使用快速和定量的细胞内胆碱膜模型发现转移调节器

我们的协议允许有效地识别基因或基因组合，阻止癌症入侵的观众。过度养殖不需要先进的动物设施进行维护。整体而言，作为一般或一般的特殊图书馆，可以在几周内在观众中放映。

这种过度筛选系统将帮助研究人员发现新的治疗基因靶点或基因靶点组合，可用于阻止癌症转移。对于 IV 注射，将细胞浓缩到每毫升 0.5 到 100 万细胞，使用冰冷 1X PBS 稀释或重新悬浮细胞。预计每10个胚胎需要大约1毫升的细胞悬浮。

要组装注射装置，将针头安装到注射器上，然后用三到五厘米长的管子将注射器针伸出。使用细钳打破胸针的尖端。将注射器加载到癌细胞悬浮物的 50 到 200 微升。

并将玻色硅酸盐针插入管中。检查针头有细胞堵塞和气泡。如果在毛细内观察到细胞堵塞，取出毛细圈，重新悬浮细胞，代之以新的毛细子。

使用柱塞推出任何气泡。取下盖盖，在立体镜下转移胚胎。识别在CAM表面注射的适当静脉:通常只比胸腺素针尖的直径稍宽，位于胚胎和称重盘壁之间的中间。

它通常更容易注射在紧邻静脉分叉的点。将针尖压在血管壁上，在与血流相同的方向施加温和的压力。如有必要，使用棉签帮助锚定或稳定正在注入的容器。

轻轻地将注射器柱塞压低 2 到 10 秒，直到注入所需的音量。如果注射部位出现过度出血或液体积聚，则丢弃胚胎。从CAM中取出针头，用棉签轻轻涂抹注射部位，以去除任何血液或多余的癌细胞。

用盖子盖住称重盘中注入的胚胎，并将其送回孵化器。重复手术，直到所有胚胎被注射。目视检查胚胎是否细菌或霉菌污染或死亡。

按照实验室处理程序丢弃受污染的胚胎。确保转移菌落在注射后的第一到三天内呈均匀形状。并在注射后第 4 到 5 天识别侵入性或非侵入性转移菌落。

注射后的第五天，从孵化器中取出胚胎，检查并定位胚胎CAM进行转移性细胞群分布。在解剖显微镜下，用细钳轻轻将含有转移性兴趣群的CAM组织向上拉，并用手术剪刀将其切断。将 CAM 组织转移到空的无菌 1.5 毫升管中，并关闭管盖。

重复切除程序，直到所有感兴趣的菌落被收集到单独的管子中。用微离心机管轻轻切碎CAM组织，为每个菌落使用单独的无菌18测量针。加入100微升1X胶原蛋白-A溶液，在37摄氏度下孵育30分钟。

在环境温度下以 300 倍 G 的速度旋转细胞和 CAM 组织 5 分钟。吸气胶原蛋白-A溶液，并重新暂停细胞不完整的介质，以获得细胞兴趣线。然后再次旋转细胞和组织。

将细胞和组织片段重新悬挂在一毫升的完整介质和选择因子（如果有）中。然后转移到一个12井组织培养皿井。在接下来的一到三周内，每天监测癌细胞的生长和污染。

当细胞达到70%至80%的汇流转移他们到一个更大的体积培养皿。一旦达到足够的癌细胞数量，就开始测序或下一轮选择。胚胎显示由于注射不成功而积聚的癌细胞，在大多数毛细血管中都可以看到。

当达到最佳细胞浓度和注射持续时间时，注射后第五天转导细胞应产生多种菌落表型，大多数菌落的侵入性取决于分散在CAM组织中的癌细胞。应注意看起来紧凑且距离邻近殖民地足够远的转移性菌落，这些菌落可以用钳子、剪刀和一块 CAM 组织切除。隔离正屏幕命中应在重新注射时显示紧凑的菌落表型。

在测量癌细胞血管接触时，应注意血管壁污渍亮度，并为血管壁信号注射适量的卵清素。尝试此协议时避免注射不足或过度，并消除过度出血或液体积聚。使用这种技术已经识别出一些在观众中驱动癌细胞入侵的新基因。