Name: 使用免疫RNA-荧光原位杂交对SARS-CoV-2进行可视化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 23 s
Description: 学习使用免疫RNA-荧光原位杂交技术可视化SARS-CoV-2病毒RNA，在Vero细胞系和三维人呼吸道上皮培养物中实现单细胞分辨率检测。该方法具有高特异性和灵敏度，适用于病毒发病机制研究和诊断应用。

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本工作得到了科学与高等教育部对SARS-CoV-2研究的支持，以及国家科学中心资助项目（资助号 UMO2017/27/B/NZ6/02488 致 K.P.，资助号 UMO-2018/30/E/NZ1/00874 致 A.K.-P.）的支持。

1. 缓冲液的配制
<ol>
	<li>配制500 mL 2×PHEM缓冲液，加入18.14 g哌嗪-N,N′-二(2-乙烷磺酸) (PIPES)、6.5 g 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸 (HEPES)、3.8 g 乙二醇四乙酸 (EGTA) 和 0.99 g 硫酸镁 (MgSO₄)4）。用蒸馏水（dH₂O）定容至约 400 mL2O），搅拌，并使用10 M氢氧化钾（KOH）或氢氧化钠（NaOH）调节pH至7.0。定容至500 mL，分装为每份50 mL。如需使用，于-20 °C保存。 
	注意：缓冲液在 pH 达到 7.0 之前不会变澄清。</li>
	<li>配制37% w/v的多聚甲醛（PFA）储备液。配制50 mL时，称取18.5 g PFA，加入35 mL去离子水2O 置于玻璃瓶中。将瓶子放在带加热的磁力搅拌器上，加入 900 µL 1 M KOH 或 NaOH，搅拌至溶液澄清。冷却后转移至 50 mL 锥形离心管中，用 dH₂O 定容至 50 mL。2O. 该溶液可保存在 -20 °C，直至使用时。 
	注意：甲醛应在通风橱中操作，并佩戴防护手套和实验服。</li>
	<li>配制固定液（3.7% PFA，以PHEM缓冲）。配制50 mL时，混合5 mL 37% PFA溶液、25 mL 2× PHEM缓冲液和20 mL dH₂O。2在50 mL锥形离心管中。于-20 °C保存，待用。 
	注意：缓冲液解冻后可在 4 °C 保存最多 3 个月。</li>
	<li>配制 PBST（含 0.1% Tween-20 的 1×磷酸盐缓冲液 [PBS]）。取 50 µL 100% Tween-20 加入 50 mL 1× PBS 中，充分混匀。 
	注意：该溶液可在室温（RT）下保存。</li>
	<li>通过将甲醇与PBST按3:1、1:1和1:3的比例混合，配制复水化缓冲液（每种终体积为100 mL；参见 表1). 
	注意：甲醇（MeOH）具有很强的毒性和易燃性。由于其可损伤视神经，操作时应在通风橱中进行，并避免接触明火。由于MeOH与PBST混合会产生放热反应，因此应在冰上混合溶液。</li>
	<li>配制 1000 mL 20× SSC 溶液：将 175.3 g 氯化钠（NaCl）和 88.2 g 柠檬酸钠置于烧杯中，加入 800 mL 去离子水（dH₂O）溶解2O. 搅拌至溶解，用 NaOH 调节 pH 至 7.2。加入 dH₂O2加水至总体积1000 mL，然后通过0.22 µm滤膜过滤或高压灭菌，收集于已灭菌的瓶中。</li>
	<li>对于50 mL的5x SSCT，将12.5 mL的20x SSC缓冲液与37.5 mL的dH₂O混合。2加入50 µL 100% Tween-20，充分混匀。</li>
	<li>对于50 mL的50% 5x SSCT/50% PBST，将25 mL 5x SSCT与25 mL PBST混合。</li>
	<li>配制50 mL 2x SSC，将5 mL 10x SSC缓冲液与45 mL dH₂O混合。2O. 充分混匀。 
	&#8203;注意：所有 SSC 缓冲液均应避光保存于室温。</li>
</ol>
2. 靶标定义、探针和扩增子
<ol>
	<li>利用生产商网站上提供的工具设计扩增子和探针。确保探针与SARS-CoV-2 N基因的反向DNA链互补（补充图1）。</li>
	<li>确定最佳探针集合大小（一组20个探针足以实现可视化）。</li>
	<li>设置用于目标RNA检测的扩增器。
	<ol>
		<li>使用标记Alexa Fluor 647的HCR扩增器B1。 
		注意：HCR扩增器包含亚稳态的HCR发夹结构h1和h2。可利用本方案设计多重实验。若计划进行多重实验，应为同一样本中需成像的不同目标RNA选择不同的HCR扩增器（B1、B2、…）（例如，目标1使用扩增器B1，目标2使用扩增器B2，…）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 细胞培养及SARS-CoV-2感染
<ol>
	<li>在含有 5% 胎牛血清的杜尔贝科改良伊格尔培养基中培养 Vero（猴肾上皮细胞）细胞。
	<ol>
		<li>将 50,000 个细胞接种到 12 孔板中的盖玻片（No. 1，15 × 15 mm）上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照文献18所述方法，在可渗透的 Transwell 小室支撑体（膜直径 = 6.5 mm）上制备完全分化的 HAE 培养物，并在支气管上皮生长培养基中培养至完全汇合。</li>
	<li>病毒感染
	<ol>
		<li>以每毫升 1000 倍半数组织培养感染剂量（TCID50）的 SARS-CoV-2 接种细胞</li>
		<li>在 37 °C 下孵育 2 小时。</li>
		<li>用 PBS 洗涤细胞两次，以去除未结合的病毒。</li>
		<li>继续培养细胞 48 小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 在盖玻片上培养的Vero细胞中进行SARS-CoV-2 RNA-FISH
第1天
<ol>
	<li>固定与透化细胞
	<ol>
		<li>在室温下用3.7%（w/v）PFA溶液固定感染细胞1小时。</li>
		<li>吸去3.7% PFA溶液，用1x PBS洗涤细胞两次。</li>
		<li>用 PBST 溶液在室温下振荡孵育细胞 10 分钟以进行透化处理。</li>
		<li>吸去 PBST，并用 1×PBS 洗涤细胞两次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检测
	<ol>
		<li>吸去1x PBS溶液，再于室温下用2x SSC洗涤细胞两次。</li>
		<li>吸弃2x SSC溶液，加入至少300 µL探针杂交缓冲液进行预杂交。覆盖含细胞的孔，于37 °C孵育30分钟。</li>
		<li>将1.2 pmol探针混合物加入探针杂交缓冲液中，配制探针溶液。
		<ol>
			<li>使用1.2 µL的1 µM探针原液配制300 µL工作液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>移除预杂交溶液，并将盖玻片转移至湿盒中。
		<ol>
			<li>在 Parafilm 上用移液器滴加 30–50 µL 探针溶液，形成独立液滴。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在37 °C下孵育样品过夜（12–18 h）。 
		 
		第2天</li>
		<li>将盖玻片重新放入12孔板中，在37 °C下用400 µL探针洗涤缓冲液洗涤4次，每次5分钟，以去除多余的探针溶液。 
		&#8203;注意：作为将30–50 µl试剂量取至石蜡膜上并加盖盖玻片进行孵育的替代方法，可直接将300 µl探针溶液加入12孔板中的盖玻片上。该方法操作更简便，但需要较多试剂。使用前将探针洗涤缓冲液加热至37 °C。计算所需缓冲液体积，并转移至15 mL锥形离心管中。</li>
		<li>室温下用5x SSCT洗涤样品，每次5分钟，共洗两次。</li>
		<li>用1x PBS替换5x SSCT溶液，将样本在4 °C保存至扩增前。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>扩增
	<ol>
		<li>吸出孔中的1×PBS溶液，每孔加入至少300 µL扩增缓冲液。室温孵育30分钟。</li>
		<li>通过在不同离心管中对所需体积的HCR发夹结构（h1和h2）进行快速冷却来制备每种发夹。
		<ol>
			<li>配制300 µL扩增溶液时，每种发夹结构使用18 pmol（例如，对于300 µL体系，使用6 µL浓度为3 µM的发夹储备液）。</li>
			<li>将发夹溶液转移至离心管中。</li>
			<li>95 °C 下孵育 90 秒。</li>
			<li>在避光条件下室温冷却30分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过加入瞬时冷却的样品来制备发夹结构混合物 &#34;h1&#34; 和 &#34;h2&#34; 将发夹结构加入扩增缓冲液中。</li>
		<li>将 30–50 µL 发夹结构混合液滴加到 Parafilm 上。</li>
		<li>在室温下避光孵育样品过夜（12–18 小时）。 
		 
		第3天</li>
		<li>将盖玻片放回12孔板中，在室温下用5x SSCT振荡洗涤5次，每次5分钟，以去除多余的发夹结构。</li>
		<li>吸去5x SSCT缓冲液，替换为1x PBS。 
		注意：如有需要，可将RNA-FISH样本用于标准的免疫荧光检测，随后对细胞核进行染色（见第5节）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞核染色与玻片封片
	<ol>
		<li>吸去1×PBS溶液，加入含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，0.2 µg/mL）的1×PBS溶液。</li>
		<li>在室温避光条件下孵育样品10分钟。</li>
		<li>吸去 DAPI 溶液，用 1x PBS 洗涤细胞两次。</li>
		<li>滴加两滴封片剂，每滴10 µL；确保两滴之间保持足够距离，以便在同一张载玻片上放置两个盖玻片。</li>
		<li>用干净的纸巾轻敲盖玻片以去除多余液体，然后将盖玻片细胞面朝下置于抗荧光淬灭封片剂中。</li>
		<li>将固定好的样品置于干燥、平坦的表面上，在避光条件下静置固化。</li>
		<li>封固后，用 VALAP 封片剂或指甲油密封盖玻片边缘，以防止样品干燥。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. HAE 培养物中 SARS-CoV-2 RNA-FISH
第1天
<ol start="1">
	<li>固定和通透HAE培养物
	<ol>
		<li>吸去培养基，使用3.7% PFA溶液在室温下固定感染的细胞1小时。</li>
		<li>吸去3.7% PFA溶液，用1× PBS洗涤细胞两次。
		<ol>
			<li>在Transwell插入膜下方将3.7% PFA溶液替换为1× PBS。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>弃去PBS，使用预冷至-20 °C的100% MeOH进行两次、每次5分钟的洗涤以脱水样品。</li>
		<li>第二次洗涤后，在Transwell插入膜下方将缓冲液替换为新鲜的、预冷的MeOH，用于通透处理，并于-20 °C过夜保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
第2天
<ol start="2">
	<li>复水 
	&#8203;在冰上使用梯度甲醇/PBST 溶液（每种溶液处理 5 分钟）对样品进行复水：75% 甲醇/25% PBST、50% 甲醇/50% PBST、25% 甲醇/75% PBST 和 100% PBST（两次）。
	<ol>
		<li>在冰上用 50% 5x SSCT / 50% PBST 冰浴洗涤细胞 5 分钟。</li>
		<li>在冰上用 5x SSCT 冰浴洗涤细胞 5 分钟。</li>
		<li>将 5x SSCT 缓冲液替换为 1x PBS。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检测
	<ol>
		<li>将细胞（置于 Transwell 插件内）在冰上用 100 µL 探针杂交缓冲液孵育 5 分钟。随后将培养板转移至 37 °C 恒温培养箱中孵育 30 分钟（预杂交）。 
		注：探针杂交缓冲液在使用前必须预热至 37 °C。计算所需体积：每个 Transwell 插件需要 100 µL。</li>
		<li>配制探针溶液。由于每 1 mL 探针溶液需要 4 pmol 探针，因此将 4 µL 的 1 µM 探针储备液加入 1 mL 探针杂交缓冲液中，并充分混匀。 
		&#8203;注：用于 RNA 检测时，每个 Transwell 插件使用 100 µL 探针溶液。探针溶液在预杂交步骤结束前应始终置于冰上。</li>
		<li>移除预杂交溶液，并加入探针溶液。</li>
		<li>在 37 °C 下孵育细胞过夜（12–18 小时）。 
		 
		&#8203;第 3 天</li>
		<li>在 37 °C 下用 100 µL 探针洗涤缓冲液洗涤 4 次，每次 15 分钟，以去除未结合的探针。</li>
		<li>在室温下用 5x SSCT 洗涤样品 2 次，每次 5 分钟。</li>
		<li>将 5x SSCT 替换为 1x PBS，并将样品在 4 °C 下保存，直至进行扩增步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>扩增
	<ol>
		<li>在室温下用扩增缓冲液孵育样品 30 分钟，进行预扩增。</li>
		<li>通过快速冷却分别在独立离心管中配制各发夹探针。
		<ol>
			<li>配制 500 µL 扩增溶液时，每种发夹探针使用 30 pmol（例如，对于 500 µL 体系，使用 10 µL 的 3 µM 发夹探针储备液）。</li>
			<li>将发夹探针溶液转移至各离心管中。</li>
			<li>在 95 °C 下孵育 90 秒。</li>
			<li>避光冷却至室温，持续 30 分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在室温下，将所有已快速冷却的发夹探针加入 500 µL 扩增缓冲液中，配制发夹探针混合液。</li>
		<li>移除预扩增溶液，并加入完整的发夹探针混合液。</li>
		<li>在室温下避光孵育样品过夜（12–18 小时）。</li>
		<li>在室温下用 5x SSCT 洗涤以去除多余的发夹探针，具体步骤为：2 次 × 5 分钟，2 次 × 15 分钟，1 次 × 5 分钟。</li>
		<li>将 5x SSCT 溶液替换为 1x PBS，并在 4 °C 下保存，保存时间不超过 2–3 天，或直接进行核染色。 
		&#8203;注：如有需要，可将 RNA-FISH 样品用于标准免疫荧光检测，随后进行核染色（见第 6 节）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>核染色与封片
	<ol>
		<li>吸除 1x PBS 溶液，并替换为含 DAPI（0.2 µg/mL）的 1x PBS 溶液。</li>
		<li>在室温下避光孵育 10 分钟。</li>
		<li>吸除 DAPI 溶液，并用 1x PBS 洗涤细胞两次。</li>
		<li>将 Transwell 插件中切割下来的膜置于 10 µL 抗荧光淬灭封片剂上，细胞面朝上，并在膜上额外添加 5 µL 封片剂。</li>
		<li>用盖玻片覆盖膜。</li>
		<li>将封片后的样品在干燥、平坦的表面上避光固化。</li>
		<li>固化完成后，使用 VALAP 密封剂或指甲油密封盖玻片边缘，防止样品干燥。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Vero 细胞和 HAE 培养物的免疫荧光分析
注意：对于细胞系，在第3天进行免疫荧光检测；对于HAE培养物，则在第4天进行。每种模型采用不同的方法，所有差异均已明确标出。
<ol>
	<li>从孔中吸除 1x PBS 溶液。</li>
	<li>用含 1% w/v 牛血清白蛋白的 PBST 溶液在 37 °C 下孵育 30 分钟，以封闭样品。</li>
	<li>用封闭液配制适当稀释度的一抗溶液，并进行孵育。
	<ol>
		<li>对于盖玻片上的 Vero 细胞：
		<ol>
			<li>在湿盒中的 Parafilm 膜上滴加抗体溶液（30–50 µL）。</li>
			<li>将盖玻片细胞面朝下置于抗体液滴上。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对于 HAE 样品，将插入膜中的封闭液替换为抗体溶液（100 µL），并在湿盒中孵育样品。 
		注意：根据每种一抗的情况调整孵育时间和温度。典型参数为室温孵育 2&#160;小时或 4 °C 过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 PBST 溶液洗涤样品，每次 5 分钟，共洗 3 次。
	<ol>
		<li>对于盖玻片上的细胞，转移至 12 孔板中，并加入 PBST 溶液。</li>
		<li>对于 HAE 培养物，将抗体溶液替换为 PBST 溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检查共聚焦显微镜可用的光源和滤光片。</li>
	<li>根据一抗的宿主物种选择相应的二抗，并根据可用光源选择荧光染料参数（激发和发射波长、光谱宽度及激发效率）。 
	注意：可使用在线工具模拟光谱参数（参见 材料表）。</li>
	<li>用封闭液稀释二抗，配制适当浓度的二抗溶液。</li>
	<li>加入二抗孵育（操作同步骤 6.3），在 37 °C 孵育 1 小时。</li>
	<li>样品洗涤操作同步骤 6.4。</li>
	<li>细胞核染色与载玻片封片
	<ol>
		<li>对于盖玻片上的细胞
		<ol>
			<li>吸除 PBST 溶液，加入含 DAPI（0.2 µg/mL）的 1x PBS 溶液。</li>
			<li>在避光条件下室温孵育 10 分钟。</li>
			<li>吸除 DAPI 溶液，用 1x PBS 洗涤细胞两次。</li>
			<li>将盖玻片细胞面朝下置于含 10 µL 封片剂的液滴上。</li>
			<li>用指甲油密封盖玻片。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对于 HAE 培养物
		<ol>
			<li>吸除 1x PBST 溶液，加入含 DAPI（0.2 µg/mL）的 1x PBS 溶液。</li>
			<li>在避光条件下室温孵育 10 分钟。</li>
			<li>吸除 DAPI 溶液，用 1x PBS 洗涤细胞两次。</li>
			<li>将切割好的膜片细胞面朝上置于含 10 µL 封片剂的液滴上，并在膜片上额外添加 5 µL 封片剂。</li>
			<li>用盖玻片覆盖膜片。</li>
			<li>用指甲油密封盖玻片。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 共聚焦显微镜
<ol>
	<li>通过指定所用的荧光染料来定义通道。</li>
	<li>选择扫描模式和扫描速度。</li>
	<li>通过与相应的阴性对照比较，调整每种荧光染料的激光功率、增益和偏移值：对于病毒，使用未感染细胞作为对照；对于细胞蛋白，使用相应宿主来源的同型对照抗体染色的样本作为对照。</li>
	<li>要获取三维图像，需启用 z 轴层扫模式，并设定顶部和底部边界，设置步进大小/层数。 
	注意：有关冠状病毒成像的更多细节，请参见19。</li>
</ol>

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<li>Milewska, A., Owczarek, K., Szczepanski, A., Pyrc, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+coronavirus+entry+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualizing coronavirus entry into cells.</a> Methods in Molecular Biology. 2203, 241-261 (2020).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

免疫-RNA-FISH 是一种用于 RNA 与细胞蛋白双重染色的可靠方法。本文描述了一种改良的免疫-RNA-FISH 实验方案，可用于在细胞系和人源气道上皮（HAE）培养物中检测 SARS-CoV-2 RNA 及细胞蛋白。该方案可适用于不同的细胞模型，包括单层细胞或特定组织。该方法基于由特异性探针定位引发的杂交链式反应（HCR）原理。随后，利用分裂引发探针启动荧光标记扩增子对信号进行扩增，在共聚焦显微镜下观察时几乎不产生背景荧光。扩增子可标记不同的荧光染料，并可与针对不同靶标的探针兼容，因此可同时使用。本方案所述操作步骤较为简便，但耗时较长（3–4 天）。然而，其结果具有较低的信噪比，优于使用直接标记荧光探针的其他实验方案。
本研究使用了 Vero 细胞和 HAE 培养物。对于载玻片上的细胞和组织培养中的细胞，需要采用不同的实验方案。主要差异体现在细胞处理方式（无论是在载玻片上还是在膜上）以及所用试剂的用量方面。常规的 RNA-FISH 实验方案需要使用乙醇或甲醇溶液进行通透化处理，并在 -20 °C 下孵育过夜。重要的是，使用去污剂进行通透化处理对免疫荧光更为有利，可将实验流程缩...

SARS-CoV-2 是一种新型的人类β冠状病毒，于2019年底出现，并在数月后引发了一场前所未有的大流行。由于该病毒对科学界而言是全新的，其许多生物学特性及其对宿主细胞的影响仍不明确。因此，若要理解该病毒的基本生物学特征及其对宿主的作用，绘制病毒感染过程中病毒与细胞及组织的嗜性图谱显得尤为重要。目前有多种技术可用于研究病毒与宿主之间的相互作用，包括生化、生物学和物理检测方法。原位杂交是一种常用方法，该方法使用标记的互补DNA、RNA或修饰的核酸探针，使其定位到细胞或组织中的特定DNA或RNA序列。
一种新的RNA荧光原位杂交（RNA-FISH）方法已被开发出来，该方法通过杂交链式反应（HCR1）放大信噪比，从而提高检测灵敏度。HCR技术可用于在单细胞水平上研究RNA的定位。由于其高特异性、高灵敏度和高分辨率，该方法不仅适用于基础科学研究，也适用于应用型项目，例如疾病诊断。最近，该方法已被成功用于检测定位于完全分化的三维人呼吸道上皮（HAE）培养物中纤毛细胞内的SARS-CoV-2 RNA2。HAE培养物是目前用于在“自然感染&#34;&#34;”微环境中研究病毒感染的最先进工具之一3,4。
多篇关于人类冠状病毒（HCoV）（包括SARS-CoV-2）的报告强调了表观遗传修饰在HCoV感染及病理生理过程中的重要性[综述见5]，例如编码血管紧张素转换酶2（ACE-2）受体的基因甲基化模式6,7。有趣的是，质谱筛选发现多个表观遗传因子可与SARS-CoV-2蛋白组相互作用8。更具体而言，非结构蛋白5（NSP5）可结合表观遗传调控因子组蛋白去乙酰化酶2，而催化失活的NSP5（C145A）则与tRNA甲基转移酶1（24）相互作用。此外，NSP16甲基转移酶活性可被甲基转移酶抑制剂辛fungin（sinefungin）阻断9。然而，这些表观遗传因子在新冠肺炎（COVID-19）中的确切作用仍不明确。HCoV的复制发生在感染细胞的细胞质中，并引发由表观遗传修饰调控的炎症反应10。
例如，HCoV-229E 可精细调控核因子-κB 信号通路，并通过增加特定区域 H3K36 和 H4K5 的乙酰化，显著重编程宿主细胞的染色质景观11。中东呼吸综合征相关冠状病毒感染会提高某些特异性干扰素敏感基因亚群启动子区域 H3K27me3 的水平，同时耗竭 H3K4me312。此外，病毒 RNA 可触发细胞免疫反应，黄病毒13、逆转录病毒14,15 和冠状病毒16 的研究已证实这一点。病毒 RNA 上的表观遗传标记可能在细胞感受器的识别过程中发挥作用，例如人类免疫缺陷病毒-1 RNA 的 m7A 甲基化已有相关证明17。然而，仍存在未解问题：SARS-CoV-2 RNA 对免疫反应有何影响？表观遗传修饰是否参与其中？
本文介绍了一种优化的RNA-FISH方法，并结合了细胞系和三维组织（完全分化的人支气管上皮HAE）的免疫荧光分析。尽管细胞学方法如FISH和免疫荧光已被广泛使用，但基于HCR的这一新一代原位杂交方法此前从未用于病毒检测（最近一篇文献除外）2。通常，免疫染色和FISH需要以下步骤：通透化处理以允许探针或抗体进入细胞；固定以稳定和保存细胞成分；检测步骤中加入抗体或核酸探针；最后，将样品封片以便观察。
尽管现有方案具有这些总体特征，但在所涉及的参数方面存在显著差异。本文介绍了一种经过优化的、简单的免疫-RNA-FISH方案，用于检测人呼吸道上皮（HAE）培养物和Vero细胞中的SARS-CoV-2 RNA。该技术包括以下步骤：（1）使用多聚甲醛固定细胞；（2）使用去垢剂或甲醇（MeOH）进行透化处理；（3）通过梯度甲醇溶液重新水化（仅适用于HAE培养物）；（4）检测；（5）利用HCR技术对SARS-CoV-2 RNA进行信号放大；（6）免疫染色；以及（7）在共聚焦显微镜下成像。

<table><tbody><tr><td>设备</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜 LSM 880</td><td>ZEISS </td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grant Bio 微型摇床-振荡器</td><td>Fisher Scientific</td><td>12965501</td><td></td></tr><tr><td>Galaxy170R 型培养箱</td><td>New Brunswick</td><td>CO170R-230-1000</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer Comfort 恒温混匀仪</td><td>Eppendorf</td><td>5355 000 011</td><td></td></tr><tr><td>材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mm × 15 mm 1号盖玻片</td><td>LabSolute</td><td>7695022</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>FL-MEDICAL</td><td>5.350.023.053</td><td></td></tr><tr><td>12孔板</td><td>TTP</td><td>92412</td><td></td></tr><tr><td>锥形离心管</td><td>Sarstedt</td><td>5.332.547.254</td><td></td></tr><tr><td>封口膜（parafilm）</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>移液管（serological pipets）</td><td>VWR Collection</td><td>612-5523P, 612-5827P</td><td></td></tr><tr><td>载玻片（slide glass）</td><td>PTH CHEMLAND</td><td>04-296.202.03</td><td></td></tr><tr><td>Transwell ThinCerts 细胞培养小室</td><td>Grainer bio-one</td><td>665641</td><td></td></tr><tr><td>试剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 标记的二抗</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;5-微管蛋白</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-134234</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma</td><td>S51136-500G</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>BioShop</td><td>EGT101.25</td><td></td></tr><tr><td>HCR 扩增缓冲液</td><td>Molecular Instruments, Inc.</td><td>BAM01522</td><td>缓冲液也可自行配制，参见 doi:10.1242/dev.165753：补充信息</td></tr><tr><td>HCR 放大剂 B1-h1 Alexa Fluor 647</td><td>Molecular Instruments, Inc.</td><td>S013922</td><td></td></tr><tr><td>HCR 放大剂 B1-h2 Alexa Fluor 647</td><td>Molecular Instruments, Inc.</td><td>S012522</td><td></td></tr><tr><td>HCR 探针杂交缓冲液</td><td>Molecular Instruments, Inc.</td><td>BPH03821</td><td>缓冲液也可自行配制，参见 doi:10.1242/dev.165753：补充信息</td></tr><tr><td>针对 SARS-CoV-2 核衣壳蛋白的 HCR 探针组</td><td>Molecular Instruments, Inc.</td><td>PRE134</td><td></td></tr><tr><td>HCR 探针洗涤缓冲液</td><td>Molecular Instruments, Inc.</td><td>BPW01522</td><td>缓冲液也可自行配制，参见 doi:10.1242/dev.165753：补充信息</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>BioShop</td><td>HEP001.100</td><td></td></tr><tr><td>七水合硫酸镁</td><td>Sigma</td><td>63138-250G</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma</td><td>32213-1L-M</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma</td><td>P5655-100G</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma</td><td>P6148-1KG</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>BioShop</td><td>PIP666.100</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma</td><td>P5405-250G</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Diamond 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Invitrogen</td><td>P36970</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>BioShop</td><td>SOD001.5</td><td></td></tr><tr><td>二水合柠檬酸三钠</td><td>POCH</td><td>6132-04-3</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>BioShop</td><td>TWN580.500</td><td></td></tr><tr><td></td><td>软件</td><td></td><td></td></tr><tr><td>荧光光谱查看器（Fluorescence Spectraviewer）</td><td></td><td></td><td>光谱参数建模</td></tr><tr><td>ImageJ Fiji</td><td></td><td></td><td>获取和处理 z-stack 图像</td></tr></tbody></table>

使用免疫rna-荧光原位杂交技术可视化sars-cov-2

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

本论文提供了一种原位杂交链式反应（HCR）与免疫荧光联合使用的实验方案，用于在细胞系&#160;及人呼吸道上皮三维（3D）培养模型中可视化严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的RNA。该方法依赖于探针定位后启动HCR，从而实现对病毒RNA的高度特异性和高灵敏度成像。分裂引发探针可借助荧光标记的放大分子增强信号，使共聚焦显微镜下的背景荧光几乎可忽略不计。使用不同荧光染料标记放大分子，可实现多种靶标的同步识别。这有助于在组织中绘制感染分布图谱，从而在单细胞水平上更深入地理解病毒的致病机制和复制过程。将该方法与免疫荧光技术结合，有助于进一步阐明宿主与病毒之间的相互作用，包括宿主表观基因组及免疫应答通路的变化。得益于HCR技术的高灵敏度和高特异性，本方案亦可用作诊断工具。还需注意的是，该技术可轻松改造，以适用于检测任何RNA，包括非编码RNA以及未来可能出现的RNA病毒。

本研究中描述的免疫RNA-FISH方案使用了两种细胞体系：Vero细胞系和三维人源化气道上皮（3D HAE）培养物。两种细胞模型的主要步骤如表2所示。在HAE培养物中用于可视化SARS-CoV-2的RNA-FISH方案包含适用于组织样本的典型步骤，即使用100%甲醇进行通透化处理，并通过梯度甲醇-PBS及含0.1% Tween的溶液进行再水化。在完成RNA-FISH后进行免疫荧光染色。采集并处理Z轴层扫图像。
图1显示了模拟接种的对照Vero细胞或感染SARS-CoV-2的细胞中的免疫RNA荧光原位杂交结果。图2显示了模拟接种的对照HAE培养物或感染SARS-CoV-2的培养物中的免疫RNA荧光原位杂交结果。图3展示了Vero细胞中通透化方案...

在此，我们介绍一种简单的方法，该方法结合了RNA荧光原位杂交&#160;将RNA原位杂交（RNA-FISH）与免疫荧光结合，用于可视化严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）RNA。该方案可能有助于加深理解SARS-CoV-2 RNA与宿主相互作用的分子特征，达到单细胞水平。

使用免疫RNA-荧光原位杂交技术可视化SARS-CoV-2

本文提供了一种原位杂交链式反应（HCR）与免疫荧光联合使用的实验方案，用于可视化严重急性呼吸综合征...

该方案使得在细胞系以及完全分化的三维人呼吸道上皮培养物中可视化SARS-CoV-2 RNA成为可能，为在单细胞水平上更好地理解病毒的致病机制和复制过程提供了一种工具。由于其高特异性、高灵敏度和高分辨率，该方法不仅适用于SARS-冠状病毒-2的基础科学研究，也适用于诊断等应用型项目。本实验操作将由我实验室的博士生Agnieszka Suder进行演示。按照文稿中所述对细胞进行固定和通透处理后，从各孔中移除1X PBS溶液，并向每孔加入至少300微升扩增缓冲液。将样品在室温下孵育30分钟。通过在独立的离心管中对所需体积的HCR发卡探针进行快速冷却，分别进行预处理。配制300微升扩增溶液时，使用每种发夹结构18皮摩尔。将发夹溶液转移至离心管中，在95摄氏度孵育90秒，然后在避光条件下冷却至室温，持续30分钟。通过将瞬时冷却的H1和H2发夹结构加入扩增缓冲液中，制备发夹混合物。将30至50微升的发夹混合物滴加到Parafilm上。将带有细胞的盖玻片放置在发夹混合物液滴上，并在室温避光条件下孵育样品过夜。封片时，在载玻片上放置两滴10微升的封片剂，确保两滴之间留有足够距离，以便在同一张载玻片上放置两个盖玻片。将盖玻片在干净的纸巾上轻压，去除多余液体。然后将其放入抗荧光淬灭封片剂中，使细胞面朝下。将固定的样品置于干燥、平坦的表面，在避光条件下使其固化。按照文本稿件中的描述对HAE细胞进行固定和通透处理后，将样品与扩增缓冲液在室温下孵育30分钟，进行预扩增。每种发夹探针使用30皮摩尔，用以配制500微升的扩增溶液。将发夹结构溶液转移至离心管中，在95摄氏度孵育90秒，随后在避光条件下冷却至室温，持续30分钟。通过将所有快速冷却的发夹结构加入500 µL室温的扩增缓冲液中，制备发夹结构溶液。移除预扩增溶液，加入完整的发夹结构溶液。然后将样品在室温避光条件下孵育过夜。将Transwell小室中切下的膜置于10微升抗荧光淬灭封片剂上，细胞面朝上，并向膜上添加额外的封片剂。然后用盖玻片覆盖膜。该免疫RNA-FISH方案在两种细胞系统中进行，分别为Vero细胞系和三维人呼吸道上皮培养物。此处展示了SARS-冠状病毒-2亚基因组RNA在感染和模拟接种的Vero细胞中的定位。病毒RNA显示为红色。此处展示了感染和模拟接种的人气道上皮细胞中SARS-冠状病毒-2亚基因组RNA的定位。该透化方案在Vero细胞中进行了优化。使用去垢剂进行通透化处理可获得清晰且特异的SARS-冠状病毒-2亚基因组RNA信号，而使用乙醇则会导致图像模糊、不聚焦。在封片含有Vero细胞的载玻片时，应将盖玻片上的细胞面朝下放置。而在封片HAE载玻片时，需将膜上的细胞面朝上放置。该技术可轻松改造，用于检测任何RNA，包括非编码RNA以及未来可能出现的RNA病毒。与免疫荧光结合后，可用于在单细胞水平上研究蛋白质-RNA相互作用。

visualization-sars-cov-2-using-immuno-rna-fluorescence-situ

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

使用免疫RNA-荧光原位杂交对SARS-CoV-2进行可视化

一种结合原位四聚体染色与原位杂交（ISTH）的技术，能够实现病毒特异性CD8+...

一种可同时原位可视化病毒特异性CD8+ T细胞与病毒感染细胞的技术 In situ

荧光法检测病毒RNA 原位 杂交（FISH）

来源：Mateer, E., 等，负链RNA病毒感染中双链RNA与模式识别受体的共聚焦成像。J. Vis. Exp.

感染上皮细胞中病毒双链RNA与宿主模式识别受体的可视化

本视频演示了杂交链式反应（HCR）-荧光原位杂交（FISH）技术在可视化SARS-CoV-2亚基因组RNA空间分布中的应用。将HCR与免疫荧光技术相结合，有望在单细胞水平上揭示宿主与病毒之间的相互作用。...

利用免疫-RNA 荧光原位杂交技术可视化 SARS-CoV-2

本视频展示了一种用于监测单纯疱疹病毒-1型感染过程中感染细胞蛋白0（ICP0）转运的方法。ICP0在新合成后会转位至细胞核，随着感染进程的发展，随后转移至细胞质。通过免疫荧光显微镜可揭示并分析该蛋白的亚细胞定位，从而深入了解其在感染各阶段中的转运动态。...

一种用于感染细胞中病毒蛋白定位的免疫荧光技术

RNA病毒复制过程中产生的双链RNA可被模式识别受体识别，从而诱导先天免疫反应。对于负链RNA病毒而言，低水平的双链RNA与模式识别受体之间的相互作用仍不明确。我们开发了一种共聚焦显微镜方法，用于在单个细胞中可视化沙粒病毒的双链RNA和模式识别受体。...

负链RNA病毒感染中双链RNA与模式识别受体的共聚焦成像

本文介绍了一种荧光成像方法的实验方案，即多重免疫荧光细胞检测法检测DNA、RNA和蛋白质（MICDDRP），该方法能够同时在单细胞水平上以荧光方式可视化不同种类和链型的病毒蛋白及其核酸。该方法可广泛应用于多种研究体系。...

单细胞多重荧光成像技术用于可视化病毒核酸与蛋白质并监测HIV、HTLV、HBV、HCV、寨卡病毒和流感病毒感染

本方案介绍了一种快速且有效的检测方法，通过评估恢复期血清样本抑制携带刺突糖蛋白的增强型绿色荧光蛋白标记的水疱性口炎病毒假病毒入侵的能力，来测定针对SARS-CoV-2刺突蛋白的中和抗体水平。...

利用高通量荧光成像检测SARS-CoV-2中和抗体的假病毒侵染

本方案利用表达荧光素酶和荧光蛋白的重组（r）SARS-CoV-2 及其 体内 在K18-hACE2转基因小鼠中使用成像系统（IVIS）以克服研究SARS-CoV-2感染所需的次级方法 体内.

利用报告基因表达的重组SARS-CoV-2对K18 hACE2转基因小鼠进行病毒感染的活体成像与定量分析

本方案描述了一种基于胶带的简易方法，用于采集番茄及其他新鲜农产品表面样本，随后进行完整的细胞快速检测 沙门氏菌 使用荧光 原位...

基于胶带黏附取样与荧光技术的联用方法 原位 杂交法用于快速检测 沙门氏菌 在新鲜农产品上

学习使用免疫RNA-荧光原位杂交技术可视化SARS-CoV-2病毒RNA，在Vero细胞系和三维人呼吸道上皮培养物中实现单细胞分辨率检测。该方法具有高特异性和灵敏度，适用于病毒发病机制研究和诊断应用。

使用免疫RNA-荧光原位杂交技术可视化SARS-CoV-2

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