Name: DNA系留RNA聚合酶用于可编程体外转录和分子计算 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 了解利用DNA系留技术调控T7 RNA聚合酶活性的创新方法，用于可编程体外转录和分子计算。该技术结合DNA电路的可扩展性与转录调控功能，为基因工程和诊断学应用提供新工具。

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L.Y.T.C. 感谢新前沿研究基金-探索项目（New Frontiers in Research Fund-Exploration，NFRF-E）、加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）发现资助计划以及多伦多大学“设计医学”计划提供的大力支持，其中“设计医学”计划获得了加拿大优先研究卓越基金（Canada First Research Excellence Fund，CFREF）的资助。

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所有作者均无任何需要声明的竞争性经济利益。

本研究展示了一种受DNA纳米技术启发的方法，通过将N端带有SNAP标签的重组T7 RNA聚合酶（T7 RNAP）与含BG修饰的寡核苷酸共价偶联，实现对T7 RNA聚合酶活性的调控，并进一步用于编程TMDSD反应。设计上选择将SNAP标签置于聚合酶的N端，因为野生型T7 RNAP的C端埋藏于蛋白质结构核心内部，并与DNA模板形成关键相互作用28。此前尝试修饰聚合酶C端均导致酶活性完全丧失，除非引入其他补偿性突变29,30。相比之下，T7 RNAP的N端融合通常可被良好耐受，尽管所选融合标签可能影响聚合酶活性。不同标签对RNAP活性的具体影响尚未系统阐明。本研究选用SNAP标签，因其具有高效性和稳健性，可实现蛋白质与寡核苷酸之间化学计量比的定量标记。此外，也可采用其他偶联化学方法将寡核苷酸连接至聚合酶，例如Ybbr31标签、Sortase标签32、SpyTags<sup class=...

DNA计算利用一组设计好的寡核苷酸作为计算的介质。这些寡核苷酸通过编程赋予特定序列，能够根据用户指定的逻辑动态组装，并响应特定的核酸输入。在概念验证研究中，计算的输出通常由一组荧光标记的寡核苷酸组成，可通过凝胶电泳或荧光酶标仪检测。在过去30年中，已展示出日益复杂的DNA计算电路，例如各种数字逻辑级联、化学反应网络以及神经网络1,2,3。为了辅助这些DNA电路的构建，研究人员已采用数学模型来预测合成基因电路的功能4,5，并开发了用于正交DNA序列设计的计算工具6,7,8,9,10。与基于硅的计算机相比，DNA计算机的优势在于其能够直接与生物分子相互作用、在无需电源的情况下于溶液中运行，以及整体上的紧凑性和稳定性。随着下一代测序技术的出现，过去二十年中合成DNA计算机的成本下降速度已超过摩尔定律11。基于DNA的计算机应用正逐步涌现，例如用于疾病诊断12,13、驱动分子生物物理学研究14，以及作为数据存储平台15。
<img alt="显示交叉路径的DNA重组示意图，突出基因交换与重排。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：由趾区介导的DNA链置换机制。 趾区（δ）是部分双链上一段游离且未结合的序列。当第二条链上引入一个互补区域（δ*）时，游离的δ区域可作为杂交的趾区，使该链的其余部分（ɑ*）通过一种称为链迁移的可逆拉链/解链反应，缓慢地将其竞争链置换下来。随着δ长度的增加，正向反应的ΔG降低，置换反应更易发生。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
迄今为止，大多数DNA计算机利用了动态DNA纳米技术领域中一种成熟的结构模式，即由“趾区”介导的DNA链置换反应（toehold-mediated DNA strand displacement，TMDSD，图1）16。该模式由一段部分双链的DNA（dsDNA）组成，其上带有较短的“趾区”突出端（通常为7至10个核苷酸（nt））。核酸“输入”链可通过趾区与部分双链结构结合，进而将其中一条链从部分双链中置换出来；被释放的链随后可作为下游部分双链结构的输入信号。因此，TMDSD能够实现信号级联放大和信息处理。理论上，正交的TMDSD结构可在溶液中独立运行，从而实现并行的信息处理。目前已发展出多种TMDSD反应的变体形式，例如由趾区介导的DNA链交换反应（TMDSE）17、具有双长结构域的“无泄漏”趾区18、序列错配的趾区19以及由“手柄区（handhold）”介导的链置换反应20。这些创新的设计原理可更精确地调控TMDSD的热力学与动力学特性，从而提升DNA计算的性能。
合成基因回路（如转录基因回路）也具备计算能力21,22,23。这些回路由蛋白质转录因子调控，后者通过结合特定的调控DNA元件来激活或抑制基因的转录。与基于DNA的回路相比，转录回路具有多个优势。首先，酶促转录的周转速率远高于现有的催化性DNA回路，因而每一份输入可产生更多的输出拷贝，提供更高效的信号放大手段。此外，转录回路可产生多种功能性分子作为计算输出，例如适配体或编码治疗性蛋白质的信使RNA（mRNA），可用于多种不同应用。然而，当前转录回路的一个主要局限在于其缺乏可扩展性。这是因为正交的蛋白质转录因子种类极为有限，而从头设计新的蛋白质转录因子在技术上仍具有挑战性且耗时较长。
<img alt="包含T7 RNAP、SNAP标签、DNA相互作用和RNA转录过程的基因编辑示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：“拴系”和“笼状”聚合酶复合物的抽象示意图与作用机制。（A 和 B）通过SNAP标签反应，将寡核苷酸拴系物酶促标记至T7聚合酶上。由“伪”T7启动子及带有与拴系物互补突出端的“笼状”结构组成，可与拴系物杂交并阻断转录活性。（C）当存在操纵子（a*b*）时，其结合至寡核苷酸拴系物（ab）的黏性末端，并置换笼状结构中的b*区域，从而启动转录。本图经Chou和Shih27修改。缩写：RNAP = RNA聚合酶。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
本文介绍了一种用于分子计算的新型构建模块，该模块结合了转录电路的功能与基于DNA电路的可扩展性。该构建模块是由T7 RNA聚合酶（T7 RNAP）通过共价连接单链DNA链（图2A）所组成。为了合成这种DNA拴系的T7 RNAP，将聚合酶与N端SNAP标签融合，并在Escherichia coli中进行重组表达24。随后，SNAP标签与带有BG底物修饰的寡核苷酸发生反应。该寡核苷酸链可通过DNA杂交将分子“客体”定位至聚合酶附近。其中一种“客体”为竞争性转录阻断剂，称为“笼”（cage），其结构为不含下游基因的“伪”T7启动子DNA双链（图2B）。当该“笼”通过寡核苷酸链与RNAP结合后，会通过竞争性占据RNAP结合位点，抑制其他DNA模板的结合，从而使RNAP处于“关闭”（“OFF”）状态（图2C）。
为了将聚合酶激活至“开启”状态，设计了在基因的T7启动子上游带有单链“操作子”区域的T7 DNA模板。该操作子区域（即图 a*b*2C 所示区域）可通过TMDSD机制使笼状结构从RNAP上解离，并将RNAP定位至基因T7启动子附近，从而启动转录。此外，也可设计操作子序列与辅助核酸链互补的DNA模板，这些辅助核酸链被称为“人工转录因子”（即 图 3A 中的 TFA 和 TFB 链）。当两条链被引入反应体系后，它们将在操作子位点处组装，形成一个新的拟连续区域 a*b*，进而通过TMDSD机制置换笼状结构，启动转录过程（图 3B）。这些核酸链可通过外源添加或在体系内自行生成的方式提供。
<img alt="基因调控示意图；转录因子 TF&lt;sub&gt;A&lt;/sub&gt;、TF&lt;sub&gt;B&lt;/sub&gt;; RNA 聚合酶结合。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 3"> 
图3：通过三组分开关激活剂对聚合酶活性进行选择性编程。（A）当转录因子（TFA 和 TFB）存在时，它们会结合到启动子上游的操作子区域，形成一段伪单链序列（a*b*），该序列可通过黏性末端介导的DNA链置换反应（toehold-mediated DNA displacement）将笼状结构置换出来。（B）该 a*b* 区域可通过TMDSD置换笼状结构，从而启动转录。本图经Chou和Shih27修改。缩写：TF = 转录因子；RNAP = RNA聚合酶；TMDSD = 黏性末端介导的DNA链置换反应。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
利用基于核酸的转录因子实现体外转录调控，可规模化地构建复杂的电路行为，例如数字逻辑、反馈和信号级联。例如，可通过设计核酸序列，使上游基因的转录产物激活下游基因，从而构建逻辑门级联。该技术所实现的信号级联与多重化能力，可应用于开发更复杂的分子计算电路，用于便携式诊断和分子数据处理。此外，将分子计算与从头RNA合成能力相结合，可拓展新的应用。例如，可设计分子电路以检测一种或多种用户自定义的RNA作为输入，并输出具有治疗功能的RNA，或编码功能性多肽或蛋白质的mRNA，用于即时医疗应用场景。

<table><tbody><tr><td>0.5% 聚山梨酯 20 (TWEEN 20)</td><td>BioShop</td><td>TWN510.5</td><td></td></tr><tr><td>0.5M 乙二胺四乙酸 (EDTA)</td><td>Bio Basic</td><td>SD8135</td><td></td></tr><tr><td>10 mM 磷酸钠缓冲液 (pH 7)</td><td>Bio Basic</td><td>PD0435</td><td>用于配制 10 mM 缓冲液的片剂</td></tr><tr><td>10% 过硫酸铵 (APS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678-100G</td><td></td></tr><tr><td>100 kDa Amicon Ultra-15 离心过滤单元</td><td>Fisher Scientific</td><td>UFC910008</td><td></td></tr><tr><td>100% 丙酮</td><td>Fisher Chemical</td><td>A18P4</td><td></td></tr><tr><td>100% 乙醇 (EtOH)</td><td>House Brand</td><td>39752-P016-EAAN</td><td></td></tr><tr><td>10x 体外转录 (IVT) 缓冲液</td><td>New England Biolabs</td><td>B9012</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris-硼酸-EDTA (TBE) 缓冲液</td><td>Bio Basic</td><td>A0026</td><td></td></tr><tr><td>1M 异丙基 &amp;beta;-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷 (IPTG)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I5502-1G</td><td></td></tr><tr><td>1M 碳酸氢钠缓冲液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014-500G</td><td></td></tr><tr><td>1M 三(羟甲基)氨基甲烷 (Tris)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>648311-1KG</td><td></td></tr><tr><td>1X Tris-EDTA (TE) 缓冲液</td><td>ThermoFisher</td><td>12090015</td><td></td></tr><tr><td>2M 咪唑</td><td>Sigma Aldrich</td><td>56750-100G</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇 (BME)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>3M 醋酸钠</td><td>Bio Basic</td><td>SRB1611</td><td></td></tr><tr><td>40% 丙烯酰胺 (19:1)</td><td>Bio Basic</td><td>A00062</td><td></td></tr><tr><td>4x LDS 蛋白样品上样缓冲液</td><td>Fisher Scientific</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>5M 氯化钠 (NaCl)</td><td>Bio Basic</td><td>DB0483</td><td></td></tr><tr><td>5mM 二硫苏糖醇 (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>43815-1G</td><td></td></tr><tr><td>6x 凝胶上样染料</td><td>New England Biolabs</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖 B 粉末</td><td>Bio Basic</td><td>AB0014</td><td></td></tr><tr><td>BG-GLA-NHS</td><td>New England Biolabs</td><td>S9151S</td><td></td></tr><tr><td>BL21 感受态大肠杆菌 (E. coli)</td><td>Addgene</td><td>C2530H</td><td></td></tr><tr><td>BLUeye 预染蛋白 Marker</td><td>FroggaBio</td><td>PM007-0500</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Bio Basic</td><td>BDB0001</td><td></td></tr><tr><td>考马斯亮蓝 (SimplyBlue SafeStain)</td><td>ThermoFisher</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>花青染料 (SYBR Gold 核酸凝胶染色剂)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>花青染料 (SYBR Safe 核酸凝胶染色剂)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>干燥二甲基亚砜 (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>甲酰胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F9037-100ML</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Bio Basic</td><td>GB0232</td><td></td></tr><tr><td>硫酸卡那霉素</td><td>BioShop</td><td>KAN201.5</td><td></td></tr><tr><td>LB 培养基 (Lysogeny broth)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2542-500ML</td><td></td></tr><tr><td>孔雀石绿草酸盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2437-29-8</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-四甲基乙二胺 (TEMED)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281-25ML</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS 电泳缓冲液 (20x)</td><td>Fisher Scientific</td><td>LSNP0002</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris 凝胶 1.0 mm 12 孔</td><td>Life Technologies</td><td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>寡核苷酸 (笼型反义链)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>TATAGTGAGTCGTATTAATTTG</td></tr><tr><td>寡核苷酸 (笼型正义链)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>TCAGTCACCTATCTGTTTCAAA&lt;br/&gt; TTAATACGACTCACTATA</td></tr><tr><td>寡核苷酸 (孔雀石绿适配体反义链)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>GGATCCATTCGTTACCTGGCT&lt;br/&gt; CTCGCCAGTCGGGATCCTATA&lt;br/&gt; GTGAGTCGTATTACAGTTCCAT&lt;br/&gt; TATCGCCGTAGTTGGTGTACT</td></tr><tr><td>寡核苷酸 (孔雀石绿适配体正义链)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>TAATACGACTCACTATAGGATC&lt;br/&gt; CCGACTGGCGAGAGCCAGGT&lt;br/&gt; AACGAATGGATCC</td></tr><tr><td>寡核苷酸 (转录因子 A)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>AGTACACCAACTACGAGTGAG</td></tr><tr><td>寡核苷酸 (转录因子 B)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>TCAGTCACCTATCTGGCGATAA&lt;br/&gt; TGGAACTG</td></tr><tr><td>带有 3&amp;rsquo; 胺基修饰的寡核苷酸 (连接臂)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>GCTACTCACTCAGATAGGTGAC&lt;br/&gt; TGA/3AmMO/</td></tr><tr><td>Pierce 强离子交换离心柱</td><td>Fisher Scientific</td><td>90008</td><td></td></tr><tr><td>编码 SNAP T7 RNA 聚合酶和卡那霉素抗性基因的质粒</td><td>Genscript</td><td>N/A</td><td>定制基因插入片段</td></tr><tr><td>蛋白纯化柱 (HisPur Ni-NTA 离心柱)</td><td>Fisher Scientific</td><td>88226</td><td></td></tr><tr><td>rNTP 混合物</td><td>New England Biolabs</td><td>N0466S</td><td></td></tr><tr><td>Roche 小型快速 DNA 离心柱</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11814419001</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100 (Triton X-100)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-100ML</td><td></td></tr><tr><td>超低分子量 DNA Marker</td><td>Fisher Scientific</td><td>10597012</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>BioShop</td><td>URE001.1</td><td></td></tr></tbody></table>

dna锚定的rna聚合酶用于可编程的体外转录与分子计算

DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation

DNA 纳米技术能够实现核酸按照用户预设的形状和动态进行可编程的自组装，适用于多种应用。本研究展示了DNA纳米技术的概念可用于编程噬菌体来源的T7 RNA聚合酶（RNAP）的酶活性，并构建可扩展的合成基因调控网络。首先，通过表达N端带有SNAP标签的RNAP，并将其与苯甲基鸟嘌呤（BG）修饰的寡核苷酸进行化学偶联，从而构建寡核苷酸锚定的T7 RNAP。随后，利用核酸链置换反应实现对聚合酶转录活性的按需编程。此外，辅助性核酸组装结构可用于 &#34;人工转录因子&#34; 调控DNA编程的T7 RNA聚合酶与其DNA模板之间的相互作用。这种体外转录调控机制可实现多种电路行为，如数字逻辑、反馈、级联和多路复用。该基因调控架构的可组合性有助于设计的抽象化、标准化和规模化，这些特性将推动体外系统的快速原型构建&#160;用于生物传感、疾病检测和数据存储等应用的遗传装置。

<img alt="电泳凝胶蛋白质分析和荧光检测图表，显示 SNAP T7 RNAP 表达结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5：SNAP T7 RNAP 表达的 SDS-PAGE 分析及体外转录检测。 （A）SNAP T7 RNAP 蛋白纯化分析，SNAP T7 RNAP 分子量：119.4 kDa。FT = 柱流穿液，W1 = 含杂质的洗涤缓冲液洗脱组分，E1-3 = 含纯化产物的洗脱组分，DE = 10 倍稀释的去盐总洗脱液。使用 4–12% 预制 Bis-Tris 蛋白凝胶，染色剂：考马斯亮蓝，运行缓冲液：MES 缓冲液，电泳条件：200 V，35 分钟。（B）通过随时间测量荧光适体的生成量，对 SN...

我们描述了一种新型DNA锚定的T7 RNA聚合酶的构建方法，用于调控体外转录反应。本文讨论了蛋白质合成与表征的步骤，验证了转录调控的概念验证实验，并探讨了其在分子计算、诊断学以及分子信息处理中的应用。

DNA锚定的RNA聚合酶用于可编程的体外转录与分子计算

DNA纳米技术能够实现核酸按照用户预设的形状和动态进行可编程的自组装，从而用于多种应用。这项工作……

我们提出了一种利用人工核酸转录因子调控聚合酶活性的方法。这种基因调控结构可作为未来体外遗传装置的基本构建单元。通过将DNA结合域与T7 RNA聚合酶连接，该技术结合了基于DNA电路的可扩展性与转录电路的功能性。首先，将单链BG寡核苷酸用双蒸水稀释至终体积为50微升，按照表中所示的5:1至1:5倍比系列稀释，共制备九个不同浓度的稀释液。每种稀释液分别配制一个反应体系，每个体系包含2微升SNAP缓冲液、4微升BG寡核苷酸和4微升SNAP T7 RNAP。对照组中，RNAP对照以双蒸水替代寡核苷酸，DNA对照以双蒸水替代SNAP T7 RNAP。加入4 µL SNAP缓冲液和2 µL蛋白上样染料至每个样本中，共设置11个反应，每个反应加入2 µL样本。将反应体系在70°C加热10分钟，随后将每个样本取2 µL加样至4–12%的vitreous蛋白凝胶中，在冰上以200伏电压进行35分钟的凝胶电泳。电泳结束后，在摇床上用去离子水更换三次，每次至少洗涤10分钟，随后用氰染料染色15分钟以检测核酸。使用合适的凝胶成像系统对凝胶进行成像，然后用20毫升考马斯亮蓝对凝胶再次染色。染色一小时后，用双蒸水脱色至少一小时，然后再次对凝胶进行成像。对于寡核苷酸连接的SNAP T7纯化，首先通过将50微升1摩尔的痕量试剂与100微升5摩尔的氯化钠以及850微升双蒸水混合，配制洗脱缓冲液。接下来，将每个样品分别装入一个离子交换柱，并将离子交换柱放入单独的 2 毫升离心管中，通过离心用纯化缓冲液洗涤柱子，直至所有缓冲液从每个柱子中流出。按照三份纯化缓冲液与一份样品的比例，用纯化缓冲液稀释各样品，并向每个柱子中加入 400 微升样品。当所有缓冲液如所示完全流出后，收集并标记每个样品的穿流液。每次加入 400 微升纯化缓冲液，洗涤柱子三次，每次均需离心至缓冲液完全流出，并根据需要收集并标记穿流液。最后一次洗涤后，向柱子中心加入 50 微升洗脱缓冲液，通过三次离心将蛋白洗脱下来，每次离心至全部 50 微升缓冲液均被洗脱。每次离心后收集并标记洗脱液，最后一次离心后将所有洗脱液合并至同一管中，但每份洗脱液需保留少量用于凝胶分析。测定剩余洗脱液等分试样在260和280纳米处的吸光度，并按1:1比例向样品中加入甘油，用于-20摄氏度保存直至使用。使用500微升30千道尔顿的离心过滤装置，将总洗脱产物与2倍储存缓冲液进行缓冲液置换。然后按照所示方法测定吸光度。然后将甘油以1:1的比例加入产物中，用于-20摄氏度保存。为通过SDS-PAGE分析洗脱组分，在4至12%的凝胶中以200伏电压电泳35分钟，或直至染料前沿迁移至凝胶末端，同时使用适当的蛋白质分子量标准。为验证锚定RNAP的按需控制活性，将每种模板各2.4微升与5微升5x退火缓冲液及14.2微升双蒸水混合。将所得的一微摩尔双链DNA CAGE在75摄氏度孵育两分钟。以相同方式按照表格中所示条件，使启动子及孔雀石绿适体DNA模板的正义链与反义链退火。孵育结束后，以1:5的摩尔比将连接有SNAP标签的T7 RNA聚合酶（SNAP T7 RNAP）加入双链DNA CAGE中，使RNAP的终浓度为500纳摩尔。室温孵育15分钟后，将样品置于冰上，取2.5微升10x体外转录缓冲液，加入1微升25毫摩尔核糖核苷三磷酸、1微升1毫摩尔孔雀绿、2.5微升RNAP CAGE混合物、各2.5微升1微摩尔转录因子A和B的寡核苷酸链，以及3微升1毫摩尔孔雀绿适配体模板，用10微升双蒸水定容。另取15微升双蒸水，设置第二个反应体系，其中包含2.5微升10x体外转录缓冲液、1微升25毫摩尔核糖核苷三磷酸混合液、1微升1毫摩尔孔雀绿、2.5微升RNAP CAGE混合物，以及3微升1毫摩尔孔雀绿适配体模板。为设置仅含缓冲液的反应，将2.5微升10x体外转录缓冲液、1微升25毫摩尔核糖核苷三磷酸混合液、1微升1毫摩尔孔雀绿，以及3微升1毫摩尔孔雀绿适配体模板加入17.5微升双蒸水中混合。当所有反应体系制备完成后，将每个反应转移至384孔板中，并在荧光酶标仪上于37摄氏度条件下，以610纳米激发波长和655纳米发射波长连续监测孔雀绿绿素适体的转录过程，持续两小时。读数结束后，将孔板置于冰上，随后将每孔中的RNA产物在70摄氏度的TBE缓冲液中，通过变性12% TBE-尿素聚丙烯酰胺凝胶以280伏电压电泳20分钟，或直至染料前沿迁移至凝胶底部。然后，在旋转摇床上用氰基染料核酸染色剂染色10分钟，再按示例进行成像。通过 SDS-PAGE 可确认重组 SNAP T7 RNAP 蛋白的表达与纯化是否成功。SDS-PAGE 完成后，可通过体外转录反应验证其酶活性。BG 功能化寡核苷酸的成功连接可通过 18% 变性 TBE-尿素 PAGE 进行验证。与未修饰的寡核苷酸相比，将BG基团添加到寡核苷酸上会增加其分子量。如本代表性氰基染料染色凝胶所示，该凝胶用于确认DNA锚定的T7 RNA聚合酶从过量BG寡核苷酸中的纯化效果，初始穿流组分主要含有过量的BG寡核苷酸，以及少量未结合到阳离子交换树脂上的DNA锚定聚合酶。稀释后收集的组分中仅出现由氰基染料结合寡核苷酸连接臂所产生的单一RNAP寡核苷酸条带，而浓缩产物泳道则显示出相同但更深的条带，表明浓缩成功。考马斯亮蓝染色也观察到相同的条带模式，在未结合的RNAP对照中观察到轻微的凝胶迁移率偏移。此处显示了体外转录实时动力学实验结束时产生的荧光信号。在此分析中，荧光信号增强了336倍，表明对聚合酶活性实现了有效的调控。在尝试本方案时，请记住在进行核酸染色之前，必须彻底将凝胶中的SDS清洗干净。这是因为STS会将染料滞留在凝胶中，导致背景信号过高。将我们的方法应用于具有多个级联结构的大型基因回路时，将展示锚定式转录系统的可扩展性和可组合性。该技术目前正被用于开发能够进行神经网络式计算的基因回路。

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生物工程

DNA系留RNA聚合酶用于可编程体外转录和分子计算

本研究展示了如何在染色体水平上形成RNA/DNA杂交体，并揭示遗传信息从RNA向酵母细胞基因组DNA的转移过程。...

利用含RNA寡核苷酸转化法在基因组DNA中生成RNA/DNA杂交体

CRISPR/Cas 系统介导细菌和古菌的适应性免疫。许多 Cas 蛋白被认为可作为作用于不同长度 crRNA 前体的核糖核酸内切酶。本文中，我们展示了三种不同的方法，用于生成 pre-crRNA 底物，以进行 Cas...

CRISPR/Cas系统核酸内切酶的底物制备

锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）等设计核酸酶可通过激活非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）通路，对小鼠着床前胚胎的基因组进行修饰。这些技术进步使得能够快速生成具有精确遗传修饰的小鼠。...

利用设计核酸酶进行小鼠基因组编辑

DNA 折纸是一种通过编程 DNA 分子自组装来制备精确纳米级结构的强有力方法。本文描述了一种利用 DNA...

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本方案描述了一种从质粒中构建DNA链置换门并利用荧光动力学测量对其进行测试的方法。这些门可模块化地组合成多组分系统，以模拟形式化学反应网络（CRN）的行为，展示了将CRN作为分子编程语言的一种新用途。...

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真核生物中转录错误的全基因组监测

本文描述了仅需短合成DNA和RNA寡核苷酸以及纯化的RNA聚合酶II（Pol II）即可组装Pol II延伸复合物的方法。这些复合物可用于研究与Pol...

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利用无细胞系统快速表征遗传元件

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两亲性DNA纳米结构构建的合成凝聚体与类细胞结构

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