一种使用多柱板适配器的经济且通用的高通量蛋白质纯化系统

一种使用多柱板适配器的经济且通用的高通量蛋白质纯化系统。您好，蛋白质纯化对于研究蛋白质的结构与功能至关重要，通常需与生物物理技术联用。

在功能蛋白质组学时代，这一技术尤为重要，因为功能蛋白质组学需要高通量的蛋白质生产。我们假设，多柱板适配器（MCPA）能够将含有不同树脂的多个层析柱与多孔板连接，从而实现并行纯化。利用该适配器，我们开发出一种经济且多功能的蛋白质纯化方法，该方法可在重力或真空条件下操作，其纯化速度可与自动化系统相媲美。

本文展示了镍亲和层析和离子交换层析的该方法。通过将带有穿孔的密封垫放置在长滴板上组装MCPA，然后将所需数量的层析柱插入密封垫的孔中。在多联装置底部放置开放的收集板，并盖上多联装置的上部以封闭装置。

连接管路，并将组装好的MCPA连同色谱柱置于顶部。用移液器向色谱柱中加入1.2 mL的镍-NTA溶液。移液过程中，确保珠粒始终保持充分混匀状态。

开启泵，使20%乙醇流经柱子并进入下方的收集板中。液体流完后关闭泵。将收集板中的内容物弃置到废液箱中。

向所有柱中加入三倍树脂体积的EDTA缓冲液。打开泵，使液体流过柱子。现在用三倍树脂体积的0.5摩尔氢氧化钠缓冲液洗涤柱子。

用四个柱体积的100毫摩尔硫酸镍洗涤层析柱，然后用十个柱体积的超纯水洗涤。如果柱流速较慢，可用注射器活塞推动液体通过。将收集板中的液体倒入废液箱中。

然后用四倍树脂体积的10毫摩尔咪唑洗涤缓冲液将柱子洗涤两次，并清空收集板。如果同时纯化多个样品，需将敞口收集板更换为48孔板。关闭真空，将裂解液加入到柱子中。

使用细塑料搅拌棒轻轻混合柱中的珠子与裂解液，以最大限度促进结合。打开泵，使液体流过柱子。如果柱子发生堵塞，将裂解液-树脂混合物转移至装有新滤膜的新柱中。

冷冻收集板以保留流穿液。更换为敞口收集板，然后用九倍树脂体积的10毫摩尔咪唑洗涤缓冲液洗涤层析柱。重复此步骤四到五次。

为避免溢出，需定期清空废液板。将开放的收集板更换为 96 孔板，确保 A1 孔位于左上角。向各柱中加入一体积的变性洗脱缓冲液。

将液体过柱，检查收集板，确保各孔之间无交叉污染。进行下一次稀释时，重复前述步骤，并收集至新的收集板中。每份洗脱液取50 µL用于纯度和浓度分析。

接下来，用两毫升20%乙醇洗涤层析柱。向层析柱中再加入两毫升20%乙醇，并使用新的细塑料搅拌棒在乙醇中充分混匀珠子，然后转移至50毫升离心管中，在4°C条件下保存。将MCPA组装到真空抽滤装置上，使用开放式的收集板，并在所有层析柱中插入注射器推杆。

将前排所有注射器的活塞全部移除。从一个五毫升注射器的活塞上取下橡胶垫圈，然后在其中心位置刺一个小孔。接着将一个开放柱的底部穿过被刺穿的橡胶垫圈。

重复这些步骤，并将溶液加入前排各列。确保Q琼脂糖珠充分混匀。使用从底部剪去两厘米的蓝色吸头，移取800微升Q琼脂糖珠至开放柱中。

当磁珠完全沉降至柱底后，开启真空泵，使20%乙醇过柱。用两毫升10毫摩尔Tris缓冲液洗涤柱子两次。在Tris缓冲液即将流尽之前关闭真空泵，以防止树脂干燥。

弃去流出液，并更换为48孔收集板。将所有待纯化的样品转移至第一排的Q Sepharose柱中，用一根细塑料搅拌棒混匀样品与树脂约两分钟，然后开启真空泵。收集或冻存穿流液以备后续分析。

打开收集板，用两毫升 10 毫摩尔 Tris 溶液将柱子洗涤两次。将打开的收集板替换为 96 孔板。第一洗脱组分可收集于第一排或第二排。

在第二排进行洗脱时，从这些位置取下注射器推杆。将Q Sepharose柱移至这些位置，然后将注射器推杆插入第一排的空柱中。用移液器将1毫升第一种盐浓度溶液加入Q Sepharose柱中。

打开泵并收集洗脱液。要收集下一个洗脱组分，需从下一个位置取下注射器推杆，将Q Sepharose柱移至这些位置，然后将推杆重新插入之前的位置。针对用于洗脱的每一种连续递增的盐浓度，重复上述步骤。

每次进行四次洗脱时均需使用新的收集板，并对每块板进行标记和储存。打开收集板后，用两毫升4摩尔氯化钠、10毫摩尔Tris溶液洗涤柱子。再用移液器加入两毫升20%乙醇，使其流过柱子直至液面略高于珠子，然后密封柱子以供储存。

例如，MCPA 已成功在变性条件下通过镍-NTA 纯化了 14 种 AbpSH3 突变体。在 25 千道尔顿时可见少量杂质，但蛋白质仍保持高度纯度。在变性条件下观察到的少量杂质在天然条件下会被去除。

当纯化11种不同的SH3结构域时，这一结果得到了验证。这表明MCPA可用于比较不同的纯化条件。AbpSH3可通过离子交换纯化法从裂解物中与大部分污染物分离。

获得了较高产量的AbpSH3蛋白，纯度较好，但含有多种高分子量杂质。通过镍-NTA初步纯化后，再使用MCPA进行离子交换层析，成功去除了这些高分子量杂质。尽管仍存在轻微污染，但各组分总体纯度较高，已可用于核磁共振（NMR）和热化学变性实验，并获得了良好的生物物理数据。

综上所述，我们的结果表明，我们的假设是正确的，MCPA 能够利用不同的色谱技术成功纯化毫克级的蛋白质。在同一运行中，MCPA 系统可通过多种方式进行配置，以优化纯化条件。该系统操作简便、成本低廉，且易于培训无经验的用户，尤其适用于那些不常规进行蛋白质纯化的实验室。