Name: 新型人类组织特征视网膜培养技术的特征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: 了解新型人类组织特征视网膜培养技术，该技术保留视网膜、RPE-脉络膜和巩膜三层结构，维持视网膜完整性，适用于视网膜疾病建模和药物筛选研究。

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作者谨此感谢慷慨捐赠眼组织的 donors 以及新西兰国家眼库团队的支持。本研究得到了 Maurice 和 Phyllis Paykel 信托基金和奥克兰医学研究基金会（项目编号：1117015）的项目资助。IDR 的主任职位由 Buchanan 慈善基金会提供支持。CK 的奖学金由新西兰验光师协会教育与研究基金（编号：CC36812）提供，HHL 的奖学金由 Buchanan 慈善基金会提供。

人眼供体眼杯取自新西兰国家眼库，在角膜被切除用于移植后获得，并经北区B健康与残疾伦理委员会（NTX/06/19/CPD/AM07）批准。
注意：培养操作应在II级生物安全柜中进行，以确保无菌的组织培养条件。组织必须在死亡后24小时内进行培养，以避免视网膜完整性显著丧失。
<img alt="眼球解剖过程；用于解剖学研究的分步示意图；工具包括镊子、手术刀。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62046/62046fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：显示获取夹心式视网膜外植体操作步骤的图像。 用于组织块制备时，应使用一端尖锐、一端钝头的解剖剪，操作时将钝端朝向眼球内部，以减少切口过程中对组织的损伤。同时使用钝头镊子，避免在操作过程中刮伤眼内组织。使用手术剪沿角膜缘环形剪切，钝端朝向眼球内部，以去除虹膜和晶状体（A-C）。如果直接观察打开的眼杯，便可找到视神经乳头（ONH）。D）。使用钝头镊子夹住巩膜以固定眼球（E）。通过做两个向视神经乳头（ONH）方向的深切口，将眼球垂直均分为两半，但不要切断视神经乳头。沿水平子午线重复此操作（G）。用镊子夹住巩膜，轻轻将眼球撑开成三叶草形状（H-K）。使用镊子小心操作玻璃体，以抚平皱褶的视网膜，因为玻璃体会牵拉视网膜，但切勿直接接触视网膜（I）。如果玻璃体导致视网膜脱离或皱褶，请将其去除（图中未显示） 图2 由于透明的玻璃体在照片中成像不佳）。寻找视网膜平坦的区域，使用外科冲刀切取视网膜外植片（L）。用镊子夹住巩膜，将视网膜外植体小心转移至预先准备好的培养基中（M,N）。由于重量原因，整个夹心式外植体应沉入孔板底部，因此每个外植体均浸没于培养基中（O). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62046/62046fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
1. 从眼杯中分离夹心式视网膜外植体
<ol>
	<li>移除虹膜和晶状体。
	<ol>
		<li>将眼球杯放入培养皿中，使虹膜和晶状体朝上，视神经头（ONH）与培养皿接触图 2A).</li>
		<li>用镊子在角膜缘处固定住眼球杯图2B).</li>
		<li>通过在角巩膜缘外缘进行环形小切口，分离虹膜和晶状体（图 2A).</li>
		<li>小心移除虹膜和晶状体，操作过程中避免扰动视网膜。图2C). 
		注意：晶状体通过悬韧带纤维与睫状体相连，不会落入眼杯中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>压平眼杯。
	<ol>
		<li>在保持眼球杯直立的情况下，辨认视神经乳头（ONH）。使用明亮的白光光源更易于观察。图 2D).</li>
		<li>向视神经乳头（ONH）方向在四个象限处做切口（图 2E）。可旋转培养皿以方便操作。 NOT 切断视神经乳头（ONH）。</li>
		<li>小心地铺开并展平眼杯（图 2E).</li>
		<li>使用镊子夹持巩膜而非视网膜，以避免破坏视网膜完整性。 
		注意：由于溢出的玻璃体重量会牵拉视网膜，周边部视网膜脱离和皱褶无法避免。在这些区域，应清除玻璃体以防止视网膜进一步皱褶。需注意在视网膜色素上皮层-脉络膜和巩膜上方保留少量残留玻璃体，以稳定视网膜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收集夹层式视网膜外植体。
	<ol>
		<li>将外科角膜环钻置于无视网膜皱褶的视网膜区域（图2F).</li>
		<li>用力按压以穿透巩膜，应能听到破裂声。</li>
		<li>旋转环钻 180° 确保巩膜已完全穿透，从而使视网膜外植体与周围剩余组织完全分离。</li>
		<li>用镊子夹住巩膜，将夹心式视网膜外植体转移至培养基中（图 2G- I).</li>
		<li>从每个象限的周边视网膜获取2-3个夹心式视网膜外植体。 
		注意：有时视网膜-巩膜复合体可能会卡在环钻的开口中。此时可用镊子轻轻分离巩膜基底部的一小部分组织。这种情况更常发生于刀片变钝时，可能导致视网膜丢失。图 3A- C).</li>
		<li>每次切割1-2个视网膜外植体后应更换新的环钻，因为刀片容易变钝（图3C<img alt="显微镜装置中电极表面制备在导电性分析中的检测" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62046/62046fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
		图3：故障排除。 在提取过程中，视网膜外植体可能会卡在手术环钻的开口处A）。轻轻从巩膜基部剥离组织，避免接触视网膜（B）。如果使用手术环钻提取超过两个视网膜外植体，这种情况可能更常发生，因为刀片容易变钝C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62046/62046fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a></li>
	</ol>
	</li>
	<li>培养视网膜外植体。
	<ol>
		<li>制备含有Dulbecco改良Eagle培养基F-12营养混合物（DMEM-F12）和1×抗生素与抗真菌素混合液（AA，100×储存液）的培养基。</li>
		<li>在取出移植物之前，放置 500 µL 在24孔板的孔中加入培养基，并在培养箱中平衡。这一步至关重要，因为后续添加培养基可能会使视网膜组织脱落。</li>
		<li>培养夹心式视网膜外植体 37 °C 最长可在加湿的5% CO₂环境中培养72小时2 在1.4.2步骤配制的培养基中孵育。</li>
		<li>为诱导类似糖尿病视网膜病变（DR）的改变，将视网膜外植体培养于含有DMEM-F12的培养基中，并添加32.5 mM高糖（HG）联合Cyt、TNF-α（10 ng/mL）和IL-1β（10 ng/mL）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 视网膜夹心外植体的石蜡包埋
<ol>
	<li>固定夹心式视网膜外植体。
	<ol>
		<li>将夹心式视网膜外植体浸入10%甲醛溶液中，至少固定24小时。</li>
		<li>移除甲醛溶液，轻柔地将夹心式视网膜外植体转移至组织垫和包埋盒中。</li>
		<li>将夹心式视网膜外植体浸入70%乙醇中至少24小时。</li>
		<li>将视网膜外植体用石蜡包埋成组织块。</li>
		<li>使用切片机将石蜡包埋的视网膜组织切成5 µm厚的切片，并贴附于载玻片上。室温保存，直至成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脱蜡处理切片。
	<ol>
		<li>将切片浸入70%二甲苯中5分钟。</li>
		<li>将切片浸入100%二甲苯中5分钟。</li>
		<li>用70%乙醇对切片进行5分钟再水化处理。</li>
		<li>用100%乙醇对切片进行5分钟再水化处理。</li>
		<li>用流动的自来水冲洗切片10分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 使用H&amp;E染色、免疫组化和磁性Luminex检测进行表征
<ol>
	<li>苏木精-伊红（H&amp;E）染色方案
	<ol>
		<li>使用步骤 2.2 脱蜡切片。</li>
		<li>将切片在自来水中水化 5 分钟。</li>
		<li>将切片置于 Gill Ⅱ 号苏木精染液中染色 5 分钟。</li>
		<li>在流动的自来水中彻底冲洗切片，以去除多余的染液。</li>
		<li>将切片浸入 1% 酸性乙醇中两次进行分化。</li>
		<li>在流动的自来水中快速冲洗切片。</li>
		<li>将切片在 1% 碳酸锂（10 mg/mL）溶液中浸入六次，使其蓝化。</li>
		<li>在流动的自来水中彻底冲洗切片 5 分钟，以去除多余的蓝色染液。</li>
		<li>将切片在 1% 伊红溶液中浸入 10 次。</li>
		<li>在自来水中快速冲洗切片，以去除多余的染液。</li>
		<li>将切片在 100% 乙醇中浸入 10 次进行脱水，重复此步骤两次。</li>
		<li>将切片在 70% 二甲苯中浸入 10 次。</li>
		<li>将切片在 100% 二甲苯中浸入 10 次。</li>
		<li>使用邻苯二甲酸二丁酯-聚苯乙烯-二甲苯（DPX）封片剂加盖玻片封片。</li>
		<li>使用光学显微镜采集图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫组织化学（IHC）标记方案
	<ol>
		<li>使用步骤 2.2 脱蜡切片。</li>
		<li>将载玻片放入含有 10 mM 柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）和 0.05% Tween 20 的溶液中，在压力锅中于 121 °C 下自动进行抗原修复 2 分钟。</li>
		<li>用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗切片 5 分钟，重复 3 次。</li>
		<li>在室温下用含 0.1% Triton X-100 和 10% 正常山羊血清的 PBS 封闭切片 1 小时。</li>
		<li>在 4 °C 下用与二抗偶联的一抗抗体孵育切片过夜（见材料表）。</li>
		<li>用 PBS 清洗切片 5 分钟，重复 3 次。</li>
		<li>使用 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色细胞核 2 分钟。</li>
		<li>清洗并使用抗荧光淬灭试剂封片。</li>
		<li>用指甲油密封盖玻片。</li>
		<li>使用共聚焦激光扫描显微镜采集图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>磁性 Luminex 检测
	<ol>
		<li>在 24 小时和 72 小时，从每个孔中转移 75 µL 培养基至 96 孔圆底板。</li>
		<li>使用 Luminex 细胞因子检测法，在 24 小时和 72 小时后分析细胞上清液中的 IL-18、IL-6、IL-8 和血管内皮生长因子（VEGF）。按照制造商说明进行检测16。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

HORC 目前是临床前视网膜研究中最具临床转化潜力的模型。与体外细胞培养模型相比，HORC 能够更好地保留人类视网膜在体内的解剖结构，包括动态的视网膜细胞类型及其与神经元、血管系统以及细胞外环境的连接19。与动物模型相比，由于物种间存在差异（例如不同的视网膜细胞类型以及光感受器密度和比例的差异），HORC 在研究人类视网膜疾病的病理生理机制及设计药物治疗方案方面更具优势；这些物种差异可能导致动物模型中获得阳性结果，但在临床试验中却失败19。然而，在以往的 HORC 操作方案中，视网膜被有意地从 RPE-脉络膜和巩膜上分离。由于缺乏坚韧的巩膜支撑，脆弱的视网膜在操作时难以处理，若直接使用镊子夹持，可能损害视网膜完整性6,7,8,9。这一点已有证据支持：先前使用分离视网膜的研究报道，在培养 7...

视网膜是一种高度特化的ocular结构，负责将入射的光能转化为电信号，随后由大脑处理以实现视觉感知。人类视网膜包含多种动态变化的细胞类型，这些细胞在独特的层状结构中高度有序排列，形成两个突触层和三个核层1（图1）。视网膜稳态依赖于神经视网膜细胞、血管、神经、结缔组织以及视网膜色素上皮（RPE）之间复杂的相互连接1。由于视网膜结构和生理功能的高度复杂性，许多视网膜疾病的发病机制至今仍不甚清楚2,3,4,5。为了更深入地研究视网膜疾病，研究人员已开发出人眼视网膜类器官（HORC）模型6,7,8,9。与动物实验和体外培养相比，HORC模型具有优势，因其能够在原位保留动态的细胞环境和复杂的神经血管相互作用，从而为临床转化研究提供了一个良好的模型。
<img alt="视网膜结构示意图，标注各层，突出显示神经元与光感受器的排列。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62046/62046fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 1"> 
图1：人眼眼球后部结构。从眼前方向后方依次为视网膜各层：神经纤维层（NFL）、神经节细胞层（GCL）、内丛状层（IPL）、内核层（INL）、外丛状层（OPL）、外核层（ONL）、光感受器内节（IS）和光感受器外节（OS）。视网膜内的细胞包括神经节细胞（蓝色）、无长突细胞（黄色）、双极细胞（红色）、水平细胞（紫色）、视杆光感受器（粉红色）和视锥光感受器（绿色）。玻璃体位于视网膜前方。视网膜色素上皮层（RPE）、Bruch膜、脉络膜和巩膜位于视网膜后方。需注意，图中所示仅为视网膜的示意图，各层内细胞的比例及视网膜连接方式可能并不完全反映体内真实情况。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62046/62046fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
既往表征的 HORC 方案6,7,8,9 通常使用外科冲切刀将视网膜从其下方的 RPE-脉络膜和巩膜上分离。然而，由于失去了这些下层结构的支撑，透明的视网膜会变得脆弱且难以操作，镊子等工具极易破坏其完整性。此外，已有研究表明，在无 RPE 的情况下将视网膜分离进行培养，会导致节细胞凋亡和光感受器退化10,11,12。因此，开发一种可最大限度减少视网膜完整性损失并更接近体内环境的替代 HORC 方案具有重要意义。这一点在研究视网膜疾病机制时尤为关键，因为外植体操作过程中的物理损伤可能引入人为假象。因此，本研究旨在建立一种包含 RPE-脉络膜和巩膜的新型 HORC 模型，以在外植体操作和培养过程中保护视网膜的完整性。
为实现这一目标，提取了位于残留玻璃体与下方视网膜色素上皮（RPE）-脉络膜及巩膜之间的视网膜组织“三明治”样外植体。在此类三明治结构的外植体中，玻璃体对视网膜施加压力，防止视网膜脱离和折叠；而坚韧的纤维性巩膜既可作为提供结构支撑的支架，又可作为镊子操作时的着力点。此外，动物模型研究表明，在培养过程中保留RPE可防止视网膜变性及胶质细胞增生，后者是穆勒细胞对缺氧和炎症等危险信号产生的一种反应10,11,12。
为表征该模型，采用夹层法培养的视网膜外植体经苏木精-伊红（H&amp;E）染色以评估其解剖结构，并进行免疫组织化学（IHC）染色，标记末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL，凋亡细胞标志物）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP，视网膜炎症及Müller细胞活化的标志物）以及波形蛋白（vimentin，Müller细胞完整性标志物）。为确定该模型是否可被诱导产生分子水平的疾病特征，将外植体暴露于高葡萄糖（HG）环境并联合使用促炎性细胞因子（Cyt），包括白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）；该培养环境已被证实可在细胞和动物疾病模型中模拟糖尿病视网膜病变（DR）13,15,14。在DR模型中采用Luminex检测法测定培养基中释放的细胞因子。

<table><tbody><tr><td>一次性活检打孔器（5 mm）</td><td>Integra York PA Inc., USA</td><td>21909-142</td><td>本文中称为手术环钻&lt;br/&gt;</td></tr><tr><td>人重组 IL-1&amp;beta;</td><td>Peprotech, USA</td><td>200-01B</td><td>工作浓度：10 ng/mL</td></tr><tr><td>人重组&amp;nbsp; TNF-α</td><td>Peprotech, USA</td><td>300-01A</td><td>工作浓度：10 ng/mL</td></tr><tr><td>DAPI（1 &amp;micro;g/mL）</td><td>Sigma Aldrich, Germany</td><td>#D9542</td><td>细胞核染色剂，工作稀释比例为 1:1000</td></tr><tr><td>DMEM/F-12，含 GlutaMAX 添加剂</td><td>Gibco, Thermofisher, Scientific Inc., USA</td><td>10565018</td><td>含 GlutaMAX 的杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium）营养混合物 F-12，包含 1&amp;times; 抗生素和抗真菌剂混合液（AA，100&amp;times; 储存液）</td></tr><tr><td>精细剪刀——尖端一端锋利、一端钝</td><td>Fine Science Tools (F.S.T)</td><td>14028-10</td><td>尖端类型：一端锋利一端钝，刃口长度：27 mm，总长：10 cm，合金/材料：不锈钢，是否带齿：否，尖端形状：直型</td></tr><tr><td>Graefe 镊子</td><td>Fine Science Tools (F.S.T)</td><td>11050-10</td><td>长度：10 cm，尖端形状：直型，尖端类型：带齿，尖端宽度：0.8 mm，尖端尺寸：0.8 × 0.7 mm，合金/材料：不锈钢</td></tr><tr><td>小鼠单克隆 GFAP-Cy3 抗体</td><td>Sigma Aldrich, Germany</td><td>#C9205</td><td>与 Cy3 偶联的一抗，工作稀释比例为 1:1000</td></tr><tr><td>小鼠单克隆 Vimentin-Cy3 抗体</td><td>Sigma Aldrich, Germany</td><td>#C9080</td><td>与 Cy3 偶联的一抗，工作稀释比例为 1:50</td></tr><tr><td>兔多克隆 TUNEL 抗体（原位细胞死亡检测试剂盒，荧光素标记）</td><td>Sigma Aldrich, Germany</td><td>#11684795910</td><td>与荧光素-dUTP 偶联的一抗，使用酶-缓冲液溶液按 1:10 比例稀释后使用</td></tr></tbody></table>

一种新型人类类器官视网膜培养技术的表征

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

既往的人类器官型视网膜培养（HORC）模型采用的是分离的视网膜；然而，由于缺乏视网膜色素上皮-脉络膜（RPE-脉络膜）和巩膜提供的结构支持，脆弱的视网膜完整性容易受到破坏。本研究旨在建立一种新型的HORC模型，该模型包含视网膜、RPE-脉络膜和巩膜，以在培养视网膜外植体时维持视网膜的完整性。
在沿角膜缘环形剪开以去除虹膜和晶状体后，进行四次深部切口以展平眼球杯。与以往的 HORC 方案不同，本实验使用环钻不仅切割视网膜，还穿透视网膜色素上皮层-脉络膜及巩膜。所得的三层结构外植体被培养 72 小时。采用苏木精和伊红染色（H&amp;#38;E）评估组织解剖结构，并通过免疫组织化学（IHC）进一步表征视网膜外植体的细胞凋亡、Müller 细胞完整性以及视网膜炎症情况。为验证疾病诱导的可能性，将外植体暴露于高葡萄糖（HG）和促炎性细胞因子（Cyt）环境中，以模拟糖尿病视网膜病变（DR）。使用 Luminex 磁珠法检测培养基中释放的与 DR 相关的细胞因子。
H&amp;#38;E 染色显示，保留下方 RPE-脉络膜和巩膜的视网膜外植体具有明显的视网膜层状结构和致密的细胞核，而缺乏下方结构的视网膜则表现出厚度减少和严重的细胞核丢失。免疫组化结果表明，无细胞凋亡和视网膜炎症，且 Müller 细胞完整性得以保持。Luminex&#160;检测显示，与基线水平相比，暴露于高糖+细胞因子（HG + Cyt）24 小时的视网膜外植体中与糖尿病视网膜病变（DR）相关的促炎细胞因子分泌显著增加。
我们成功开发并表征了一种新型的HORC方案，在该方案中，视网膜完整性得以保持，且无细胞凋亡或视网膜炎症发生。此外，当视网膜外植体暴露于高糖加细胞因子（HG + Cyt）时，可诱导糖尿病视网膜病变（DR）相关促炎生物标志物的分泌，表明该模型可用于具有临床转化价值的视网膜疾病研究。

该 HORC 模型中视网膜结构完整性得以保留。在培养的夹心式视网膜外植体中，视网膜结构完整性得以维持，而在无邻近结构共培养的视网膜中则丧失。通过 H&amp;E 染色检测培养 72 小时后切片的夹心式视网膜外植体的结构完整性。夹心式视网膜外植体显示出良好的完整性，从神经节细胞层（GCL）到外核层（ONL）具有清晰的层状结构，且内核层（INL）和 ONL 的细胞核排列紧密（图 4A）。然而，在同一标本的边缘区域发现视网膜完整性遭到破坏，此处视网膜已从下方的视网膜色素上皮-脉络膜（RPE-choroid）及巩膜脱离，表现为视网膜厚度减小，且 INL 与 ONL 中细胞核严重丢失（图 4B）。
<img alt="视网膜层比较；组织学图像显示附着与脱离的视网膜层，显微镜下观察。" class="xfigim...

本研究旨在开发一种新型的人类类器官视网膜培养（HORC）模型，以防止在移植体操作过程中破坏视网膜的完整性。该目标通过将视网膜与其上方的玻璃体以及下方的视网膜色素&#160;上皮-脉络膜（RPE-脉络膜）和巩膜共同培养来实现。

既往的人类类器官视网膜培养（HORC）模型采用的是脱离的视网膜；然而，由于缺乏视网膜结构支撑所提供的力学支持……

该技术可原位保存所有视网膜层和细胞类型，相较于动物模型和体外模型具有更高的临床相关性。本方案的主要优势在于，它最大限度地减少了组织操作过程中对视网膜完整性的破坏，这在比较健康与病变视网膜时至关重要。通过在特定条件下培养组织，可模拟视网膜疾病。这使得新药物疗法的测试成为可能。解剖与样本采集步骤较为复杂，因此，视觉演示对于帮助读者理解书面方案并成功实施该操作至关重要。演示该实验步骤的是我实验室的二年级博士生 Charisse Kuo。准备含有杜尔贝科改良伊格尔培养基/营养混合物 F-12（DMEM/F12）以及 1 倍抗生素和抗真菌剂混合液的培养基。首先，将 500 微升培养基加入 24 孔板中，并置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳的湿化培养箱中平衡。在取出视网膜外植体之前预先准备好培养基，可避免后续添加时导致视网膜移位。提取视网膜外植体时，首先将眼杯置于培养皿中，虹膜和晶状体朝上，视神经乳头（ONH）接触培养皿底部。用镊子夹住角膜缘处以固定眼杯，并沿角膜缘外缘进行环形小切口，分离虹膜和晶状体。小心移除虹膜和晶状体，注意避免扰动视网膜。使用明亮的白光源识别视神经乳头（ONH），并从四个象限向视神经乳头方向剪开，旋转培养皿以方便操作。小心展开并压平眼杯。使用镊子夹持巩膜而非视网膜，以避免破坏视网膜的完整性。从培养箱中取出盛有已配制培养基的培养板。将外科角膜环钻置于无视网膜皱褶的区域，并用力按压以穿透巩膜，穿透时应能听到破裂声，表明已穿透培养皿底部。旋转环钻，确保巩膜已完全穿透，从而使视网膜外植体与样本其余部分分离。用镊子夹住巩膜，将夹心式视网膜外植体转移至培养基中。将收集的夹心式视网膜外植体置于37°C、含5%CO₂的加湿培养箱中培养，最长可培养72小时。苏木精和伊红染色显示，夹心式视网膜外植体保持了从神经节细胞层（GCL）到外核层（ONL）的完整结构和清晰的层状结构，内核层和外核层细胞核排列紧密。在同一标本的边缘区域，视网膜与下方的视网膜色素上皮层、脉络膜及巩膜发生脱离，视网膜完整性遭到破坏，表现为视网膜变薄以及内核层（INL）和外核层（ONL）细胞核丢失。在基础培养条件下培养的视网膜外植体中未检测到TUNEL阳性细胞核（该信号指示细胞凋亡），表明即使在培养72小时后，细胞活力仍得以维持。GFAP标记仅局限于内核层（GCL）和内丛状层（IPL），未见胶质纤维化，后者是一种病理表现，表现为GFAP表达延伸至外核层（ONL）。Vimentin从节细胞层至外核层均有高表达，表明Müller细胞结构完整性得以保持，与正常视网膜组织中所见一致。Luminex磁珠检测显示，在高糖和促炎性细胞因子条件下培养24小时后，夹心式视网膜外植体培养物中IL-18、VEGF、IL-6和IL-8水平较基线显著升高。72小时后，IL-18和VEGF水平仍显著升高，但IL-6和IL-8水平无显著差异。进行此操作时，应保留足够的残留玻璃体，以增加视网膜重量，防止其从视网膜色素上皮（RP）脉络膜脱离并在培养基中漂浮。培养的视网膜可通过免疫组织化学和组织学进一步表征，而释放到培养基中的炎症细胞因子则可采用Luminex磁珠法进行检测。与动物模型和体外模型相比，该模型在临床上更具可转化性，因此更适合用于测试新型治疗药物对视网膜疾病的有效性。

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