胚胎显微注射及CRISPR/Cas9基因组编辑棉铃虫（Helicoverpa armigera）（Hübner）敲除突变体的鉴定

棉铃虫是全球最具破坏性的害虫之一。利用CRISPR/Cas9技术进行基因组编辑，可进一步研究该生物体中基因功能及不同基因之间的相互作用。该技术的两个主要优势在于其具有高度特异性和可遗传性。

为了选择sgRNA靶点，请访问CRISPR在线网站，搜索可能的引导序列以及靠近基因5'非翻译区的外显子。将外显子序列输入文本框中，并将目标基因组选择为Helicoverpa armigera。根据该网站的用户手册，PAM选项选择20 BPNGG，其余设置保持默认参数。

比较软件预测的引导序列，选择一段长度为20个碱基、在5'非翻译区附近含有一个或两个鸟嘌呤、预测效率最高且错配最少的引导序列，以提高编辑效率并减少脱靶编辑。进行胚胎制备时，从三天龄的雄性和两天龄的雌性中各选取50只健康个体，混合置于洁净的网笼中，并在笼内放置一块含有10%蔗糖溶液的湿润棉布。

用纱布覆盖网箱，并用橡皮筋固定纱布。向纱布喷水以保持湿润。将一块黑色布料剪成适当大小，替换湿润的纱布，使卵自由定位 30 分钟。

将双面胶带粘贴到显微镜载玻片上。使用镊子将带有卵的样本块在双面胶带上排成一行。按压每个样本块的边缘，确保其牢固地粘附在胶带上。

每个载玻片收集 50 至 100 个卵。显微注射前，将载玻片置于冰上以延缓胚胎发育。按照文本稿件中的描述，使用显微拉针仪拉制毛细玻璃管来制备注射针。

使用微型研磨器将针尖研磨成锋利的尖端。在PCR管中，向无RNase的水中加入2微升市售Cas9蛋白和sgRNA，配制成总体积为10微升的注射溶液。用移液器充分混匀后置于冰上。

设置电子显微注射仪的参数。使用微量移液器吸头将两微升混合物装入注射针中，尽可能排出针尖内的残余空气。将注射针连接至显微操作器，并确保两部分之间连接紧密。

将载玻片放入培养皿中，并置于显微镜载物台上。以45度角小心地将针尖插入胚胎的上半部分。踩下脚踏开关，将混合物注入胚胎，导致胚胎轻微膨胀。

立即从胚胎中撤出针头，并用一只手移动培养皿，直到下一个胚胎靠近针头。使用相同操作至少注射300个胚胎，以确保获得足够的孵化数量。注射后盖上培养皿的盖子。

当胚胎表面颜色变深后，在培养皿中的载玻片周围放入人工饲料。准备24孔细胞培养板，向每孔中加入人工饲料至其容积的三分之一。用小号画笔挑出孵化的幼虫，并将其转移至24孔培养板中，每孔放置一条幼虫。

当幼虫发育至三龄阶段时，将其转移至新的玻璃培养管中。将新羽化的G0代雄性成虫与野生型雌性成虫按1:1比例转移至新的网笼中，并在棉球上滴加10%蔗糖溶液供其取食。

采用常规方法饲养昆虫，直至G一代化蛹。用镊子小心取下一条后足，将每条后足放入一个裂解基质管中。使用组织匀浆器匀浆后足组织。

使用商品化的基因组DNA提取试剂盒，按照生产商说明书提取匀浆样本的基因组DNA。根据文稿中提供的基因分型引物和PCR反应条件扩增目标基因片段。通过基因测序服务确认基因型。

将相同基因型的G一代个体放入同一个网笼中，对G一代后代进行自交，并继续使用相同方法进行筛选。目的基因的靶位点位于其第二外显子。该位点高度保守，通过琼脂糖凝胶电泳验证了合成的sgRNA的靶向条带片段。

通过测序G-one亲本单元的PCR产物，对单个sgRNA靶点的突变进行检测。利用跨越不同外显子的非重叠sgRNA配对可有效区分大片段缺失突变与野生型片段，从而验证该方法的有效性。在获得一定数量的突变个体后，可开展电生理或行为学实验，以阐明基因功能及不同基因间的相互作用。