小鼠窦房结和房室结的全组织免疫荧光染色、共聚焦成像及三维重建

本方案详细说明了在小鼠窦房结和房室结中进行整体组织免疫荧光染色及显微镜观察所需的微解剖步骤。整体组织染色方法有利于精确分析窦房结和房室结的三维定位与形态结构，并可研究其与周围组织的关系。该方法仅需最少的组织脱水和物理损伤，因而能较好地保持组织形态。

首先，使用27号针头在心尖部位刺入左心室，小心推进针头，并缓慢注入5至10毫升冰冻的磷酸盐缓冲液（PBS），以灌注心脏。用镊子轻轻提起心脏，剪断大血管以取出心脏。将心脏置于解剖皿中，皿内盛有冰冻的PBS，并置于解剖显微镜下。

确定心脏方位后，将心脏翻转，使心脏前面朝下置于培养皿底部。用细针穿过心尖和心耳并插入解剖皿底部的琼脂糖中，以固定心脏。使用精细镊子和剪刀，小心去除上腔静脉和下腔静脉周围的非心肌组织。

为了暴露腔静脉间区域，使用显微剪刀沿心室与心房之间的沟平行剪切，切除大部分心室。固定和脱水时，将样品置于4%多聚甲醛中，在4摄氏度下过夜。次日，将心脏转移至15%蔗糖溶液中，在4摄氏度下孵育24小时。

孵育后，将心脏转移至30%蔗糖溶液中，在4摄氏度下继续放置24小时。用含1%Triton X-100的PBS溶液洗涤心脏。随后在封闭液中于4摄氏度下封闭和透化过夜。

将心脏置于1.5毫升离心管中，加入用封闭液稀释的兔抗小鼠Connexin 43抗体和大鼠抗小鼠HTN4抗体，于4°C孵育七天。七天后，用移液器移除含有初级抗体的溶液。在旋转摇床上用1% Triton X-100溶液洗涤心脏，每次一小时，共洗涤三次。

在与二抗和 DAPI 孵育后，重复洗涤步骤。准备好塑料环并用橡皮泥填充后，将心脏背侧朝上放置于橡皮泥的凹槽中。确定窦房结（SAN）的位置，其位于心脏背侧的下腔静脉间区域。

加入 PBS 至心脏中，以置换心腔内的所有空气，直至心脏完全被 PBS 覆盖。将硅胶涂抹在塑料环的边缘。轻轻按压样品周围部分，将其固定于黏土中，并用盖玻片覆盖心脏。

然后轻轻按压塑料ine的背面，挤出部分PBS，并将心脏贴附于盖玻片上，注意避免成像区域内产生气泡。将整体染色样本倒置于共聚焦显微镜载物台上，按照文稿中所述进行成像。共聚焦显微镜各通道的参数通过相应软件进行设置。

本方案用于对小鼠心脏的窦房结和房室结进行共聚焦显微镜成像。通过分别针对HCN4和连接蛋白43（Connexin 43）的荧光抗体对传导系统和工作心肌进行特异性染色，可在完整解剖结构中识别窦房结和房室结。该整体染色方案使得利用多种抗体研究不同类型细胞之间的相互作用成为可能。