记录哺乳动物精子细胞质膜上的电流传导

利用膜片钳技术记录精子细胞的电活动，对于鉴定多种精子离子通道以及在分子水平上理解精子电生理学具有重要作用。该方法在测量离子通道的电生理和药理学特征方面表现优异，是鉴定离子通道最可靠的工具。鉴于离子通道和生电性转运蛋白在男性生育力中的重要生理作用，该技术是研究导致不育的某些精子缺陷的有力手段。

制备微移液管时，使用外径为1.5毫米、内径为0.86毫米且带有内丝的硼硅酸盐玻璃毛细管。在火焰抛光前，确保移液管尖端的内径约为2微米，经过适当抛光后减小至0.5微米。组装琼脂桥以保持参比电极周围环境的稳定。

在小型本生灯火焰下将玻璃毛细管弯成L形，然后使其冷却。配制1%琼脂糖的一摩尔氯化钾溶液，放入微波炉加热直至琼脂糖完全溶解，溶液变得透明。小心地将琼脂糖溶液注入L形玻璃毛细管中，避免产生气泡，然后冷却至室温。

或者，将L形玻璃毛细管浸入融化的琼脂糖中。轻轻旋转容器数次，并再次用微波炉加热至琼脂糖沸腾，以排出琼脂桥中的气泡。用剪刀打开小鼠的下腹部区域，取出两侧附睾。

将它们放入盛有预热至室温的高盐溶液（HS 溶液）的 35 毫米细胞培养皿中。将附睾转移至另一含有 HS 溶液的新细胞培养皿中，并彻底去除所有残留脂肪。使用 15 号手术刀片将附睾分离为头、体和尾三部分。

将每侧附睾的主体组织转移至新的细胞培养皿中，培养皿内含有 HS 溶液。使用尖头11号手术刀片在分离出的附睾组织上做多个切口。将带有多个切口的附睾组织部分转移至含有1.5毫升 HS 溶液的1.5毫升微量离心管中。

使用超细Dumont 5A型镊子轻轻振荡，将附睾中的精子细胞抖入溶液中。然后弃去附睾组织，将试管置于室温下静置10分钟。等待固体物质沉降至试管底部。

然后将上清液转移至另一个1.5毫升微量离心管中。使用600倍放大倍数找到带有细胞质滴的合适精子细胞。确保细胞质滴呈椭圆形，并具有略微拉长的纺锤状形态。

选择一个具有活动能力的精子，其头部附着在盖玻片上，使精子细胞部分固定，但胞质滴和鞭毛的其余部分仍能继续运动并呈现鞭毛摆动。确保精子头部与盖玻片松散连接。在显微镜下挑选出形态合适的精子细胞后，用移液管溶液填充微移液管，并将其牢固安装至移液管支架中。

为了防止移液管尖端被碎屑污染，使用U形管组件对移液管施加正压。将移液管下放并使其尖端浸入灌流液中。为了清晰观察细胞，将移液管尖端置于细胞质滴上方，使尖端开口对角朝向该液滴。

迅速将移液管尖端移向液滴，使其处于同一焦平面。一旦移液管尖端接触液滴，立即对移液管施加负压，使部分液滴进入尖端并形成千兆欧姆封接。随后将精子从盖玻片上提起。

在转换至全细胞模式之前，使用放大器的补偿模式来补偿杂散电容瞬变。通过施加持续时间为一毫秒、逐渐增加的电压脉冲并结合极轻微的负压，进行破膜并转入全细胞模式。每次施加破膜电压脉冲后，启动膜测试工具，检查是否出现更大的电容瞬变。

拟合较大电容的瞬态信号，以确定全细胞的电容及其接入电阻。成功形成穿孔后，继续进行预定的全细胞膜片钳实验，例如施加含有不同化合物的多种灌流溶液，或采用电压阶跃或电压斜坡程序测量通道活性。CatSper记录通过在膜片钳电极与哺乳动物精子细胞质滴之间建立高阻封接来完成。

采用铯全细胞记录法检测了尾段野生型神经元精子细胞和CatSper缺陷型尾段神经元精子细胞的CatSper电流密度。不同物种的精子细胞在形态和内部调控通路方面存在差异。灵长类和人类精子表现出相似的CatSper通道特性及其调控机制。

有趣的是，孕酮对CatSper的激活作用似乎仅存在于灵长类动物的精子中。猪、牛和啮齿类动物的精子均未表现出任何由孕酮刺激引起的CatSper电流变化。在牛和猪的精子中，即使基础状态下的CatSper通道活性也低于可检测水平，这表明钙离子内流及随之而来的超活化可能由其他通道或转运蛋白介导，或者其CatSper通道的激活需要不同的天然刺激物。

小而光滑、均匀且不过度肿胀的胞质滴最适合用于膜片钳技术。应避免使用那些微小、单侧、膨胀且完全透明的胞质滴，因为这些胞质滴会导致封接过弱或无法形成封接。该技术可实现对天然表达系统中特定离子通道的详细研究，其成功取决于高质量的可变精子细胞、纯净的区域、扎实的电生理学技能、耐心，以及最重要的——持之以恒。