使用免疫RNA-荧光原位杂交对SARS-CoV-2进行可视化
2020年12月23日
在这里，我们描述了一个简单的方法，结合RNA荧光原位杂交（RNA-FISH）与免疫荧光可视化严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2（SARS-CoV-2）RNA。该协议可以增加对SARS-CoV-2 RNA-主机在单细胞水平上的分子特征的理解。
该方案使得在细胞系和完全分化的三维人气道上皮培养物中可视化 SARS-CoV-2 RNA 成为可能，为在单细胞水平上更好地了解病毒的发病机制和复制提供了一种工具。由于其高特异性、灵敏度和分辨率，该方法不仅适用于 SARS-coronavirus-2 的基础科学研究，还可用于诊断等应用项目。演示该程序的是我实验室的博士生 Agnieszka Suder。
按照文本手稿中的说明固定和透化细胞后，从孔中取出 1X PBS 溶液，并向每个孔中加入至少 300 μL 的扩增缓冲液。将样品在室温下孵育 30 分钟。通过在单独的试管中快速冷却所需的体积来准备每个 HCR 发夹。
要制备 300 微升扩增溶液，每个发夹使用 18 皮摩尔。将发夹溶液转移到试管中，并在 95 摄氏度下孵育 90 秒。然后在黑暗中冷却至室温 30 分钟。
通过将快速冷却的 H1 和 H2 发夹添加到扩增缓冲液中来制备发夹混合物。将 30 至 50 微升发夹混合物滴到 Parafilm 上。将带有细胞的盖玻片放在发夹混合物滴上，并在室温下避光孵育样品过夜。
安装玻片时，将两滴 10 微升的封固剂滴在玻片上，确保液滴充分分离，以便将两个盖玻片放在一个玻片上。用干净的毛巾轻敲盖玻片，去除多余的液体。然后将它们放入抗淬灭封固剂中，细胞朝下。
将封固的样品放在干燥、平坦的表面上避光，让它们固化。按照文本手稿中的说明固定和透化 HAE 细胞后，通过在室温下将样品与扩增缓冲液孵育 30 分钟来预扩增样品。使用每个发夹 30 皮摩尔制备 500 微升扩增溶液。
将发夹溶液转移到试管中，并在 95 摄氏度下孵育 90 秒。然后将它们在黑暗中冷却至室温 30 分钟。通过在室温下将所有快速冷却的发夹添加到 500 μL 扩增缓冲液中来制备发夹溶液。
去除预扩增溶液，加入完整的发夹溶液。然后将样品在室温下避光孵育过夜。将 Transwell 插入物中的切割膜放在 10 μL 抗淬灭封固剂上，细胞朝上，并在膜上添加额外的封固剂。
然后用盖玻片盖住膜。该免疫 RNA-FISH 方案在两个细胞系统中进行，一种是 Vero 细胞系，另一种是 3D 人气道上皮培养物。SARS-coronavirus-2 亚基因组 RNA 在感染和模拟接种的 Vero 细胞中的定位如图所示。
病毒 RNA 可见红色。SARS-coronavirus-2 亚基因组 RNA 在感染和模拟接种的人气道上皮细胞中的定位如图所示。在 Vero 细胞中优化透化方案。
用去污剂透化可产生 SARS-coronavirus-2 亚基因组 RNA 的清晰、特异性信号，而使用乙醇会导致图像模糊且未聚焦。使用 Vero 细胞安装载玻片时，重要的是放置一个盖玻片，使细胞朝下。安装 HAE 载玻片时，需要将膜放置，使细胞朝上。
该技术可以很容易地进行修改，以便能够检测任何 RNA，包括非编码 RNA 和将来可能出现的 RNA 病毒。与免疫荧光相结合，它可用于研究单细胞水平的蛋白质-RNA 相互作用。
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概述
本文介绍了一种将RNA荧光原位杂交（RNA-FISH）与免疫荧光结合以可视化SARS-CoV-2 RNA的方法。该方法增强了对SARS-CoV-2 RNA-宿主相互作用在单细胞水平上的理解。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 病毒学
- 细胞生物学
背景
- 理解病毒致病机制对于开发有效的诊断和治疗至关重要。
- SARS-CoV-2对公共卫生有重大影响。
- 在单细胞水平上可视化RNA可以提供病毒复制的洞察。
- 将RNA-FISH与免疫荧光结合提供了高特异性和灵敏度。
研究目的
- 在各种细胞模型中可视化SARS-CoV-2 RNA。
- 增强对病毒在宿主细胞内相互作用的理解。
- 为病毒学的基础和应用研究提供工具。
使用的方法
- 细胞固定和渗透处理。
- 应用RNA可视化的扩增缓冲液。
- 使用HCR发夹进行特定RNA检测。
- 使用免疫荧光技术来补充RNA-FISH。
主要结果
- 成功在细胞系和人类气道上皮细胞培养物中可视化了SARS-CoV-2 RNA。
- 该方法展示了高特异性和灵敏度。
- 结果有助于更好地理解病毒致病机制。
- 该协议适用于研究和诊断目的。
结论
- 该结合方法有效用于在单细胞水平上研究SARS-CoV-2。
- 它提供了对RNA-宿主相互作用的宝贵洞察。
- 该方法可以帮助开发诊断工具。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-resolution visualization of SARS-CoV-2 RNA in both cell lines and 3D human airway epithelium cultures enables precise mapping of viral replication and host-pathogen interactions at the single-cell level. This capability supports mechanistic de-risking and target validation in infectious disease research pipelines. The protocol's adaptability for diverse RNA targets positions it as a reusable asset for rapid response to emerging viral threats.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of viral replication and localization in physiologically relevant systems.
- Supports functional validation of host-virus interaction targets at single-cell resolution.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing specific infection events from background.
- Provides high-confidence data for triaging antiviral targets and pathways.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, quantitative readouts for viral RNA detection in cell-based assays.
- Supports assay standardization and reproducibility across cell lines and 3D cultures.
- Enables multiplexed detection of RNA and protein targets for comprehensive screening.
- Prepares robust biological systems for downstream compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant airway models for translational continuity.
- Enables mapping of infection and host response in preclinical tissue systems.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing predictive, single-cell data.
- Facilitates biomarker discovery through simultaneous RNA and protein visualization.
Pipeline & Workflow Integration
This immuno-RNA-FISH protocol integrates from early discovery through preclinical research, supporting hypothesis testing, target validation, and translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Provides high-specificity detection of viral RNA for pathway clarification and biological de-risking.
- Screening: Offers reproducible, quantitative outputs for assay development and compound screening.
- Analytics: Enables single-cell resolution measurements and multiplexed readouts for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro and ex vivo models for preclinical validation of infection and host response.
- Enterprise Reuse: Adaptable for detection of any RNA, supporting rapid deployment against emerging pathogens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in viral pathogenesis studies.
- Operational Value: Standardizes sensitive, multiplexed detection workflows across diverse biological models.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust target validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of antiviral programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in advanced fluorescence microscopy and in situ hybridization techniques.
- Needs access to confocal imaging platforms and validated amplification reagents.
- Demands cross-team standardization for reproducibility across cell and tissue models.
- Adaptable to various RNA targets with protocol optimization for new systems.
- Dependent on careful permeabilization and mounting to ensure signal specificity and clarity.
