以避免使块面扩展超过 1 mm × 1 mm；尽管银漆从未损坏过金刚石刀，但仍建议使用更小的块面以延长金刚石刀的使用寿命。混合在银漆中的丙酮必须在金溅射或样本载入显微镜前完全挥发，以避免将丙酮蒸气引入成像腔室。</li>
		<li>在涂覆银漆后，对样本块表面再施加一层薄金膜。使用配备标准金箔靶的标准真空溅射装置，在 200 毫托（氩气）腔室压力和 40 毫安电流下运行 2 分钟，可获得厚度为 20 nm 的金涂层。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>完成镀膜后，将已安装并修剪好的包埋块放入带有相应实验标签的试管中。可使用一次性移液管自制专用试管。
	<ol>
		<li>在移液管球部下方切断，使球端下方保留一小段管体。将被切断的管状部分截短，并将移液管尖端适当回切，以便铝制样品针能紧密插入其中。</li>
		<li>将带有铝制样品针的一端插入经改造的移液管的球状端内。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在载入已制备的组织块前，仔细修剪掉块面表面多余的银漆。</li>
</ol>
3. 成像切面的扫描电镜设置
注意：以下成像设置基于作者所用设备生成，该设备列于提供的材料表中。尽管该设备支持可变压力成像，但在高真空条件下获得的结果最佳。
<ol>
	<li>停留时间： 连续切片时使用 12 µs/px。当确定感兴趣区域后，可采用 32 µs/px 的分辨率采集更高分辨率的图像。</li>
	<li>真空设置： 使用枪压 9e-008 Pa、柱压 1.1e-004 Pa 和腔室压力 9.5e-002 Pa。</li>
	<li>捕获时间： 使用上述设置，以每张图像50秒的速度采集2048×2048像素的图像序列。对感兴趣区域可采集更高分辨率的图像，大小为4096×4096像素，每张图像耗时略低于9分钟。</li>
	<li>切片厚度： 使用100-200 nm。更小尺寸亦可实现，但可能需要降低束电压、强度或停留时间。</li>
	<li>高电压（HV）： 使用7-12 kV。虽然提高电压可减小光斑尺寸并提高分辨率，但会增加电子束损伤的可能性。较高的kV值会增强电子束的穿透能力，导致细节丢失。然而，降低kV值会恶化信噪比（图3)14.</li>
	<li>光束强度（BI）： 作者的SBF-SEM设备提供的束流强度范围为1-20。在此范围内，束流强度值为5-7时可在避免过度充电和电子束损伤的情况下获得高质量图像。束流强度（BI）越高，分辨率越高，但发生充电和电子束损伤的风险也相应增加14.</li>
	<li>光斑尺寸与图像放大倍数： 通过光束强度和电压水平确定光斑尺寸。理想情况下，光斑尺寸不应大于所用像素尺寸。像素尺寸由视场（FOV）除以像素数量确定。例如，当视场为25 µm，图像尺寸为2048×2048像素时，每个像素对应12.2 nm。因此，光斑尺寸不应超过12.2 nm。 图4 展示了高压、束流和光斑尺寸之间的关系。</li>
	<li>工作距离（WD） -&#160;使用块面成像时，工作距离不可调节，它仅由聚焦因素决定，因此在所有成像样本块之间几乎保持一致。尽管工作距离不可调，但它对所捕获图像的分辨率具有关键影响：工作距离越小，图像的分辨率极限越高。在某些情况下，可能通过调整成像腔室内部结构来减小工作距离，但此类修改需由用户自行决定。为了减小工作距离并提高图像分辨率，我们松开了门式安装切片机的螺丝，重新定位切片机，使其在重新拧紧螺丝后比原来更靠近电子束探测器约2 mm。</li>
	<li>分辨率 - 使用上述设置，x &amp;#38; y 方向的分辨率可高达 3.8 nm。需要注意的是，分辨率受限于电子束斑尺寸以及图像采集的像素分辨率（例如，若在 2048×2048 像素的图像中采集 20 µm 视场，则像素分辨率为 9.8 nm，即使使用了 3.8 nm 的束斑尺寸）。z 平面的图像分辨率取决于切片厚度，我们发现本方案中 100–200 nm 的切片厚度效果良好。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文方法学论文的目的是重点介绍使我们实验室能够稳定获取高分辨率连续电子显微镜图像的组织制备与成像技术，并指出实现该结果的关键步骤以及在进行SBF-SEM成像过程中可能出现的潜在问题。成功应用本实验方案需要对组织进行适当的固定、将重金属充分渗透入样品、对包埋树脂进行改良以减少电荷积聚，以及充分理解所用显微镜及其成像参数设置。常言道， &#34;质量输入，质量输出&#34; 是进行SBF-SEM成像的合适原则。由于SBF-SEM的目标通常是观察或量化超微结构细节，因此必须格外重视固定策略，以确保组织不发生形变。若在样品制备过程中的任何阶段出现组织形变（例如发生肿胀、收缩或细胞形态破坏），则组织重建与定量分析将无法获得准确数据。此外，若使用不正确的成像参数，可能导致数据丢失，而由于SBF-SEM成像具有破坏性，丢失的数据无法重新获取。同时，在装载组织样品时也需格外小心，因为操作不当或样品制备仓促可能损伤精密的金刚石刀刃，导致刀刃出现缺口或断裂，进而在图像中留下明显的划痕痕迹图10C金刚石刀也可能因钙化结构、硬质颗粒或意外嵌入的玻璃（例如来自试剂安瓿瓶的玻璃）而受损。
<p c...

连续块面扫描电子显微镜（SBF-SEM）最早由Leighton于1981年提出，其设计是在扫描电子显微镜上加装内置的超薄切片机，能够对包埋在树脂中的组织进行连续切片并成像。然而，由于技术限制，该方法最初仅适用于导电样品，因为非导电样品（如生物组织）会积累严重的电荷（即电子在组织样品内部积聚）1。虽然在每次切片后对块面进行蒸发碳镀膜可减少组织充电，但这显著延长了成像采集时间，同时图像存储也存在问题，因为当时的计算机技术无法有效处理设备生成的大量数据文件。2004年，Denk和Horstmann重新采用SBF-SEM技术，并使用配备可变压力腔室的设备进行改进2。该方法允许向成像腔室内引入水蒸气，从而减少样品内部的电荷积累，使非导电样品的成像成为可能，但图像分辨率有所下降。随着样品制备和成像方法的进一步优化，目前可在高真空条件下进行成像，SBF-SEM已不再依赖水蒸气来消除电荷积累3,4,5,6,7,8,9。尽管近年来SBF-SEM的应用呈指数级增长，但正确的组织样品制备和成像参数设置对于该成像技术的成功实施至关重要。
SBF-SEM 可实现自动采集数千张连续对齐的电子显微图像，平面分辨率可小至 3–5 nm10,11。将用重金属浸渍并包埋在树脂中的组织置于配备有金刚石刀的超薄切片机的扫描电子显微镜（SEM）中。使用金刚石刀切出一个平整表面后，将刀片回缩，再用电子束以光栅扫描方式对样品块表面进行扫描，从而获得组织超微结构的图像。随后，样品块在 z 轴方向上精确抬升一定距离（例如 100 nm），这一过程称为 &#34;z-step&#34;，然后切出新的表面，再重复上述过程。通过这种方式，在组织被逐步切去的过程中生成一个三维（3D）图像块。该成像系统还受益于设备的自动化特性，可在无人值守的情况下运行，单日内即可自动采集数百张图像。
虽然SBF-SEM成像主要利用背散射电子来形成样品块表面的图像，但在成像过程中也会产生二次电子12。二次电子会与未能逸出样品块的背散射电子和入射电子束电子一起积聚，导致“组织充电”&#34;&#34;，从而在样品块表面形成局部静电场。这种电子积聚可能扭曲图像，或导致电子从样品块中被弹出，并被背散射探测器收集而成为信号的一部分，从而降低信噪比13。尽管通过降低电子束电压或强度，或缩短电子束停留时间，可以减轻组织充电程度，但这会导致信噪比下降14。当使用较低电压或强度的电子束，或电子束在每个像素区域停留的时间较短时，从组织中弹出并被电子探测器捕获的背散射电子数量减少，从而导致信号减弱。Denk和Horstmann通过向腔室内引入水蒸气来解决这一问题，从而减少腔室及样品块表面的电荷积累，但代价是图像分辨率降低。当腔室压力为10–100 Pa时，部分电子束会发生散射，增加图像噪声并导致分辨率下降；然而，这也会在样品腔室内产生离子，中和样品块内的电荷2。近年来中和样品块内电荷的方法包括在成像过程中对样品块表面进行局部氮气喷射，或对SBF-SEM载物台施加负电压，以降低探针束着陆能量并提高信号采集效率6,7,15。除了采用载物台偏压、提高腔室压力或局部注入氮气以减少样品块表面电荷积聚外，还可以通过在树脂混合物中添加碳来提高树脂的导电性，从而允许采用更激进的成像参数设置16。以下通用实验方案改编自Deerinck等人于2010年发表的方案，涵盖了我们在组织制备和成像方法方面的改进，这些改进有助于在保持高分辨率图像采集的同时最大限度地减少组织充电现象3,17,18,19。先前的方案主要关注组织处理和重金属浸润步骤，而本方案则重点介绍SBF-SEM研究中固有的成像、数据分析和三维重建工作流程。在我们的实验室中，该方案已成功且可重复地应用于多种组织类型，包括角膜及眼前段结构、眼睑、泪腺和哈德氏腺、视网膜和视神经、心脏、肺和气道、肾脏、肝脏、提睾肌以及大脑皮层/髓质，并适用于多种物种，包括小鼠、大鼠、兔、豚鼠、鱼类、单层和复层细胞培养物、猪、非人灵长类动物以及人类20,21,22,23。尽管针对特定组织和应用可能需要进行微小调整，但该通用方案在我们核心成像设施的应用中已被证明具有高度可重复性和实用性。

<table><tbody><tr><td>1/16 x 3/8 铝制铆钉</td><td>Industrial Rivet &amp; Fastener Co.</td><td>6N37RFLAP/1100</td><td>用作样品针。</td></tr><tr><td>2.5 mm 平头螺丝刀</td><td>Wiha Quality Tools</td><td>27225</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 10000</td><td>用于稀释导电银漆。</td></tr><tr><td>天冬氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8949</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>FisherScientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>导电银漆</td><td>Ted Pella</td><td>16062</td><td></td></tr><tr><td>配备标准金箔靶材的 Denton Desk-II 真空溅射仪</td><td>Denton Vacuum</td><td>N/A</td><td>这是作者使用的喷金设备，其他替代设备也可接受。</td></tr><tr><td>双刃剃刀片</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-949-411</td><td></td></tr><tr><td>Embed 812 包埋剂</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>安装在 Tescan Mira3 场发射扫描电镜中的 Gatan 3View2 系统</td><td>Gatan &amp; Tescan</td><td>N/A</td><td>这是作者使用的 SBF-SEM 设备，其他替代设备也可接受。</td></tr><tr><td>玻璃壳小瓶，0.5 dram（1.8 ml）</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72630-05</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16320</td><td></td></tr><tr><td>强力胶（Gorilla Super Glue - Impact Tough）</td><td>NA</td><td>NA</td><td>文中称为氰基丙烯酸酯胶。</td></tr><tr><td>Ketjen Black</td><td>HM Royal</td><td>EC-600JD</td><td>文中称为炭黑。</td></tr><tr><td>KOH</td><td>FisherScientific</td><td>18-605-593</td><td></td></tr><tr><td>硝酸铅</td><td>Fisher Scientific</td><td>L62-100</td><td></td></tr><tr><td>微波炉</td><td>Pelco</td><td>BioWave Pro</td><td>这是作者使用的微波设备，其他替代设备也可接受。</td></tr><tr><td>四氧化锇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201030</td><td></td></tr><tr><td>亚铁氰化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9387</td><td></td></tr><tr><td>硅胶包埋模具</td><td>Ted Pella</td><td>10504</td><td></td></tr><tr><td>二甲胂酸钠三水合物</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>12300</td><td></td></tr><tr><td>Samco 移液管</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>202</td><td>用于制作样品针储存管。</td></tr><tr><td>瑞士式针锉</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62115</td><td></td></tr><tr><td>硫代碳酰肼</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223220</td><td></td></tr><tr><td>醋酸铀酰</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>21447-25</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;重建软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amira 软件</td><td>Thermo Scientific</td><td>N/A</td><td>用于生成图 5–7 和图 9 中的重建图像。</td></tr><tr><td>Fiji（Fiji 即 ImageJ）</td><td>ImageJ.net</td><td>N/A</td><td>可向 Fiji 添加 TrakEM2 插件以辅助手动分割。</td></tr><tr><td>显微图像浏览器（MIB）</td><td>赫尔辛基大学生物技术研究所</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Reconstruct 软件</td><td>Neural Systems Lab</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>SuRVoS Workbench</td><td>Diamond Light Source &amp; 诺丁汉大学</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>SyGlass</td><td>IstoVisio, Inc.</td><td>N/A</td><td>支持在虚拟现实中进行重建以及基于直方图的重建方法。</td></tr></tbody></table>

生物组织样本的连续块面扫描电子显微镜成像（sbf-sem）

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

连续块面扫描电子显微镜（SBF-SEM）能够采集数百至数千张连续对齐的超微结构图像，为组织微解剖结构提供前所未有的三维视图。尽管近年来SBF-SEM的应用呈指数级增长，但适当的技术细节，如组织样本的制备和成像参数的选择，对该成像技术的成功至关重要。该成像系统具有高度自动化的特点，允许在无人值守的情况下运行显微镜，单日内即可自动采集数百张图像。然而，若组织制备不当，细胞超微结构可能发生改变，从而导致错误或误导性的结论。此外，图像通过扫描树脂包埋生物样本的块面生成，这一过程常带来需要特别考虑的技术挑战。成像过程中电子在样本块内积聚，即所谓的“组织充电”现象，可能导致对比度下降，难以清晰分辨细胞结构。同时，虽然提高电子束强度/电压或降低扫描速度可提升图像分辨率，但这也可能带来不利的副作用，例如损伤树脂块并导致后续图像失真。本文介绍了一种常规的生物组织样本制备方案，旨在保持细胞超微结构完整性并减少组织充电效应。同时，我们还提供了成像参数设置建议，以实现高质量连续图像的快速获取，并最大限度减少对组织块的损伤。

小鼠角膜 
该方案已广泛应用于小鼠角膜研究。通过使用SBF-SEM成像，发现成年小鼠角膜内存在一种无弹性蛋白的微原纤维束网络（EFMBs）。此前人们认为这种网络仅存在于胚胎期和出生后早期发育阶段。SBF-SEM揭示了在整个角膜中广泛分布的EFMB网络，横截面测量显示单根纤维直径为100–200 nm。此外，该EFMB网络呈分层结构排列，纤维与角膜细胞（keratocytes）密切相关，甚至位于角膜细胞表面的浅凹陷内（图5）。成年角膜中EFMB纤维的发现，进一步推动了免疫胶体金标记透射电子显微镜（TEM）、荧光及共聚焦显微技术的研究，以深入理解该网络的性质23。
进一步应用该方案后，发现了一类此前未知的中央角膜神经群体，这类神经在基质-上皮交界处与基底上皮细胞发生细胞融合（图6）。此前人们认为，在此交界处与上皮相互作用的所有神经均会穿透进入角膜上皮层，并发生分支，形成基底下神经丛...

本方案概述了一种使用连续块面扫描电子显微镜（SBF-SEM）的常规方法，SBF-SEM是一种强大的三维成像技术。SBF-SEM的成功应用依赖于适当的固定和组织染色技术，以及对成像参数的仔细设置。本方案涵盖了该过程各个阶段的实用注意事项。

生物组织样本的连续块面扫描电子显微镜成像（SBF-SEM）

连续块面扫描电子显微镜（SBF-SEM）可采集数百至数千张连续注册的超微结构图像，……

连续块面扫描电子显微镜技术为三维组织超微结构提供了前所未有的观察视角，能够解答以往无法实现或极难开展的众多科学问题。该技术可快速、可重复地生成三维数据集，同时最大限度减少组织充电效应和成像伪影。更重要的是，它能够实现每日自动采集数千幅图像。常规透射电子显微镜可提供优异的细胞超微结构图像。然而，这些图像缺乏三维背景信息，可能难以解释。连续块面扫描电子显微镜则提供了这种三维背景，有助于解析复杂的过程。尽管本方案具有可靠性和可重复性，但某些步骤需要精确操作，对本方法的成功至关重要。本视频将详细演示这些关键步骤。在用含有2.5%戊二醛和2毫摩尔氯化钙的0.1摩尔二甲胂酸钠缓冲液固定样品后，应将样品切成不超过2立方毫米的组织块，并用含有2毫摩尔氯化钙的0.1摩尔二甲胂酸钠缓冲液洗涤。然后依次用铁氰化锇、硫代碳酰肼和四氧化锇对组织进行染色。四氧化锇孵育后，在4摄氏度下用1%醋酸铀酰水溶液处理组织过夜。次日早晨，将0.066克硝酸铅溶解于10毫升0.03摩尔的天冬氨酸溶液中，并用一当量的氢氧化钾将Walton铅天冬氨酸溶液的pH值调节至5.5。将溶液在烘箱中预热后，用室温的双蒸水对组织进行五次洗涤，每次洗涤三分钟。随后将组织转移至60 °C预热的Walton铅天冬氨酸溶液中，在60 °C下孵育30分钟。孵育结束后，洗涤组织，并将其置于递增浓度的冰冻丙酮系列中进行脱水，接着在室温丙酮中孵育10分钟。然后将组织置于旋转平台上，用硬质树脂与丙酮按1:3比例混合的溶液中浸润4小时，随后在旋转平台上用树脂与丙酮按1:1比例混合的溶液中浸润8小时或过夜，最后在旋转平台上用树脂与丙酮按3:1比例混合的溶液中过夜浸润。次日早晨，在旋转平台上于室温下将组织依次浸入新鲜的100%树脂中，分别进行4至8小时、过夜以及4小时的浸透处理。次日早晨，用木棒将少量树脂与炭黑粉末混合，直至树脂被粉末饱和但仍保持流动性，且不出现颗粒状。树脂的稠度应类似于浓墨，能够缓慢滴落且无可见结块。将组织样本置于硅橡胶模具中，并拍摄图像，以记录样本在树脂块中的方位，供后续参考。将样品放置到位后，用硅胶模具尖端的碳黑饱和树脂覆盖组织，同时将标注实验信息和组织详情的标签置于模具中远离树脂的一端。随后，将模具倾斜放入65摄氏度的烘箱中，加热约一小时。当含碳黑的树脂充分固化后，从烘箱中取出模具，并从一个空孔开始，用透明树脂填充模具的剩余部分，注意确保标签仍清晰可见。当样品被透明树脂完全覆盖后，将硅胶模具放回65摄氏度的烘箱中，保持水平放置，加热48小时，然后取出模具。为准备成像用的组织块，将包埋在树脂中的样本固定于切片机的卡盘上，使锥形端露出卡盘约5至6毫米。用固定螺钉将样本锁紧，并将样本置于加热灯下。数分钟后，将样品台放入体视显微镜的固定架中，使用新的双刃剃须刀片沿组织块表面平行切去薄层，直至观察到组织；与不含组织的树脂部分相比，组织区域反光较少且颗粒感不明显。将一根铝制样品针固定在修整针夹持器上，并在其端面反复进行深度交叉划痕处理，以增大胶水粘附面积，从而更好地固定样品。将样品置于加热灯下，先用刀片垂直向下切入树脂块一至两毫米，随后进行第二次等深且与前一切口垂直的切割，以去除组织周围多余的树脂，使最终修整出的树脂块直径约为三毫米，高度为二至三毫米。完成初步修块后，再次将样品块置于加热灯下预热，然后使用新的双刃剃须刀片，在已修整部分下方约一毫米处，以一次平稳的切割动作切去树脂块的顶部。将装有已切割铝针的修块针夹放入体视显微镜的针座孔中，并在针的端面上涂抹一层薄薄的氰基丙烯酸盐胶水，确保胶水完全覆盖针面但不形成可见的弯月面。用镊子将修整好的组织块按压在样品针端面的中央位置，持续数秒钟，并让胶水静置数分钟使其充分固化。待胶水完全干燥后，找到树脂块凸起部分上的组织，使用双刃剃刀将含有组织样本的树脂凸起部分修整至不超过一平方毫米的面积。缓慢而小心地尽可能去除多余的树脂，使树脂块在一个方向上略长一些，然后使用金属锉刀将组织样本所在凸起区域外的多余树脂向针的边缘方向修成斜面。在对样品块整个表面涂覆一层薄银漆和进行金溅射之前，清除制备好的样品表面的树脂颗粒和灰尘。包埋后，修剪块面表面多余的银漆，并将安装好并修整过的组织块放入定制转移移液管的球状末端，移液管上应附有相应的标签。通过SBF-SEM成像，在成年小鼠角膜内已鉴定出一种无弹性蛋白的微原纤维束网络。该网络呈分层排列，纤维与角膜细胞密切相关，甚至位于角膜细胞表面的浅凹陷内。应用该方案已促成发现了一类此前未知的中央角膜神经群体，这些神经在基质-上皮交界处与基底上皮细胞相融合。中央角膜的SBF-SEM成像揭示了角膜缘血管、神经束及其相关细胞的存在，这些结构可进行手动分割以实现三维重建。该成像过程存在一些潜在问题，包括像素驻留时间过长，可能导致后续图像出现波浪状扭曲；块面发生微小电子放电，导致线条对比度快速变化；因刀片损坏或刀刃积聚碎屑而在块面留下刀痕；在样本仍处于成像室时，电子束长时间聚焦于块面而产生伪影；组织固定不当，导致细胞结构与结缔组织分离；以及由于组织或树脂块内电荷积聚过多而导致图像跳过。在切割组织块时，必须清楚了解组织在包埋块中的具体位置，以免意外修剪掉任何重要的样本区域。如果需要对特定的细胞结构或相互作用进行更高分辨率的成像，可以暂停成像，将样品从显微镜上取出，然后在超薄切片机上进行切片，以便在透射电子显微镜下观察。连续块面扫描电镜技术为生物组织提供了完全独特的观察视角。通过使用本方案，我们能够快速获取高质量的数据集，并拓展可研究的组织类型范围。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

生物组织样本的串行块面扫描电子显微镜 （SBF-SEM）

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来源： Mukherjee, K., et. al. 利用连续块面扫描电子显微镜分析脑线粒体。 J. Vis. Exp.

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生物电子显微镜中冷冻断裂/冷冻蚀刻的基本技术要素

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