类器官来源的上皮单层：一种用于肠道屏障功能研究的临床相关体外模型

类器官来源的单层细胞能够重现患者的肠道上皮屏障功能，并可用于测试旨在改善每位患者功能障碍的治疗手段，从而确定个体化的治疗策略。类器官单层培养使研究人员能够接触上皮的顶膜侧——即损伤发生的一侧，而在以三维结构生长的类器官中，该表面通常处于封闭且不可及的状态。每个类器官均具有独特性，因此研究面临挑战。

为形成紧密的单层，应使用处于增殖期的类器官，并快速消化以形成由两到四个细胞组成的细胞簇。针对每种模型均需进行细胞接种量的优化。本实验操作将由HUB的高级研究助理Wies Van Dooremalen进行示范。

首先用细胞外基质（ECM）包被膜插件。在生物安全柜中操作，将膜插件放入支撑板中。用预冷的含钙和镁的DPBS将ECM稀释40倍，然后吸取150微升稀释后的ECM加入每个插件的顶室中。

将培养板在37摄氏度下孵育至少一小时。为准备细胞接种，将一份细胞解离试剂在37摄氏度水浴中预热。每六孔板的每个孔使用2毫升试剂。

将含有类器官的培养板从培养箱转移至生物安全柜中。按照文本稿件中所述方法处理类器官，但不要将多个管中的样品合并至同一管中。收集类器官后，加入基础培养基或BM至12毫升，以85 × g离心，然后吸除上清液。

向含有类器官的离心管中加入最多12毫升的DPBS，使用10毫升移液器上下吹打10次。在8°C条件下以85 × g离心5分钟，并在不扰动类器官沉淀的前提下吸除上清液。向类器官中加入预热的细胞解离试剂并重悬，然后将离心管倾斜或水平放置，在37°C水浴中孵育5分钟。

孵育结束后，使用5毫升无菌塑料移液管或P1000移液器轻轻吹打10次。在显微镜下观察类器官悬浮液，检查是否已形成由单个细胞和部分由2至4个细胞组成的细胞团混合的悬浮状态。向细胞悬浮液中加入最多12毫升含ROCK抑制剂的BM培养基，以终止细胞解离。

离心细胞，然后吸走上清液，注意不要扰动细胞沉淀。当在多个试管中处理相同的类器官培养物时，先将细胞沉淀汇集，再重悬于12毫升BM中。将细胞悬液通过预先用BM润湿的40微米滤网过滤，收集滤过液至50毫升锥形管中，然后用10毫升BM洗涤滤网，并将洗涤后的滤过液收集至同一管中。将过滤后的细胞悬液转移至两个新的15毫升锥形管中，重复离心步骤。

吸除上清液，注意不要扰动细胞沉淀，然后将细胞重悬于4毫升IEM培养基中，每份用作起始材料的完整培养板需添加10 µM ROCK抑制剂。取少量细胞悬液与台盼蓝按1:1比例混合进行细胞计数，计数活细胞总数，对小细胞团中的每个单个细胞均需计数。制备细胞悬液，使其浓度为每毫升含3×10⁶个活细胞，悬液使用含10 µM ROCK抑制剂的IEM培养基。

接种细胞时，小心吸除ECM包被的插入式培养小室中的DPBS，保持培养板水平。用移液器将800微升添加了ROCK抑制剂的IEM培养基加入每个基底外侧室，再将150微升已制备的细胞悬液逐滴加入上皮室中ECM包被的膜表面。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育。

待细胞沉降至膜上后，每天测定跨上皮电阻（TEER），并使用显微镜观察膜插件。为更新单层细胞，移除含有膜插件的培养板中基底外侧区室的培养基，然后小心抽吸顶侧区室的培养基。向每个顶侧区室逐滴加入150微升新鲜IEM，向每个基底外侧区室加入800微升新鲜IEM。

若使用手动TEER仪，先用70%乙醇清洁电极，并在生物安全柜内晾干，然后将电极放入含有基础培养基（BM）的试管中。将电极连接至手动TEER仪，将功能开关调至欧姆（ohms）测量档位，并打开电源开关。将短电极置于插入式培养小室的顶端室（apical compartment），长电极置于基底外侧室（basolateral compartment），注意避免接触单层细胞。先测量空白孔的电阻，再依次测量其余样品。

在不同条件的样品之间，用 BM 清洗电极。实验结束后，依次用去离子水和70%乙醇清洁电极，然后使其自然风干。本方案用于获取肠道类器官并制备上皮细胞单层。

此处展示的是在 IEM 中培养八天的单层细胞。当单层细胞暴露于肠上皮细胞分化培养基（EDM）时，可观察到某种结构；而暴露于组合培养基（CDM）的单层细胞则显示出更平滑的结构。通过测量跨上皮电阻（TEER）可对单层细胞的形成进行定量监测。

完全融合的单层细胞经测量其跨上皮电阻（TEER）值约为100 ohms·cm²，当暴露于任一分化培养基时，该值会升高。所有培养条件下的单层细胞对荧光黄的表观通透性均较低。在IEM中培养的回肠单层细胞产生的溶菌酶分泌量高于在IEM中培养至融合后，再于EDM或CDM中继续培养4天的单层细胞。

在IEM、IEM加后续EDM或IEM加后续CDM中培养的单层细胞表现出形态学差异，这通过H&E、Ki67、MUC2和阿尔新蓝染色观察到。分化后，与IEM条件下相比，增殖细胞减少，而杯状细胞和肠上皮细胞标志物基因表达增加，如LGR5、MUC2和碱性磷酸酶基因表达所示。在制备单层细胞时，重要的是在消化类器官后防止其发生失巢凋亡。

此外，细胞外基质应在Transwell膜上均匀分布。类器官来源的单层细胞可用于以患者特异性的方式，利用不同的荧光底物评估分子转运。