Name: 通过使用来自辐照的Buffy外套的饲养细胞的T淋巴细胞的分离和培养来研究主动脉瓣钙化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 30 s
Description: 了解从钙化主动脉瓣组织中分离和培养T淋巴细胞的方法，使用密度梯度离心和流式细胞术分析CD4+和CD8+亚群。该技术有助于研究适应性免疫在钙化性主动脉瓣疾病发病机制中的作用。

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本方案所使用的所有血沉棕黄层袋均由Charité Benjamin Franklin放射科的Peter Rosenthal博士、Dirk Böhmer博士及整个团队提供并进行辐照处理。本研究由德国心脏病学会（DGK）提供奖学金资助，奖学金获得者为Mary Roxana Christopher。

本研究根据夏里特医院（Charité）确保良好科研实践的章程进行，并遵守了有关隐私和伦理的法律法规。所有人体实验均获得伦理委员会批准，且依据伦理申请表中报告的规定，维护了患者的隐私和匿名性。
注意：以下方案中使用的是新鲜的人类狭窄瓣膜样本。
1. 试剂准备
<ol>
	<li>通过在RPMI 1640培养基中添加非必需氨基酸、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇和青霉素-链霉素（Pen/Strep）来制备富集型RPMI完全培养基。使用前过滤，于+4 °C保存，并在两个月内使用完毕。</li>
	<li>在克隆阶段使用富集型RPMI 1640完全培养基，并加入热灭活的胎牛血清（FBS）、HB基础培养基、50 U白细胞介素2（IL-2）和人血清（HS），配制细胞培养基（CCM）。过滤后当日使用，不得保存。</li>
	<li>在换液阶段使用富集型RPMI 1640完全培养基，并加入FBS、HB基础培养基、30 U IL-2和HS，配制细胞培养基。过滤后当日使用，不得保存。</li>
	<li>制备含有250 mL RPMI和5 mL青霉素-链霉素（Pen/Strep）的洗涤缓冲液。于+4 °C保存，两个月内使用完毕。</li>
</ol>
2. 人T淋巴细胞的分离及T-25培养瓶培养
<ol>
	<li>将狭窄瓣膜样本放入盛有洗涤缓冲液的无菌培养皿中，确保整个瓣膜样本均被液体覆盖，静置15分钟。</li>
	<li>使用解剖刀将狭窄瓣膜切成小块，再次静置10分钟。</li>
	<li>按照先前所述方法配制含50 U IL-2的细胞培养基，并进行过滤。</li>
	<li>将CCM加入T25培养瓶中，使用无菌塑料镊子将瓣膜组织块放入培养瓶内。</li>
	<li>将培养瓶垂直置于CO2培养箱中培养一周，期间需定期在显微镜下观察培养瓶状态。T细胞克隆通常在培养后约三天可见；为便于观察，建议在显微镜检查前将培养瓶水平放置20分钟。 
	&#8203;注意：细胞培养基的用量取决于样本量及所用T25培养瓶的数量。考虑到每块瓣膜组织在培养瓶中需要10 mL CCM，因此每个T25培养瓶中加入25 mL CCM可容纳3块瓣膜组织。</li>
</ol>
3. 克隆阶段
注意：进行T细胞克隆阶段时，必须按照外周血单个核细胞（PBMCs）实验方案，从经辐照的血沉棕黄层（BC）中开始分离饲养细胞。
<ol>
	<li>在超净工作台内，使用带无针阀门的袋装穿刺器打开 BC 袋&#160;将50 mL血液转移至T150培养瓶中，加入70 mL PBS稀释瓶内血液。</li>
	<li>取四个50 mL锥形管，每管中加入20 mL密度梯度介质，然后小心地将30 mL血液覆盖于其上。</li>
	<li>离心25分钟&#160;800 × g，20 °C，关闭离心刹车。</li>
	<li>小心吸除上清液，并作为废液丢弃。将PBMC环收集至新的50 ml锥形管中，加入PBS溶液至终体积50 ml。</li>
	<li>在 400 × g 和 20 °C 条件下离心 10 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，加入PBS溶液至终体积为50 mL，重悬沉淀。在400 × g、20 °C条件下离心10分钟，重复离心步骤。</li>
	<li>弃去上清液，将FCs重悬于10 mL细胞培养基中。</li>
	<li>取一个新的收集管，加入9.9 mL PBS和来自含FCs及细胞培养基管中的100 µL样本，将FCs以1:10的比例用PBS稀释。用移液器充分混匀后，从此稀释液中取出7 µL，在显微镜下进行细胞计数。</li>
	<li>准备克隆阶段的细胞培养基：将70 mL培养基加入50 U IL-2，然后分装至两个50 mL锥形管中，每管含25 mL细胞培养基，具体如下所示：
	<ul style="list-style-type: disc;">
		<li>1号管：25 mL CCM + FCs + 0.6% 植物血凝素（PHA）</li>
		<li>2号管：25 mL CCM + T淋巴细胞 
		注意：PBMCs 方法的目的是获得 2 x 106 每毫升所需细胞数，因此需相应计算所制备的25 mL CCM（试管1）。通用计算公式为：计数得到的细胞数 × 106：1 mL = CCM × 106X</li>
	</ul>
	</li>
</ol>
4. 多孔板中T淋巴细胞的培养
<ol>
	<li>使用电子移液器收集烧瓶内的所有细胞培养基，并转移至一个 50 mL 圆锥管中。空烧瓶可丢弃。</li>
	<li>在 400 × g、20 °C 条件下离心 10 分钟，使细胞沉淀。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀重悬于 50 mL PBS 中，并在 400 × g、20 °C 条件下离心 10 分钟以收集细胞。重复此步骤两次。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀重悬于 1 mL CCM 中。从此稀释液中取 7 µL，在显微镜下进行细胞计数。 
	注意：显微镜下计得的细胞数需乘以计数室体积和稀释倍数。</li>
	<li>将计数后的细胞用细胞培养基从 105 稀释至 103，然后从 103 稀释液中取 500 µL 加入 2 号管中。</li>
	<li>将 1 号管中的 25 mL 细胞培养基倒入一个 100 mm × 15 mm 的塑料培养皿中。</li>
	<li>取四个 96 孔 U 型底多孔板，使用设定为 100 µL 的多通道移液器向每孔接种 FCs。</li>
	<li>取 2 号管，将其中的细胞培养基倒入一个培养皿中。使用设定为 100 µL 的多通道移液器，向每孔接种 T 细胞。</li>
	<li>将多孔板置于 CO2 培养箱中孵育一周。</li>
</ol>
5. 首次再喂养阶段
<ol>
	<li>使用经辐照的血沉棕黄层袋，按照前述方法中的PBMCs方法获取FCs。</li>
	<li>准备适量不含PHA的CCM，并进行过滤。</li>
	<li>使用多通道移液器，从每个孔中移除100 µL液体，注意不要触碰孔底。</li>
	<li>向所有孔中加入100 µL FCs作为饲养层，以提供细胞培养所需的营养并更换培养基。 
	&#8203;注意：每个多孔板建议使用6 mL CCM，因此4个多孔板所需的推荐总量约为30 mL。每两周需向CCM中添加一次PHA（PHAs量为CCM总体积的0.4%）。</li>
</ol>
6. 第二次重新喂养阶段
<ol>
	<li>按照上述传代方法重复进行再喂养阶段，需向细胞培养基中添加0.4% PHA。</li>
</ol>
7. 第一次分种阶段：从每样本1孔变为每样本2孔
<ol>
	<li>在显微镜下检查所有四个多孔板，对含有T细胞克隆（TCCs）的孔进行传代操作。</li>
	<li>按照PBMCs操作流程，从经辐照处理的血沉棕黄层血袋中分离饲养细胞（FCs）。</li>
	<li>配制含30 U IL-2的细胞培养基。加入饲养细胞，并取一个新的U型底96孔多孔板备用。</li>
	<li>将移液器设定为100 µL，冲洗所选样本孔的内壁，并将每孔原有的200 µL体积均分至新多孔板中的两个新孔，使每个新孔的终体积为100 µL。</li>
	<li>向所有新孔中各加入100 µL饲养细胞，确保每孔总体积为200 µL。</li>
	<li>将移液器设定为100 µL，额外向两个仅含饲养细胞的孔中各加入100 µL，作为对照。 
	&#8203;注意：使用光学显微镜观察所有多孔板，以确定哪些孔中T细胞克隆（TCC）已成功生长。为便于克隆筛选，可与对照孔（仅含饲养细胞的两个孔）进行比较，克隆孔中的细胞通常比对照孔颜色更深、体积更大。应选择含有大而清晰、圆形且淋巴细胞密集聚集的克隆的孔。若在两次换液两周后仍未见T细胞克隆生长，建议再等待一周并进行一次额外的换液操作。</li>
</ol>
8. 第二轮分样：从每样本2孔到每样本4孔
<ol>
	<li>将移液器调至 100 µL，用其充分冲洗每个样本的两个孔，并为每个样本接种两个新的含 100 µL 培养基的孔。</li>
	<li>准备含有 30 U IL-2 的细胞培养基，按照 PBMCs 技术从血沉棕黄层袋中分离 FCs，并将 FCs 置入 CCM 中。</li>
	<li>将移液器调至 100 µL，将 FCs 接种至所有孔中。将多孔板置于 CO2 培养箱中培养一周。</li>
</ol>
9. 第三轮分样阶段：从每样本4孔到每样本8孔：
<ol>
	<li>使用多通道移液器吸取100 µL，冲洗每个样本的四个孔内壁，然后向新96孔板中的四个新孔每孔接种100 µL。</li>
	<li>制备细胞培养基，并按照PBMCs技术从经辐照的血沉棕黄层袋中分离FCs。</li>
	<li>将FCs放入CCM中。将移液器设定为100 µL，向所有孔中接种FCs。将多孔板置于CO2培养箱中培养一周。</li>
</ol>
10. 流式细胞术分析
<ol>
	<li>从 CO2 培养箱中取出日期最早的多孔板，并找出需分析样品编号对应的收集管。</li>
	<li>使用多通道移液器（设定体积为 200 µL，装有 2 个吸头），彻底冲洗同一样品的两个孔内，然后将液体全部转移至同一个收集管中。对所有样品重复此步骤。 
	&#8203;注意：FCs 样品不进行分析，因其仅作为对照使用。</li>
</ol>
11. 流式细胞术分析用抗体染色方案的制备
<ol>
	<li>每管加入 1 mL PBS 溶液，在 400 × g 和 20 °C 条件下离心 10 分钟。</li>
	<li>离心结束后弃去上清液。 
	注意：抗体染色组合见表 1。每种单个抗体的计算用量约为 2 µL/样本。建议在使用前短暂离心抗体管。为防止荧光素偶联抗体见光降解，所有操作步骤均需避光进行。</li>
	<li>在 1.5 mL 离心管中配制抗体混合液，并涡旋混匀。</li>
	<li>将抗体加入各样本中，避光、室温孵育 15 分钟。</li>
	<li>每份样本中加入 1 mL PBS 溶液，在 400 × g 和 20 °C 条件下离心 10 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，用 500 µL PBS 溶液重悬沉淀。</li>
	<li>进行流式细胞仪分析（FACS 分析，表 1）。 
	注意：染色后的样本可用 PBS 溶液稀释的 0.5% 多聚甲醛（PFA）固定，并可在 15 天内进行分析。 
	&#8203;警告：PFA 具有毒性，操作时需谨慎。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>标记物</td>
			<td>荧光染料</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>PE/Cy7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4</td>
			<td>Alexa Fluor 488</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8</td>
			<td>Brilliant violet 510</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14</td>
			<td>Brilliant violet 421</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25</td>
			<td>PE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45</td>
			<td>Brilliant violet 711</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 用于检测钙化性主动脉瓣疾病中T淋巴细胞群体的抗体染色组合。

<ol><li>Nkomo, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+valvular+heart+diseases%3A+a+population-based+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Burden of valvular heart diseases: a population-based study.</a> Lancet. 368 (9540), 1005-1011 (2006).</li>
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<li>Lauten, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAVI+for+low-flow%2C+low-gradient+severe+aortic+stenosis+with+preserved+or+reduced+ejection+fraction%3A+a+subgroup+analysis+from+the+German+Aortic+Valve+Registry+%28GARY%29%5BTitle%5D)+AND+%22Euro+Intervention+Journal%22%5BJournal%5D)">TAVI for low-flow, low-gradient severe aortic stenosis with preserved or reduced ejection fraction: a subgroup analysis from the German Aortic Valve Registry (GARY).</a> Euro Intervention Journal. 10 (7), 850-859 (2014).</li>
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<li>Wernly, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcatheter+valve-in-valve+implantation+%28VinV-TAVR%29+for+failed+surgical+aortic+bioprosthetic+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Transcatheter valve-in-valve implantation (VinV-TAVR) for failed surgical aortic bioprosthetic valves.</a> Clinical Research in Cardiology. 108 (1), 83-92 (2019).</li>
<li>Mathieu, P., Bouchareb, R., Boulanger, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+and+Adaptive+Immunity+in+Calcific+Aortic+Valve+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Innate and Adaptive Immunity in Calcific Aortic Valve Disease.</a> Journal of Immunology Research. 2015, 851945(2015).</li>
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<li>Delso-Vallejo, M., Kollet, J., Koehl, U., Huppert, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Irradiated+Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells+on+Both+Ex+Vivo+Proliferation+of+Human+Natural+Killer+Cells+and+Change+in+Cellular+Property%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Influence of Irradiated Peripheral Blood Mononuclear Cells on Both Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells and Change in Cellular Property.</a> Frontiers in Immunology. 8, 854(2017).</li>
<li>Amedei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mimicry+between+Helicobacter+pylori+antigens+and+H%2B%2C+K%2B+--adenosine+triphosphatase+in+human+gastric+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Molecular mimicry between Helicobacter pylori antigens and H+, K+ --adenosine triphosphatase in human gastric autoimmunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 198 (8), 1147-1156 (2003).</li>
<li>Lienhardt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+tuberculosis+in+Africa+is+associated+with+reduced+Th1+and+increased+Th2+activity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Active tuberculosis in Africa is associated with reduced Th1 and increased Th2 activity in vivo.</a> European Journal of Immunology. 32 (6), 1605-1613 (2002).</li>
<li>Benagiano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydophila+pneumoniae+phospholipase+D+%28CpPLD%29+drives+Th17+inflammation+in+human+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chlamydophila pneumoniae phospholipase D (CpPLD) drives Th17 inflammation in human atherosclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1222-1227 (2012).</li>
<li>Benagiano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+60-kDa+heat+shock+protein+is+a+target+autoantigen+of+T+cells+derived+from+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human 60-kDa heat shock protein is a target autoantigen of T cells derived from atherosclerotic plaques.</a> Journal of Immunology. 174 (10), 6509-6517 (2005).</li>
<li>Benagiano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+helper+type+1+lymphocytes+drive+inflammation+in+human+atherosclerotic+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Procceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">T helper type 1 lymphocytes drive inflammation in human atherosclerotic lesions.</a> Procceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6658-6663 (2003).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种利用流式细胞术对从狭窄的主动脉瓣样本中分离出的T淋巴细胞亚群进行表征的方法。该方法需要使用经辐照的血沉棕黄层（buffy coat）来分离外周血单个核细胞（PBMCs）。血沉棕黄层袋必须接受9000 Rad/90 Gray (Gy) 的辐射剂量，这是阻止饲养细胞增殖的关键步骤。来自血沉棕黄层袋的细胞仅作为饲养细胞，为从瓣膜中分离出的T细胞提供营养支持。若使用未经辐照的血沉棕黄层袋，则会促进PBMCs在培养中的增殖，这一点在以往研究中已有报道25。当辐射剂量低于90 Gy时，也观察到PBMCs在培养中发生增殖，因此我们建议必须使用恰好90 Gy的辐射剂量。值得注意的是，建议在辐照当天或最迟次日使用辐照后的血沉棕黄层，并将其置于持续振荡的装置中保存。该方法的另一个关键步骤可能是淋巴细胞克隆阶段，该阶段可能受到人为因素的影响；为避免此类情况，我们对新鲜的主动脉瓣样本进行FACS分析。T淋巴细胞的克隆步骤相较于仅分析一份新鲜样本，能够获得更多的T细胞克隆（平均每瓣膜可获得约15个T细胞克隆），从而更有利于进行表型和功能分析。本研究团队已多年应用该克隆技术，且根据所分析组织类型的不同，...

主动脉瓣钙化性疾病（CAVD）是最常见的心脏瓣膜疾病之一，对医疗保健系统造成重大影响。近年来，主动脉瓣置换术的实施频率急剧上升，且随着老年人口的持续增长，预计未来还将进一步增加1。
CAVD 的潜在病理生理学机制尚未完全明确，目前的治疗策略仅限于保守治疗或通过外科手术或经皮手术进行主动脉瓣置换。迄今为止，尚无有效的药物治疗方法能够阻止或逆转 CAVD 的进展，且早期出现症状的患者死亡率较高，除非实施主动脉瓣置换术（AVR）2。在重度有症状主动脉瓣狭窄患者中，报道的3年无症状生存率低至20%3。经导管主动脉瓣置换术（TAVR）作为一种新兴治疗选择，彻底改变了高风险患者（尤其是老年患者）的治疗格局，并显著降低了该人群原本较高的死亡率4,5,6。尽管 TAVR 取得了令人鼓舞的成果，但仍需进一步研究以阐明 CAVD 的病理生理机制，从而识别新的早期治疗靶点7,8,9。
既往认为是一种被动的退行性过程，主动脉瓣钙化病（CAVD）如今被认识到是一种主动进展性疾病，其特征是主动脉瓣间质细胞发生成骨细胞样表型转换10。该疾病涉及主动脉瓣叶的进行性钙化、纤维钙化改变以及活动能力下降（硬化），最终导致血流受阻，引起主动脉瓣开口狭窄11。
炎症被认为是钙化性主动脉瓣疾病（CAVD）病理生理学中的关键过程，类似于血管动脉粥样硬化的过程。内皮损伤导致脂质成分的沉积和积聚，尤其是在主动脉瓣中氧化脂蛋白的沉积12。这些氧化脂蛋白具有细胞毒性，可引发炎症反应，而炎症活动进一步导致钙化。先天性和适应性免疫在CAVD发生及疾病进展中的作用近年来受到关注13。在CAVD患者以及钙化主动脉瓣叶中，已观察到特定记忆T细胞亚群的活化和克隆扩增，因此推测炎症过程至少参与了CAVD的发生，也可能参与疾病的进展14。事实上，尽管抗原呈递细胞和巨噬细胞在健康和病变瓣膜中均存在，但T淋巴细胞的存在通常提示主动脉瓣已老化并发生病变。这种淋巴细胞浸润，伴随新生血管形成增加和化生现象，是CAVD典型的组织学特征15。
我们推测主动脉瓣间质细胞与免疫系统的活化之间存在相互作用，这种相互作用可能触发主动脉瓣内慢性炎症过程的启动。检测狭窄性主动脉瓣组织中的T细胞可能是阐明其在钙化发展过程中作用的有效方法，因为这能够较为真实地反映体内主动脉瓣细胞的状态。在本研究中，我们利用主动脉瓣组织分离T淋巴细胞，对其进行培养和克隆，并随后通过荧光激活细胞分选技术（FACS）对其进行表征。新鲜的主动脉瓣样本取自因重度主动脉瓣狭窄而接受外科瓣膜置换术的CAVD患者。手术切除后，将新鲜瓣膜样本切成小块，随后培养T细胞，进行克隆，并通过流式细胞术进行分析。染色步骤简便，染色后的样本管可用0.5%多聚甲醛固定，并在15天内完成检测。通过该染色方案获得的数据可用于追踪干预措施下T淋巴细胞分布随时间的变化情况，并可进一步拓展用于评估特定T细胞亚群的活化状态。
由于存在自发荧光等问题，钙化组织的提取、从钙化组织中分离白细胞，尤其是对该类组织进行流式细胞术分析均具有较大挑战性。目前针对这一特定目的的实验方案在文献中极为少见16,17,18。本文介绍了一种专门用于直接从人主动脉瓣样本中分离和培养T淋巴细胞的实验方案。淋巴细胞的克隆扩增是适应性免疫的典型特征，体外研究该过程可深入揭示淋巴细胞异质性的水平19。经过三周的培养后，各克隆已获得足够数量的T细胞，可用于表型和功能研究，此时T细胞克隆已具备传代条件。随后通过流式细胞术对T细胞克隆的表型进行分析。
本免疫学实验方案改编自 Amedei 等人先前建立的人体组织中T细胞分离与表征方法，特别适用于钙化的人体组织，例如钙化性主动脉瓣疾病（CAVD）20,21,22。本文所述利用辐照过的血沉棕黄层（buffy coat）分离外周血单个核细胞（PBMCs）的方案，提供了一种高效获取饲养细胞（FC）的方法，专为从瓣膜间质细胞中分离的T淋巴细胞克隆阶段而优化。饲养层由生长停滞但仍具有活力和生物活性的细胞组成。饲养细胞在支持从瓣膜间质细胞中分离的T淋巴细胞体外存活与增殖方面发挥着重要作用23。为防止饲养细胞在培养过程中增殖，必须使其进入生长停滞状态。该目的可通过两种方式实现：物理方法（如辐照）或使用细胞毒性化学试剂处理，例如丝裂霉素C（MMC）——一种可直接应用于培养表面的抗肿瘤抗生素24。本文展示的是通过细胞辐照实现饲养细胞生长停滞的方法。
该方法提供了一种高效且经济的方式，用于从主动脉瓣组织中分离和表征T细胞，有助于拓宽探索钙化性主动脉瓣疾病（CAVD）病理生理学的免疫学方法范围。

<table><tbody><tr><td>50 mL 塑料注射器</td><td>Fisherbrand</td><td>9000701</td><td></td></tr><tr><td>96孔U型底多孔板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>10638441</td><td></td></tr><tr><td>袋装穿刺器（无针）</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>用 PBS 稀释至 4%</td></tr><tr><td>CD14 Brilliant Violet 421</td><td>&amp;nbsp;Biolegend</td><td>560349</td><td></td></tr><tr><td>CD25 PE</td><td>&amp;nbsp;Biolegend</td><td>302621</td><td></td></tr><tr><td>CD3 PE/Cy7</td><td>&amp;nbsp;Biolegend</td><td>300316</td><td></td></tr><tr><td>CD4 Alexa Fluor 488</td><td>&amp;nbsp;Biolegend</td><td>317419</td><td></td></tr><tr><td>CD45 Brilliant Violet 711</td><td>&amp;nbsp;Biolegend</td><td>304137</td><td></td></tr><tr><td>CD8 Brilliant Violet 510</td><td>&amp;nbsp;Biolegend</td><td>301047</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf管 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>13094697</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf管 0.5 mL</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AB0533</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL 圆锥形离心管</td><td>Falcon</td><td>10136120</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL 圆锥形离心管</td><td>Falcon</td><td>10788561</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 圆底聚苯乙烯管</td><td>BD</td><td>2300E</td><td></td></tr><tr><td>快速读取102塑料计数室</td><td>KOVA 国际</td><td>630-1893</td><td></td></tr><tr><td>250 mL 培养基滤器</td><td>NalgeneThermo Fisher Scientific</td><td>168-0045</td><td></td></tr><tr><td>500 mL 培养基滤器</td><td>NalgeneThermo Fisher Scientific</td><td>166-0045</td><td></td></tr><tr><td>HB 101 冻干补充剂</td><td>Irvine Scientific</td><td>T151</td><td></td></tr><tr><td>HB基础培养基</td><td>Irvine Scientific</td><td>T000</td><td></td></tr><tr><td>热灭活胎牛血清（Fetal Bovine Serum）</td><td>Euroclone</td><td>ECS0180L</td><td></td></tr><tr><td>人血清（HS）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3667</td><td></td></tr><tr><td>人IL-2 IS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-744</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Falcon</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸溶液</td><td>Sigma</td><td>11082132001</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10538931</td><td></td></tr><tr><td>PBS（磷酸盐缓冲液）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td>10000 U/mL</td></tr><tr><td>PHA（植物血凝素）</td><td>干细胞技术</td><td>7811</td><td></td></tr><tr><td>塑料培养皿</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>R80115TS</td><td>10 mm × 15 mm</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>HyClone</td><td>15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Gibco（生命技术公司）</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>0.45 微米注射器滤器&amp;micro;l</td><td>Rotilabo 注射器滤器</td><td>P667.1</td><td></td></tr><tr><td>T-25 细胞培养瓶</td><td>InvitrogenThermo Fisher Scientific</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>T-75 细胞培养瓶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10232771</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;- 巯基乙醇</td><td>Gibco</td><td>A2916801</td><td></td></tr></tbody></table>

通过使用辐照后的血沉棕黄层来源的饲养细胞分离和培养t淋巴细胞研究主动脉瓣钙化

t淋巴细胞，血沉棕黄层，主动脉瓣钙化，细胞培养，饲养细胞，免疫细胞分离

Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat

主动脉瓣钙化性疾病（CAVD）是一种主动脉瓣从轻度增厚到重度钙化的进行性疾病，尽管已有经导管主动脉瓣置换术（TAVR）等新的治疗手段，该病仍与高死亡率相关。
从瓣膜钙化开始并最终导致重度主动脉瓣狭窄的完整通路目前仍未完全阐明。通过在体外紧密模拟主动脉瓣细胞在体内的状态，对狭窄瓣膜组织中的T淋巴细胞进行检测可能是明确其在钙化发展过程中作用的有效方法。手术切除后，将新鲜的主动脉瓣样本切成小块，分离T淋巴细胞进行培养、克隆，并利用荧光激活细胞分选技术（FACS）进行分析。
染色步骤简单，染色后的样本管还可使用0.5%多聚甲醛固定，并可在15天内进行后续分析。通过该染色方案获得的结果可用于追踪T细胞浓度随干预措施发生的时间依赖性变化，并可进一步拓展以评估特定T细胞亚群的活化状态。在本研究中，我们展示了从新鲜的钙化主动脉瓣样本中分离T细胞的过程，并利用流式细胞术分析T细胞克隆的步骤，以进一步阐明适应性免疫在钙化性主动脉瓣疾病（CAVD）病理生理学中的作用。

我们采用一种简单且经济有效的方法，对来自严重主动脉瓣狭窄患者的新鲜主动脉瓣样本中的白细胞群体进行表征（参见实验方案）。分离外周血单个核细胞（PBMCs）的方法是获得饲养细胞的关键步骤，这些饲养细胞在实验的每个阶段（克隆、换液和传代阶段）均被使用，并可用于检测和表征主动脉瓣样本中浸润的白细胞。该方法的关键步骤如图1所示。
<img alt="显示样品管、组分分离和细胞培养结果的离心过程示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62059/62059fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1．从血沉棕黄层中分离FCs。（A）血液覆盖于密度梯度介质上（B）离心后获得的白细...

本研究中，我们描述了从钙化主动脉瓣新鲜样本中分离T淋巴细胞的过程，以及利用流式细胞术分析对T细胞克隆进行分析的步骤，以表征适应性白细胞亚群。

通过使用辐照后的血沉棕黄层来源的饲养细胞分离和培养T淋巴细胞研究主动脉瓣钙化

T淋巴细胞，血沉棕黄层，主动脉瓣钙化，细胞培养，饲养细胞，免疫细胞分离

主动脉瓣钙化性疾病（CAVD）是一种进行性疾病，其病程从瓣膜轻度增厚至重度钙化不等，与高...

该方案易于操作。克隆阶段可从新鲜样品中获得较大量的T克隆。此外，T细胞的表型和功能可轻松进行分析。演示该实验步骤的是来自我实验室的博士生 Mary Christopher。为诱导T细胞克隆，需在超净工作台中使用带无针阀的采血袋刺针打开经辐照处理的血沉棕黄层采血袋。将最多50毫升血液从采血袋转移至T-150培养瓶中，并向培养瓶中加入70毫升磷酸盐缓冲液（PBS）。在四个50毫升的锥形管中，每个管内小心地将30毫升稀释后的血液叠加到20毫升密度梯度液上，通过密度梯度离心法分离细胞。小心吸除上清液，将每管中的外周血单个核细胞（PBMC）转移至一个全新的50毫升离心管中。用磷酸盐缓冲液（PBS）定容至50毫升，离心收集PBMC。在相同条件下进行第二次洗涤后，将分离的饲养细胞悬浮于10毫升细胞培养基中用于计数，并在两个50毫升离心管中各加入25毫升含50单位IL-2溶液的70毫升细胞培养基。然后，将饲养细胞以每毫升含IL-2的细胞培养基中加入2×10⁶个细胞的浓度加入其中一个离心管中。为建立T淋巴细胞培养，将来自狭窄瓣膜样本烧瓶的含T细胞克隆的上清液汇集至一个单独的50毫升离心管中，并通过离心收集细胞。将沉淀用50毫升PBS洗涤三次，每次洗涤后将细胞重悬于1毫升细胞培养基中进行计数。将细胞稀释至每毫升1×10³个细胞的浓度，并将500微升细胞悬液加入含有IL-2但不含饲养细胞的细胞培养基管中。将饲养细胞悬液加入一个塑料的100×15毫米培养皿中，并将100微升饲养细胞悬液加入实验所需数量的U型底96孔板的每一孔中。然后将T细胞加入培养皿中，每孔添加100 µL T细胞至含有饲养细胞的孔中，在细胞培养孵育箱中孵育一周。PBMC的分离对于获得饲养细胞以及检测和表征主动脉瓣样本中浸润的白细胞至关重要。经过两周的孵育后，可获得克隆的T细胞群体。此处展示了用于分析钙化性主动脉瓣疾病患者T细胞亚群的设门方案。如该患者所示，CD4+ T细胞数量多于CD8+ T细胞。对未克隆T细胞的流式细胞术分析证实，天然瓣膜样本与克隆样本中均存在相同的T细胞标志物。综合来看，这些数据表明，在钙化性主动脉瓣中存在带有 CD45+ 白细胞的 T 细胞，提示钙化性主动脉瓣疾病与免疫系统的激活及炎症活动相关。该方法具有很高的通用性，可适用于多种实验方案，使研究人员能够从组织中分离细胞以进行功能表征。请注意，必须在无菌条件下操作以避免污染，并在显微镜下仔细观察细胞。

investigating-aortic-valve-calcification-via-isolation-culture-t

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

通过使用来自辐照的Buffy外套的饲养细胞的T淋巴细胞的分离和培养来研究主动脉瓣钙化

我们提供一种分离和培养纯化心脏瓣膜内皮细胞（VEC）群体的方法。VEC...

瓣膜内皮细胞的分离

本文介绍了一种基于流式细胞术的方法，用于研究主动脉的免疫细胞组成。同时，本文还展示了一种额外的技术，可分别检测周围外膜和血管壁。该方法为开展主动脉白细胞的表型分析以及在动脉粥样硬化研究中应用多种免疫学检测手段提供了可能。...

小鼠主动脉内免疫细胞的流式细胞术分析

在本视频中，我们展示了使用两步胶原酶法从小鼠心脏中分离主动脉瓣间质细胞，并在少量生长培养基中进行后续培养的方法。...

小鼠瓣膜间质细胞的分离：一种从鼠主动脉瓣分离和培养VIC的酶消化法

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用于测量主动脉瓣间质细胞钙浓度的钙化检测实验

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血管平滑肌细胞钙化及主动脉钙化与炎症成像

本文提供了通过胞内染色和流式细胞术鉴定和定量小鼠肾脏、主动脉及淋巴结中功能性T淋巴细胞亚群的详细方法。以血管紧张素II诱导的高血压模型为例，逐步阐述流式细胞术和胞内染色的技术流程与基本原理。...

通过细胞内染色和流式细胞术鉴定高血压模型小鼠主动脉、肾脏及淋巴结中的淋巴细胞亚群

本方案描述了大鼠来源的心瓣膜间质细胞的分离、培养及钙化过程，具有高度的生理相关性 体外...

分离与表征原代大鼠瓣膜间质细胞：研究主动脉瓣钙化的新模型

本文描述了通过两步胶原酶法分离小鼠主动脉瓣膜细胞的过程。分离的小鼠瓣膜细胞对于开展多种实验分析至关重要，例如此项研究中的分析 体外...

分离小鼠主动脉瓣间质细胞以研究主动脉瓣钙化 体外

本方案描述了在手术主动脉瓣置换术过程中或从尸体组织中获取人类主动脉瓣，并随后分离、扩增和鉴定患者特异性的原代瓣膜内皮细胞和间质细胞的方法。文中包含了确保细胞活力和表型特异性的关键操作步骤细节。...

用于体外疾病建模的人原代瓣膜细胞分离

本文介绍了通过分离小鼠主动脉并提取钙化细胞外囊泡以观察其矿化潜能，从而获取和评估血管钙化的方法学。...

利用细胞外囊泡介导的血管钙化分析 体外 和 在体 内 模型

了解从钙化主动脉瓣组织中分离和培养T淋巴细胞的方法，使用密度梯度离心和流式细胞术分析CD4+和CD8+亚群。该技术有助于研究适应性免疫在钙化性主动脉瓣疾病发病机制中的作用。

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