Name: 鸡卵外胚胎和脉络膜尿囊血管的制备作为体内模型，用于对比增强超声成像和微泡介导的药物递送研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 学习制备5至8日龄鸡胚及其绒毛尿囊膜作为体内模型，用于对比增强超声成像和微泡介导的药物递送研究。该方法仅需基础实验工具，适用于血流成像和新型超声造影剂研究。

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本工作由荷兰科学研究组织（NWO）下属的应用与工程科学部门（TTW）（Vidi项目17543）资助。作者谨此感谢来自荷兰鹿特丹伊拉斯姆斯医学中心生物医学工程系的Robert Beurskens、Luxi Wei和Reza Pakdaman Zangabad，以及实验医学仪器系的Michiel Manten和Geert Springeling在技术方面提供的支持。

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案介绍了三种获取和使用5至8日龄鸡胚及其绒毛尿囊膜（CAM）作为体内&#160;模型来研究对比增强超声成像和微泡介导药物递送的方法。取出5日龄（第1.2节）和6至7日龄（第1.3节）鸡胚时最关键的步骤是：1）在蛋壳顶部开一个小孔，穿透整个蛋壳进入气室，然后再抽取蛋清；2）在蛋壳上开一个大窗口时，需形成光滑的边缘。对于取出8日龄鸡胚的方法（第1.4节），最关键的步骤是：1）制作足够数量的压痕，以便沿蛋壳形成整齐的裂纹；2）保持蛋体浸没在PBS中。为确保所有方法中鸡胚的存活率，必须将蛋及其内容物维持在37 °C。此外，应避免将物质注射到CAM的动脉中。建议在实验过程中通过视觉监测鸡胚的心率，以确保其生命活力。为确认鸡胚确切的发育阶段，可参考Hamburger &amp; Hamilton22&#160;的分期标准。
必须防止对胚胎、绒毛尿囊膜（CAM）和卵黄囊造成损伤。此类损伤可能影响胚胎和CAM的存活能力、血流状况以及可视性。此外，卵黄囊受损会导致膜的刚性降低，从而使向CAM血管内注射成为不可能。5日龄胚胎的气室相对较小，因此为了能够打开蛋壳上足够大的孔以移除蛋内容物，需要先抽出2 mL的蛋清。这样可在蛋壳与胚胎之间创造更多空间。抽出蛋清后，需用胶带封闭针头穿刺的孔洞。如果仍有蛋清渗出，应再贴一块胶带。此外，在侧面的孔洞上贴胶带可在蛋内形成负压，从而在步骤1.2.2.8中打开大孔时，防止蛋内容物因自身重量而掉落。当蛋壳边缘过于锋利，或在将蛋内容物倒入称重皿时操作过于剧烈时，也可能造成胚胎或CAM的损伤，因此操作时应使蛋壳尽量贴近称重皿。在胚胎发育的第5至第6天期间，CAM开始附着于壳膜32。这种附着增加了在取出蛋内容物时损伤胚胎和CAM的风险。通过在向蛋内注射PBS后打开6至7日龄孵育的鸡蛋，或将8日龄孵育的鸡蛋置于盛有PBS的容器中再打开，可降低损伤风险。关于向CAM静脉注射：若首次注射失败，且损伤较轻微，可在同一静脉的上游位置进行第二次注射；也可选择另一条CAM静脉进行注射。将胚胎和CAM与卵黄分离后，胚胎和CAM的血管会变得光学透明。但由此导致胚胎失去了主要的营养来源33。这种营养缺失可能是观察到分离后胚胎心率下降至80 bpm（相比之下，仍与卵黄接触的6日龄胚胎心率约为190 bpm）30&#160;以及分离操作后存活时间缩短至2小时的原因之一。另一个可能影响心率降低和存活时间缩短的因素是难以维持分离卵黄后的胚胎和CAM血管处于37 °C的环境。使用显微镜载物台培养箱可能有助于维持温度。此外，CAM从卵黄脱离后，组织可能发生机械性变化，因为膜张力会降低。膜张力的降低可能导致血管内壁剪切速率升高，从而引起心率下降。
鸡胚的 ex ovo 模型及CAM血管作为体内模型存在一些局限性，例如仅能进行短时间观察，限制了其在增强超声成像和微泡介导药物递送研究中的应用。由于第5天的血容量仅为100±23 µL，第6天为171±23 µL34，因此最大注射体积约为5 µL。在发育的后期阶段（第7天及以上），血管刚性增加，卵黄弹性下降，这可能导致在较老的胚胎中成功注射更加困难。一旦注射微泡，它们可在体内循环数小时，因为在此阶段鸡胚尚未发育完全的免疫系统35。因此，微泡不会像在人体中那样在约6分钟内被清除36,37&#160;，使得典型的超声分子成像研究中所需的5–10分钟等待未结合的靶向微泡被清除的步骤无法实现38&#160;。为了实现微泡的靶向，需要使用能够结合禽类内皮细胞的合适配体，例如先前报道的针对血管生成标志物αvβ3的配体7。使用该模型时还需考虑其他因素，包括在较老的胚胎（&#62; 8天）中将胚胎和CAM血管从卵黄分离的难度增加，以及与人类相比更低的红细胞压积（约20%）39&#160;。后者可能影响微泡的振荡行为，因为已知在黏度更高的环境中微泡振荡会受到抑制40。CAM动脉的氧合程度低于CAM静脉41,42。当研究血氧饱和度的光声成像时，应考虑这一差异。
本文所述方法允许在超声成像或药物递送研究当天（通常为孵化第5至第8天）将鸡胚内容物从蛋壳中取出。这与现有方法不同，现有方法是在孵化3天后即将内容物取出蛋壳，并继续进行ex ovo&#160;培养18,20,21。本方法的优势包括：孵化5天、6天、7天和8天的鸡蛋在取出后存活率分别达到90%、75%、50%和60%，相比之下，孵化3天后取出蛋壳并继续ex ovo培养的胚胎存活率约为50%1,18&#160;；培养过程中无需使用抗生素18,20&#160;；且无需大型无菌培养箱进行ex ovo培养。6至8天龄胚胎的存活率较低，原因是绒毛尿囊膜（CAM）开始附着于蛋壳21&#160;，导致在取出过程中CAM膜更容易破裂。本文还描述了将胚胎及CAM与卵黄分离的方法，从而使胚胎和CAM在光学上呈现透明状态。
通过将蛋内物质置于不同的实验装置中，鸡胚及其绒毛尿囊膜（CAM）可用于多种超声成像研究，包括二维和三维条件下的血管内超声（IVUS）、光声成像，以及使用或不使用超声造影剂的成像。研究重点可放在开发新型超声脉冲方案或测试新型换能器上。此外，该模型还可用于研究新型超声造影剂及其在血流条件下血管内的行为。由于微泡介导的药物递送机制尚未明确43，使用 体内 CAM 模型有助于通过研究微泡行为与细胞反应之间的关系来阐明其作用机制。最后，CAM 血管已被证实是研究异种移植肿瘤移植的合适体系。44这使得利用CAM血管作为模型成为可能，可用于通过超声成像研究肿瘤，以及通过对比增强超声（CEUS）研究肿瘤内部的血流情况。肿瘤通常移植于8至9日龄胚胎的CAM血管上。1,14,45，其中的胚胎&#160;在孵化第3天从蛋壳中取出并继续发育 体外本方案中所述方法可用于胚胎的培养 在卵内 直到肿瘤发生的当天&#160;嫁接
作者相信，本文将对希望利用鸡胚及其绒毛尿囊膜（CAM）作为对比剂应用和血流研究的体内&#160;模型的研究人员有所帮助。

Ex ovo 鸡胚及其富含血管的尿囊绒毛膜（chorioallantoic membrane, CAM）已被证实是研究多种生物学和生物医学过程（如胚胎发生、肿瘤学和药物递送）的合适模型1,2,3,4。超声技术已被用于胚胎心脏发育的成像4,5&#160;，也可在注射微泡等空化核后通过超声激活实现血管内药物递送6,7。与其他动物模型相比，鸡胚成本低廉，所需基础设施和设备较少，且受到的法规限制更为宽松8。打开蛋壳后，鸡胚及CAM血管易于接触，而哺乳动物胚胎和血管则难以实现类似操作。此外，鸡胚及CAM血管具有心跳和脉动性血流。CAM在血管解剖结构上与哺乳动物具有相似性，可用于药物筛选8,9,10。由于这些特性，CAM血管也被证实是研究超声造影成像（contrast enhanced ultrasound imaging, CEUS）的合适模型11,12,13,14,15,16。此外，该模型还可结合超高速相机，在超声场中光学观察超声造影剂的行为，以及声辐射力对药物推进、结合和外渗作用的影响7,17,18,19。尽管鸡胚和CAM不适合长期实验，但其在短期in vivo实验中具有显著优势。
为了在实验过程中提高鸡胚及绒毛尿囊膜（CAM）的可见性和可控性，将含有鸡胚和CAM的蛋内容物从蛋壳中取出至关重要。18既往涉及超声造影剂的鸡胚研究多采用5至6日龄的胚胎7,11,12,17,19&#160;14至18日龄的胚胎13,14,15,16已有多种方法被详细描述，用于将蛋内容物从蛋壳中取出18,20,21然而，据我们所知，先前已发表的方法主要集中在孵化3天后（即Hamburger &amp;#38; 哈密顿（HH）第19-20期22），并继续培养 体外。这一点 体外 培养方法存在多种缺点，包括培养过程中死亡风险增加（约50%）1,18，抗生素的使用18,20，与之相比，总血管长度减少 在卵内 生长23由于在蛋壳内培养胚胎能够提供最接近自然的环境，因此将胚胎在蛋壳内孵育至实验当天是最简便的方法。因此，在孵化第5至第8天将蛋内容物从蛋壳中取出的操作方法，尤其适用于针对5至8日龄胚胎的实验研究。
在本实验方案中，我们描述了三种方法，用于在胚胎发育第5至8天（HH 26-3522）时将卵内容物从蛋壳中取出，同时允许胚胎在蛋壳内继续发育至实验当天。在8日龄胚胎的微小毛细血管中，CAM血管直径范围为10–15 µm24&#160;，而在6日龄和8日龄胚胎的较大血管中，直径可达115–136 µm24,25。所描述的三种方法仅需使用基本的实验室工具，且可降低实验开始前发生并发症的风险，从而减少不必要的成本和劳动。我们还详细说明了一种将含有胚胎和CAM的膜与卵黄囊分离的方法，从而使CAM在显微镜观察下具有光学透明性。由于含有胚胎和CAM的膜可以固定在例如带有声学膜的支架上，该装置也可实现声学透明26，当光路受到卵黄影响时，可实现显微成像与超声成像的联合应用。最后，我们描述了其他几种可用于超声或CEUS成像的超声装置设置方案。

<table><tbody><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>止血钳（Kocher钳）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>保鲜膜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>带声学膜的支架（CLINIcell 25 cm²）</td><td>MABIO，法国图尔宽</td><td>CLINIcell25-50-T FER 00106</td><td></td></tr><tr><td>去离子水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>一次性塑料巴斯德吸管</td><td>VWR</td><td>612-1747</td><td></td></tr><tr><td>鸡蛋</td><td>荷兰Drost Pluimveebedrijf Loenen BV</td><td>新鲜受精卵</td><td></td></tr><tr><td>15 &amp;deg;C 冰箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃毛细注射针</td><td>Drummond</td><td>1-000-1000</td><td>内径：0.0413 英寸</td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C 加热板</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C 湿化培养箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>昆虫标本针</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>金属蛋托</td><td></td><td></td><td>由伊拉斯谟医学中心实验医学仪器部门定制。见图1 A、B</td></tr><tr><td>金属称量舟支架</td><td></td><td></td><td>由伊拉斯谟医学中心实验医学仪器部门定制。见图1 C、D</td></tr><tr><td>显微注射系统</td><td>FUJIFILM VisualSonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410-100ML</td><td></td></tr><tr><td>针头，19 G</td><td>VWR (TERUMO)</td><td>613-5392</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS），1×</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>培养皿，1 L</td><td></td><td></td><td>玻璃材质</td></tr><tr><td>培养皿，90 mm 直径</td><td>VWR</td><td>391-0559</td><td></td></tr><tr><td>临床前动物超声成像系统（Vevo 2100）</td><td>FUJIFILM VisualSonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>探头（MS250）</td><td>FUJIFILM VisualSonics</td><td></td><td>发射频率30 MHz，接收频率15 MHz</td></tr><tr><td>探头（MS550s）</td><td>FUJIFILM VisualSonics</td><td></td><td>发射频率40 MHz</td></tr><tr><td>手术刀</td><td>VWR (SWANN-MORTON)</td><td>233-5363</td><td></td></tr><tr><td>小型剪刀</td><td>精细科学工具（FST）</td><td>14558-09</td><td></td></tr><tr><td>注射器，5 mL</td><td>VWR (TERUMO)</td><td>613-0973</td><td></td></tr><tr><td>汤匙</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>胶带（Scotch Magic 胶带）</td><td>Scotch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>纸巾</td><td>Tork</td><td></td><td></td></tr><tr><td>大镊子&amp;nbsp;</td><td>VWR (USBECK Laborger&amp;auml;te)</td><td>232-0107</td><td>见图1E</td></tr><tr><td>小镊子</td><td>DUMONT Medical，瑞士</td><td>0103-5/45</td><td>见图1F</td></tr><tr><td>超声造影剂（定制F型）</td><td></td><td></td><td>制备方法见：Daeichin, V. 等. Microbubble Composition and Preparation for Imaging: In Vitro and In Vivo Evaluation. IEEE TRANSACTIONS ON ULTRASONICS. 64 (3), 555&amp;ndash;567 (2017)。</td></tr><tr><td>超声造影剂（MicroMarker）</td><td>FUJIFILM VisualSonics, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超声造影剂（Definity）</td><td>Lantheus Medical Imaging，美国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超声耦合凝胶</td><td>Aquasonic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>石蜡膜（Parafilm）</td><td>Parafilm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>称量舟（85 &amp;times; 85 &amp;times; 24 mm）</td><td>VWR</td><td>611-0094</td><td></td></tr></tbody></table>

鸡胚尿囊外胚胎及绒毛尿囊膜血管的制备作为增强超声成像与微泡介导药物递送研究的活体模型

The Preparation of Chicken Ex Ovo Embryos and Chorioallantoic Membrane Vessels as In Vivo Model for Contrast-Enhanced Ultrasound Imaging and Microbubble-Mediated Drug Delivery Studies

鸡胚及其富含血管的尿囊绒毛膜（CAM）是研究生物医学过程、新型超声脉冲方案，以及用于造影增强超声成像和微泡介导药物递送的新型换能器的一种有价值的体内模型。采用该模型的原因在于鸡胚及CAM血管网络易于接近，且模型成本较低。获得鸡胚和CAM血管通路的关键步骤之一是将蛋内容物从蛋壳中取出。本方案描述了在孵化第5至&#160;8天之间将蛋内容物从蛋壳中取出的三种方法，从而使胚胎可在蛋壳内正常发育至这些时间点。所描述的方法仅需简单的工具和设备，相较于体外（ex ovo）培养的胚胎（约50%），其孵化后胚胎存活率更高，分别为：5日龄90%、6日龄75%、7日龄50%、8日龄60%。本方案还介绍了如何将空化核（如微泡）注射到CAM血管系统中，如何将含有胚胎和CAM的膜与其他蛋内容物分离以进行光学透明研究，以及如何在多种短期超声实验中使用鸡胚和CAM模型。体内&#160;鸡胚与CAM模型对于研究新型成像方案、超声造影剂、用于造影增强超声成像的超声脉冲方案，以及揭示超声介导药物递送的机制具有重要意义。

在此方案中，我们描述了三种在孵化第5至8天（HH 26-35）将蛋内容物从蛋壳中取出的方法22). 图6 显示从蛋壳中取出后置于称量舟中的蛋内容物。5日龄胚胎及尿囊绒毛膜（CAM）图6A) 采用1.2节所述方法取出。6天和7天的胚胎及CAM（图 6B, C) 采用1.3节所述方法取出。8日龄胚胎及CAM（图6D) 采用1.4节所述方法取出。未观察到出血或对胚胎及绒毛尿囊膜（CAM）造成损伤，表明这些方法可在不损害胚胎或CAM血管的情况下安全地将蛋内容物从蛋壳中取出。若操作得当，针对5日龄胚胎的方法在所有操作中可使90%的胚胎保持存活且CAM完整。存活率基于成功从蛋壳中完整提取的受精蛋总数。采用第二种方法处理孵化6天和7天的鸡蛋时，6日龄胚胎的存活率及CAM完整性约为75%，7日龄约为50%。采用第三种方法处理8日龄胚胎时，胚胎存活且CAM完整的概率约为60%。5日龄与8日龄胚胎之间可观察到发育阶段的差异，这与Hamburger和Hamilton的分期标准一致。22胚胎的大小和CAM血管的复杂性在发育过程中均逐渐增加（图6A- D). 图 6C 显示在卵内容物上方有一薄层琼脂糖，可利用所示的超声成像装置对胚胎和尿囊膜（CAM）进行成像 图5C取出蛋内容物后，胚胎的心跳可用肉眼观察到。这些胚胎的心率 体外孵化 胚胎与 在卵内 胚胎在第5天为183次/分钟（bpm），至第8天增至约208 bpm30. 保持湿润并置于 37 °C在实验性超声设置中，胚胎将维持此心率约5小时。
在前述三种方法的操作过程中可能会出现多种并发症。图7A 显示尿囊膜（CAM）下方存在 trapped air，这会使胚胎不适合进行超声成像，同时气泡的压力也可能损伤胚胎和/或尿囊膜。该问题通常发生在将蛋内容物从蛋壳中取出时，蛋壳内部的气室未能与外界空气连通所致。图7B 显示在图像右上方卵黄囊处有少量卵黄泄漏。这种情况可能在取出蛋内容物时发生，原因包括蛋壳的锋利边缘损伤卵黄囊，或镊子刺破卵黄囊。卵黄泄漏会影响胚胎及尿囊膜血管的可视性。图7C 显示一个尿囊膜下方 trapped air bubble 的胚胎，这种情况有时在胚胎发育过程中自然发生。另一种可能出现的并发症是血管损伤，这种损伤可能在取出蛋内容物时或注射操作过程中造成（图7D）。此外，胚胎和血管也可能随着时间推移而干燥（图7E），这通常是因为未向蛋内容物滴加 PBS 所致。胚胎干燥可导致大量毛细血管阻塞（图7F），从而影响胚胎的存活能力。此类严重的毛细血管阻塞也可能在胚胎发育过程中发生，或与胚胎心率不稳定有关。
在不损伤蛋壳的情况下取出蛋内容物后，可对胚胎注射例如微泡等超声造影剂（图3C）。图8 显示注射后微泡在血管腔内循环的情况。这些微泡随血流移动，并可在血液循环中持续存在数小时（补充视频 1）。微泡在循环系统中的存在使得开展多种类型的超声造影（CEUS）及药物递送实验成为可能7,11,12。鸡胚尿囊膜（CAM）是研究新型超声造影检测方法的理想模型，本文展示了三个示例。图9A 显示了6日龄鸡胚在注射微泡前后以B模式和CEUS模式采集的高频超声次谐波成像结果。实验中向CAM血管内注射5 µL超声造影剂，并使用配备MS250探头的临床前动物超声成像系统进行成像（发射频率30 MHz，接收频率15 MHz，输出功率10%）。在注射微泡前，B模式图像中已可在胚胎心脏内观察到一定对比信号（图9A-I）。这一现象源于鸟类红细胞含有细胞核，从而增强了超声成像中血液的对比度5,31。加入微泡后，胚胎在B模式和CEUS成像中的对比度和可见度均得到提升。图9B 展示了6日龄胚胎及其周围血管的光学图像与高频三维次谐波成像结果。实验中向CAM注射5 µL超声造影剂，并使用配备MS550s探头的临床前动物超声成像系统进行成像（发射频率40 MHz，峰值负压约300 kPa）。结果表明，结合造影剂的CEUS成像可用于生成高频三维次谐波图像，并实现胚胎外血管的可视化。图9C 展示了6日龄胚胎CAM微血管的光学图像与使用定制探头采集的超谐波血管内超声（IVUS）图像（发射频率26 MHz，接收频率39 MHz和65 MHz）。向CAM血管注射了4 ± 1 µL超声造影剂。光学图像与IVUS图像来自同一胚胎的相同感兴趣区域，显示了对应的血管网络结构。
鸡胚及CAM血管也可用于研究超声介导的药物递送，本文展示了一个示例。由于卵黄在成像过程中会阻碍光路，因此有必要去除卵黄囊，以便对鸡胚和CAM血管中的药物递送进行光学观察。本研究中，按照2.2节所述方法，将含有鸡胚和CAM的膜与卵黄囊分离，以制备用于显微成像的样本图4C）。在这些胚胎中，心率稳定在约80 bpm，当保持在特定条件下时，胚胎可存活长达2小时 37 °C7. 图10 展示了在CAM血管内皮细胞中进行的超声联合微泡介导的药物递送研究。使用α靶向血管壁的脂质包覆微泡vβ3-抗体并用荧光染料DiI染色7，被注射到CAM血管中（图10A, C）。CAM 血管内皮细胞的细胞核用 Hoechst 33342 染色（图10B）并使用模型药物碘化丙啶（PI）来观察声致穿孔现象7。这两种染料与微泡同时注射。在超声处理（1 MHz，200 kPa 峰值负压，单次脉冲1000个周期）后，可观察到靠近靶向微泡的细胞核出现PI摄取现象图10D这表明，超声诱导的靶向微泡振荡能够在内皮细胞膜上形成孔隙。
<img alt="用于尺寸参考的金属铸造模具和工具及标尺；标注 A-F 的实验装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62076/62076fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1．胚胎制备设备。（A-B）金属蛋托的俯视图和侧视图，（C-D）金属称量舟托架的俯视图和侧视图。（E-F）用于将蛋内容物从蛋壳中取出的镊子。比例尺单位为 cm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62076/62076fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="卵注射过程，注射器注射，蛋壳穿透，发育生物学实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62076/62076fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2．胚胎取出操作流程。（A）蛋顶部的小凹陷，由黑色圆圈标示。（B）位于蛋下方约 2/3 处的小凹陷，由黑色圆圈标示。（C）抽出约 2 mL 蛋清。（D）侧面用胶带封住的缝隙。（E）扩大蛋顶部的小开口。（F）去除部分蛋壳后，胚胎变得可见。（G–H）将蛋旋转 180° 后，胚胎上浮并逐渐不可见（箭头指示胚胎移动方向）。1–2 分钟后，从底部无法看到胚胎。（I）刮除膜后，蛋内容物落入称量舟中。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62076/62076fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="显微注射装置；移液管尺寸比较、精细操作、显微镜下的注射部位。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62076/62076fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3．将微泡注入 CAM 血管。（A）玻璃毛细移液针。比例尺单位为 cm。（B） 注射前吸取用的碘化丙啶（PI）溶液（左侧液滴）和微泡（右侧液滴）。右上角可见黑色轮廓标示的注射针 （C） 微泡注射。毛细针尖置于静脉管腔内（左图）。微泡（箭头所示白色云状物）被注入并随血流扩散（右图）。比例尺代表 1 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62076/62076fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="体外血管生成实验装置：四阶段胚胎卵膜实验研究示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62076/62076fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4．从卵黄囊中取出胚胎及绒毛尿囊膜（CAM），并放置于带有声学膜的支架上。（A） 带有琼脂糖层的声学膜支架。（B） 切割前置于称量舟中的鸡胚胎及CAM血管结构。虚线表示围绕CAM的切割线。（C） 已从卵黄分离并固定在声学膜上的鸡胚胎及CAM。（D） 固定好的鸡胚胎，其上覆盖带有声学和光学透明膜的支架（蓝色），该支架置于CAM上方。支架内可注入去离子水，以便使用浸水物镜。所有比例尺均为 1 cm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62076/62076fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="水产养殖系统：数据分析、孵化、胚胎观察；装置包括水箱、显微镜、相机。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62076/62076fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5．鸡胚及绒毛尿囊膜（CAM）超声成像的不同装置示意图。（A） 侧面超声成像装置。将鸡胚置于定制的称量舟中，称量舟一侧为声学透明壁，并将整个装置放入37 °C水浴中。超声换能器置于左侧（a）声学透明壁旁，激光器（b）用于上方的光声成像。（B） 顶部超声成像装置。鸡胚及绒毛尿囊膜浸没于盛有磷酸盐缓冲液（PBS）的烧杯中，烧杯置于37 °C水浴内。虚线轮廓显示外部为2 L玻璃烧杯（a），内部为500 mL玻璃烧杯（b）。（C） 配备可移动换能器的顶部超声成像装置。在鸡胚上方覆盖一层薄的琼脂糖垫（虚线所示），并在换能器与琼脂糖表面之间添加一层薄PBS作为耦合介质。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62076/62076fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示CAM血管生长、示意图和血管分析设置的鸡胚血管生成实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62076/62076fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 6"> 
图 6．离壳的卵内容物。(A) 孵育5天后从蛋壳中取出的卵内容物。图中标出了绒毛尿囊膜（CAM）、胚胎体（EB）、前部和后部卵黄静脉（*）以及合适的注射位点（箭头）。(B) 孵育6天后从蛋壳中取出的卵内容物。图中标出了前部和后部卵黄静脉（*）以及合适的注射位点（箭头）。(C) 孵育7天后从蛋壳中取出的卵内容物。顶部放置了一块琼脂糖凝胶，以便进行超声成像。琼脂糖凝胶的四个角用黑色圆圈标出。(D) 孵育8天后从蛋壳中取出的卵内容物。所有比例尺均为1 cm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62076/62076fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="鸡胚发育阶段、血管系统、实验示意图、胚胎学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62076/62076fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 7"> 
图 7．鸡胚及绒毛尿囊膜（CAM）模型实验过程中可能出现的并发症。（A） 采用方法1.2（5日龄胚胎）或1.3（6至7日龄胚胎）将蛋内容物从蛋壳中取出时，绒毛尿囊膜下方 trapped 的气泡。（B） 右上角箭头所示的少量卵黄泄漏（6日龄胚胎）。（C） 绒毛尿囊膜下方 trapped 的空气，由黑色虚线圈标示（7日龄胚胎）。（D） 黑色箭头所示的出血现象（5日龄胚胎）。（E） 胚胎及绒毛尿囊膜干燥（5日龄胚胎）。（F） 大范围毛细血管阻塞（5日龄胚胎）。所有比例尺均为 1 cm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62076/62076fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜图像，血管管腔，管壁识别；组织学分析，组织结构研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62076/62076fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 8"> 
图 8. CAM 血管中的微泡。 血管壁以虚线标示，单个微泡以箭头指示。比例尺代表 20 µm。相应的显微镜录像见补充视频 1。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62076/62076fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="胚胎成像，荧光显微镜，胎儿发育，解剖结构，光学分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62076/62076fig09.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 9"> 
图 9。鸡胚及尿囊膜血管的对比增强超声成像。(A) 6日龄鸡胚（顶部覆盖琼脂糖块）的B模式（I, III）和实时次谐波（II, IV）图像的最大强度投影（使用MS250探头的小动物临床前超声仪，发射频率30 MHz，接收频率15 MHz，输出功率10%）。上方图像（I, II）为注射5 µL超声对比剂前的结果，下方图像（III, IV）为注射后的结果。比例尺为1 mm。本图经Daeichin等201511许可修改。(B) 6日龄鸡胚（顶部覆盖琼脂糖块）的光学图像（左）与三维次谐波成像（右）。向尿囊膜血管注射5 µL超声对比剂，并使用高频探头进行成像（使用MS550s探头的小动物临床前超声仪，发射频率40 MHz，峰值负压约300 kPa，在小动物临床前超声仪的3D模式下重建）。比例尺为5 mm。本图经Daeichin等201511许可修改。(C) 6日龄鸡胚尿囊膜微血管的光学图像（左）与超谐波血管内超声（IVUS）的平均强度投影（右）。向尿囊膜血管注射4 ± 1 µL对比剂，使用定制IVUS探头进行超谐波IVUS成像（发射频率35 MHz，峰值负压600 kPa）。两幅图像来自同一胚胎的相同兴趣区域。箭头指示两图中对应的血管。比例尺为1 mm。本图经Maresca等201412许可修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62076/62076fig09large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞结构的显微镜观察；荧光图像 A-D；显示蛋白质定位的图示。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62076/62076fig10.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 10"> 
图 10．药物递送至 6 日龄胚胎中 CAM 血管内皮细胞。(A) 超声处理前，六个靶向 αvβ3 的微泡（白色箭头指示）黏附于血管壁的明场图像。(B) 超声处理前，内皮细胞核的荧光染色图像。(C) 超声处理前，靶向微泡的荧光图像（白色箭头指示）。(D) 超声处理后（1 MHz，200 kPa 峰值负压，单次脉冲持续 1000 个周期），模型药物碘化丙啶（PI）被靶向微泡下方的细胞核摄取。比例尺为 10 µm，适用于所有图像。本图经 Skachkov 等人 20147 许可修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62076/62076fig10large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
补充文件
补充视频 1. 鸡胚尿囊膜血管中的微泡。 比例尺为 20 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62076/Supplemental%20Video%201.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>

本方案描述了三种获取和使用5至8日龄鸡胚及其绒毛尿囊膜（CAM）作为体内模型的方法&#160;用于研究增强超声成像及微泡介导药物递送的模型。

鸡胚及其富含血管的绒毛尿囊膜（CAM）是研究生物医学过程、开发新型...的宝贵体内模型

本方案描述了在孵化第5至第8天期间鸡胚的制备及其在增强对比超声成像和微泡介导药物递送研究中的应用。在孵化第5至第8天通过三种方法打开蛋壳取出内容物，可使胚胎在壳内继续发育，且仅需使用基础实验室工具。该模型适用于研究超声及血管相关领域的多个方面，如血流成像、药物递送以及新型超声造影剂和换能器。制备5日龄胚胎时，将已孵化5天的受精蛋放入预热的蛋托中，保持其方向与孵化箱内一致，然后用镊子尖端的钝端在蛋壳顶端轻轻压出一个小凹痕。使用镊子在卵的侧面距卵长约2/3处制作第二个凹痕，并用较大的镊子小心移除卵顶部凹陷区域的一小块卵壳，注意使气室与外界空气接触，但不要过深穿透卵壳。使用装有19号针头的5毫升注射器，通过第二个凹痕处将针头朝下刺入卵壳，抽出约2毫升的卵白。收集卵白后，用胶带封闭穿刺孔，并将卵白转移至称量皿中。使用大镊子扩大蛋顶部的小开口，直至胚胎和绒毛尿囊膜完全可见，同时不移除绒毛尿囊膜下方的蛋壳，也不穿透内膜。当开口足够大时，将蛋在培养皿中旋转180度，使蛋顶部的开口朝向底部。一至两分钟后，胚胎将上浮，从底部不可见。当整个胚胎和尿囊绒毛膜已完全消失，仅可见卵黄时，移除侧面开口处的胶带。蛋的内部应会从开口处略微凸出。将蛋底部靠近金属称量舟架中的称量舟，用小镊子的尖端在开口范围内的膜上快速而轻柔地横向划一下，然后轻轻将蛋内容物倒入称量舟中。检查心跳是否仍然存在，以确认胚胎仍然存活，绒毛尿囊膜血管完整，且无血液或卵黄泄漏。将存活的胚胎置于37摄氏度环境中，并定期向胚胎和绒毛尿囊膜施加30微升37摄氏度的PBS液滴。要收获六至七日龄的胚胎及绒毛尿囊膜，需按照五日龄胚胎的操作方法准备鸡蛋，使用一支新的5毫升注射器，装配19号针头，通过第二个凹陷处穿刺蛋壳，针头朝下，单次穿刺即可抽取5至6毫升的蛋清。收集完卵白后，将装有约1毫升37摄氏度PBS（体积略多于已取出的卵白）的10毫升注射器针头插入蛋壳侧面，针头朝下，以补充所收获的卵白体积。随后迅速用一片胶带重新封住缺口，并按演示方法完成鸡蛋的后续处理。要从孵化8天的受精卵中收获胚胎和尿囊绒毛膜，需将鸡蛋水平握住，用一把大镊子的尾端在鸡蛋长度约一半的位置处轻轻压出一个小凹痕。在蛋壳表面周围以约10毫米的间隔，沿360度方向呈环形制作若干小凹痕。完成所有凹痕后，用镊子的尖端在两个凹痕之间的位置敲裂蛋壳，并将鸡蛋完全浸入37°C的PBS溶液中孵育5分钟。孵育结束后，将鸡蛋移至PBS中的称量舟上方，用两个拇指插入大孔中，轻轻将蛋壳打开，此时蛋壳应沿预先制作的小凹痕裂开。当蛋壳周围形成裂纹后，轻轻将两侧分开，同时轻柔地来回移动碎片，直至蛋内物质与蛋壳分离，并将内容物放入称量舟中。缓慢将盛有蛋内物质的称量舟从 PBS 中提起，略微倾斜称量舟以去除多余的 PBS。然后，将称量舟放入金属称量舟支架中。在此阶段，可在胚胎中观察到跳动的心脏。为准备用于显微成像的胚胎及绒毛尿囊膜样本，将带有琼脂糖的声学膜支架放置于一个含有约500毫升37摄氏度PBS的一升培养皿底部，琼脂糖层朝上。使用小剪刀在卵黄膜上快速剪开6至7处切口，环绕整个绒毛尿囊膜，同时旋转称量舟以获得更高的精确度和操作速度。使用汤匙舀起含有胚胎和尿囊绒毛膜的切下膜，缓慢抬起汤匙，以便观察该切下膜是否仍与卵黄囊膜的其余部分相连。轻轻倾斜汤匙，尽可能去除卵黄，但避免使组织干燥，并将切下的膜浸入盛有 PBS 的一升培养皿中。用小镊子夹住膜的一边，轻轻搅动，以去除仍附着的卵黄，然后将膜移至带有声学膜的支架上方。使用昆虫标本针将膜固定在支撑架的对角两端，注意避免刺穿绒毛尿囊膜上的血管。当两个角固定后，抬起并稍微倾斜支撑架以倒掉大部分 PBS，然后使用小镊子拉伸膜并将其均匀铺展在支撑架上，以便将膜的其余部分平整地固定在支撑架上。胚胎固定完成后，将支撑架置于37摄氏度的显微镜装置中，并在样品的兴趣区域覆盖一层声学和光学透明的膜，以实现对血管的光学观察。在此代表性分析中，按照图示方法取出了五日龄、六日龄、七日龄和八日龄的胚胎及绒毛尿囊膜。未观察到出血或对胚胎及绒毛尿囊膜的损伤，表明该方法可在不损害胚胎或绒毛尿囊膜血管的情况下安全收获蛋内内容物。提取过程中可能出现多种并发症，因此必须严格遵循操作步骤，并弃用任何受损的组织样本。如所示，可向胚胎注射例如微泡等超声造影剂。注射后，可在数小时内观察到微泡在被注射血管的管腔内以及在外周血液循环中的流动情况。在注射微泡之前，通过B模式已可在胚胎心脏内部观察到对比信号，但在高频超声次谐波成像中则无法观察到。加入微泡可增强胚胎在两种图像中的对比度和可见性。注射造影剂后，还可获得高频三维次谐波图像，以观察胚胎及绒毛尿囊膜内的血管网络。鸡胚及绒毛尿囊膜血管也可用于研究超声介导的药物递送。进行该操作时，最重要的是始终将胚胎和尿囊膜保持在37摄氏度，并防止其干燥。完成该操作后，可将鸡胚置于不同装置中，例如水箱或显微镜下，以进行对比增强超声成像或微泡介导的药物递送研究。该方法和制备方式适用于超声造影剂研究，也可用于癌症和病毒研究。

the-preparation-chicken-ex-ovo-embryos-chorioallantoic-membrane

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

鸡卵外胚胎和脉络膜尿囊血管的制备作为体内模型，用于对比增强超声成像和微泡介导的药物递送研究

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