Name: 使用快速和定量的细胞内胆碱膜模型发现转移调节器 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: 学习利用鸡胚绒毛尿囊膜模型进行高通量筛选，快速识别抑制癌症转移的基因靶点。该方法无需复杂动物设施，可在数周内完成筛选，为发现新型治疗靶点提供高效平台。

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本工作获得了加拿大癌症协会研究所授予 JDL 和 KS 的研究基金（项目编号 #702849）的支持。Lewis 博士持有由阿尔伯塔癌症基金会资助的前列腺癌研究 Frank 和 Carla Sojonky 讲席。

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</ol>

无任何披露内容。

本文介绍了一种基于快速荧光显微镜的活体筛选方案，可用于基因筛选或药物候选物筛选等重要应用。通过鸡胚尿囊膜（CAM）模型，可对转导了特定基因文库或转染了单个表达载体的癌细胞进行快速筛选，并定量分析其目标表型。由于转导或转染方案因文库类型不同而存在显著差异，因此本方案未包含相关步骤。将表型相关的转移性克隆从尿囊膜上切除后进行扩增，并提取DNA用于高通量测序，以鉴定目标表达载体。通常，每种基因文库均配备有相应的引物序列及基因组DNA纯化推荐方法。我们建议遵循本地实验设施的指导原则，以获得最佳的高通量测序结果。
建议在筛选前确定文库和细胞系的最佳感染复数（M.O.I.）。理想情况下，每个细胞（即未来的转移性克隆）应仅含有一个基因表达载体，但根据我们的经验，这并不总是能够实现。我们建议遵循文库生产商提供的方案，并测试较宽范围的 M.O.I.（0.01–5），以尽可能接近 1。每个转移性克隆内若存在多个文库表达载体，可能会显著增加克隆表型分析的复杂性。我们还建议在实验中使用文库生产商提供的阴性对照（例如，表达荧光标记的乱序 shRNA 的载体）。
<p class="jove_cont...

转移是癌症患者死亡的主要原因1,2,3。转移性癌细胞在转移级联反应的五个步骤中，根据癌症类型的不同而利用不同的信号通路：局部侵袭、内渗、在循环系统中存活、外渗以及在远端转移部位形成克隆扩增。目前对这一转移过程的理解表明，其中存在两个瓶颈步骤：其一是癌细胞从原发肿瘤向特定方向侵袭，其二是远端转移病灶的建立4,5,6。这两个步骤均要求癌细胞与初始侵袭部位或远端转移病灶形成部位的胶原和血管系统发生主动相互作用。因此，转移性癌细胞必须能够黏附于细胞、重塑胶原纤维，并沿血管壁进行定向侵袭7。建立能够快速识别抗转移治疗靶点的筛选模型，以阻止癌细胞完成这些步骤，具有极高的重要性。体外筛选模型无法完全模拟复杂的活体组织环境，而小鼠模型则成本高昂且耗时。因此，迫切需要能够提供复杂活体组织环境并实现靶点快速识别的活体筛选平台。
近十年来，鸡胚已被确立为研究人类癌症转移的一种稳健且经济高效的模型8,9,10,11,12。鸡胚的绒毛尿囊膜（CAM）组织薄而半透明，非常适合对原发性肿瘤和/或转移灶中细胞及细胞集落的行为进行活体显微成像12。将多种人类癌细胞系微量注射至CAM组织后，仅需数天即可启动原发性肿瘤的生长并发生转移。癌细胞可通过多种方式接种于CAM组织，包括静脉注射、CAM内注射或胶原基质移植，这种灵活性使研究人员能够针对癌症进展的特定阶段开展研究，例如转移灶的形成、癌细胞从原发肿瘤向外侵袭或血管生成。
本文描述了一种定量筛选平台，可用于评估癌细胞形成侵袭性转移病灶的能力。将已转导表达文库的癌细胞以低密度经静脉注射至鸡胚尿囊膜（CAM）血管系统中。转移性克隆形成持续4-5天后，对所形成的克隆的侵袭能力及其与血管系统的相互作用进行评估。对于未能侵袭的单个克隆，将其切除、扩增，并通过再次注射至CAM中，定量分析克隆致密性及癌细胞与血管接触情况，以确认其表型。通过高通量测序分析分离克隆的基因组DNA，可鉴定出导致单个转移性克隆突变表型的表达文库载体。该平台还可进一步用于验证基因与所观察表型之间的因果关系，或对所观察表型开展深入的机制研究。

<table><tbody><tr><td>1 mL 一次性注射器</td><td>BD</td><td>BD309659</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 圆锥形离心管</td><td>Corning</td><td>CLS430791-500EA</td><td></td></tr><tr><td>18 号 × 1 1/2&amp;nbsp;BD 精密针头</td><td>BD</td><td>BD305196</td><td>我们使用 1.2 mm × 40 mm 的针头，也可根据需要选用更短的针头</td></tr><tr><td>2.5% 胰蛋白酶溶液</td><td>多个供应商可提供</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4T1 小鼠乳腺癌细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-2539</td><td></td></tr><tr><td>B16F10 小鼠黑色素瘤细胞系</td><td>ATCC</td><td>CRL-6475</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>多个供应商可提供</td><td></td><td>任何适用于细胞沉淀的 TC 兼容离心机均可使用</td></tr><tr><td>圆形盖玻片，22 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-101</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶</td><td>Sigma</td><td>C0130-100MG</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td></td><td></td><td>我们使用 Nikon A1r</td></tr><tr><td>棉签</td><td>多个供应商可提供</td><td></td><td>使用前必须灭菌</td></tr><tr><td>适用于所用细胞系的培养基</td><td>多个供应商可提供</td><td></td><td>我们使用 DMEM 加 10% FBS 培养基培养 HT1080、HEp3 和 B16 细胞系</td></tr><tr><td>孵蛋器</td><td>多个供应商可提供</td><td></td><td>所需具体型号取决于筛选规模。可选供应商包括美国佐治亚州萨凡纳的 MGF Company Inc. 或加利福尼亚州丘拉维斯塔的 Lyon Electric Company Inc.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>Sigma</td><td>T4816-250EA</td><td></td></tr><tr><td>受精白来航鸡蛋</td><td>任何本地供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>多个供应商可提供</td><td></td><td>使用前必须灭菌</td></tr><tr><td>血细胞计数板&amp;nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>MDH-4N1-50PK</td><td></td></tr><tr><td>HT1080 人纤维肉瘤细胞系</td><td>ATCC</td><td>CCL-121</td><td></td></tr><tr><td>图像分析软件</td><td></td><td></td><td>我们使用 Nikon Elements</td></tr><tr><td>与荧光素或罗丹明偶联的植物凝集素 &lt;em&gt;Lens Culinaris&lt;/em&gt; 凝集素（LCA）&amp;nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>RL-1042, FL-1041</td><td>根据显微镜灵敏度将原液（5 mg/mL）稀释 50–100 倍。所用荧光颜色必须与用于筛选的细胞系颜色不同</td></tr><tr><td>MDA-MB-468 人乳腺癌细胞</td><td>ATCC</td><td>HTB-132</td><td></td></tr><tr><td>PBS（1×）</td><td>多个供应商可提供</td><td></td><td></td></tr><tr><td>塑料称重皿&amp;nbsp;</td><td>Simport</td><td>CA11006-614</td><td>尺寸为 78×78×25 mm；多个其他供应商可提供</td></tr><tr><td>小型手术剪刀&amp;nbsp;</td><td>多个供应商可提供</td><td></td><td>使用前必须灭菌</td></tr><tr><td>硼硅酸钠玻璃毛细管，外径 1.0 mm，内径 0.58 mm，长度 10 cm&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF100-58-10</td><td></td></tr><tr><td>方形培养皿（用作称重皿的盖子）</td><td>&amp;nbsp;VWR&amp;nbsp;</td><td>CA25378-115&amp;nbsp;</td><td>尺寸为 100×100×15 mm；多个其他供应商可提供</td></tr><tr><td>体视荧光显微镜&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>我们使用 Zeiss Lumar v12</td></tr><tr><td>Tygon R-3603 实验室管路</td><td>Cole-Parmer</td><td>AAC00001</td><td>内径 1/32 英寸，外径 3/32 英寸，壁厚 1/32 英寸</td></tr><tr><td>U-118 MG 人胶质母细胞瘤细胞</td><td>ATCC</td><td>HTB-15</td><td></td></tr><tr><td>U-87 MG 人胶质母细胞瘤细胞</td><td>ATCC</td><td>HTB-14</td><td></td></tr><tr><td>垂直移液管拉制仪&amp;nbsp;</td><td>多个供应商可提供</td><td></td><td>我们使用 David Kopf Instruments（美国加利福尼亚州图洪加），型号 720</td></tr></tbody></table>

利用快速定量的鸡胚尿囊膜活体模型发现转移调控因子

Discovery of Metastatic Regulators using a Rapid and Quantitative Intravital Chick Chorioallantoic Membrane Model

近期癌症研究的进展揭示了癌症转移过程的高度复杂性。已发现多个基因或基因网络会根据癌症类型、组织以及个体患者的特征，差异性地调控癌症转移级联过程中的基因及其产物。这些基因和基因网络可能成为基因治疗和个体化医疗策略中的重要靶点。开发快速筛选平台对于识别这些遗传靶标至关重要。
鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）是一种富含胶原、高度血管化的膜状结构，位于蛋壳下方，可支持发育中胚胎的气体交换。由于CAM所处的位置及其丰富的血管化特征，我们将其开发为一种活体人源癌症转移模型，该模型可实现高效的人癌细胞异种移植，并能够对癌细胞与富含胶原的基质及脉管系统之间的相互作用进行实时成像。
利用该模型，我们设计了一个定量筛选平台，用于鉴定癌症转移的新驱动因子或抑制因子。我们将携带完整人类基因组shRNA基因文库的头颈部HEp3癌细胞以低密度注射到绒毛尿囊膜（CAM）血管系统中。细胞增殖后形成单个肿瘤细胞克隆。那些无法侵入CAM组织的克隆表现为紧凑的克隆表型，肉眼可见，可被切除并用于鉴定细胞中转导的shRNA。通过分析单个克隆的图像评估其侵袭能力。经过多轮筛选以降低假阳性率。单个分离的癌细胞克隆或新构建的表达目的基因的克隆则进一步进行原发性肿瘤形成实验或癌细胞血管共选项分析。综上所述，我们提出了一种快速筛选平台，可用于抗转移靶点的鉴定以及对动态且复杂的生物学事件级联过程进行活体分析。

若大多数滞留在毛细血管中的细胞呈单个分布，且彼此之间相隔一定距离（约0.05–0.1 cm），则表明癌细胞注射成功，这样在孵育5–6天后形成的克隆不会发生重叠（图3A）。如果在多数毛细血管中可见癌细胞堆积，则表明注射未成功，此类胚胎应予以弃用（图2E）。大量注射后的癌细胞在注射后24小时内会死亡，导致部分胚胎看似完全排斥了癌细胞。癌细胞的存活率可能因本地鸡蛋供应商的不同而有所差异（即所需注射的细胞数量可能需要调整），我们强烈建议在正式开展实验前，先确定最佳注射条件（癌细胞浓度与注射持续时间）。我们推荐的细胞浓度范围为0.5 × 106 至 1.0 × 106 个细胞/mL。当达到最佳细胞浓度和注射时间后，注射后第5天的转导细胞应产生多种多样的克隆表型，其中大多数克隆应表现为侵袭性，即癌细胞在绒毛尿囊膜（CAM）组织中呈弥散分布（图3A）。应特别关注那些...

这是一种用于筛选癌症转移抑制因子或驱动因子的有效方法。将携带表达文库的细胞注入鸡胚尿囊膜血管系统，以形成转移性克隆。对侵袭能力降低或增强的克隆进行分离、扩增，并重新注射以确认其表型，最后通过高通量测序进行分析。

近年来，癌症研究的进展揭示了癌症转移过程的高度复杂性。已发现多个基因或基因网络在其中发挥重要作用。

本方案可高效鉴定在斑马鱼体内抑制癌症侵袭的单个基因或基因组合。该体外培养方法无需依赖高级动物饲养设施进行维护。总体而言，利用斑马鱼模型可在数周内对通用基因文库或特定基因文库进行筛选。这种高通量筛选系统将有助于研究人员发现新的治疗性基因靶点或基因靶点组合，可用于阻断癌症转移。进行尾静脉注射时，使用预冷的1×PBS将细胞浓缩并重悬至每毫升0.5至100万个细胞。预计每10个胚胎需要约1毫升的细胞悬液。组装注射装置时，先将针头安装到注射器上，然后用一段3至5厘米长的管路延长注射器针头。使用精细镊子折断硼硅酸盐针头的尖端。向注射器中加入50至200微升的癌细胞悬液。将硼硅酸盐针头插入管路中。检查针头是否有细胞堵塞和气泡。若观察到毛细管内有细胞堵塞，需取下毛细管，重新悬浮细胞，并更换新的毛细管。使用柱塞推出所有气泡。取下盖子，将胚胎转移至体视显微镜下。在CAM表面确定合适的静脉注射位置，该静脉通常仅略宽于硼硅酸盐针尖的直径，并位于胚胎与称重皿壁之间的中点处。通常在静脉分叉处紧邻的位置注射更为容易。将针尖抵住血管壁，并沿血流方向施加轻柔的压力。如有必要，可使用棉签帮助固定或稳定待注射的血管。轻轻按压注射器活塞，持续2至10秒，直至注入所需体积。若注射部位出现明显出血或清亮液体积聚，则弃去该胚胎。将针头从尿囊膜（CAM）中取出，并用棉签轻轻擦拭注射部位，以清除血液或多余的癌细胞。将注射后的胚胎用称量皿盖子盖好，并放回培养箱中。重复此操作，直至所有胚胎完成注射。目视检查胚胎是否存在细菌或霉菌污染，以及是否死亡。根据实验室废弃物处理程序丢弃受污染的胚胎。确保在注射后第一至第三天内转移性克隆在形态上保持均一，并在注射后第四至第五天鉴定侵袭性或非侵袭性转移性克隆。注射后第5天，从培养箱中取出胚胎，观察并确定胚胎绒毛尿囊膜（CAM）上转移灶的分布情况。在解剖显微镜下，用精细镊子轻轻向上提起含有目标转移灶的CAM组织，用手术剪将其剪下。将CAM组织转移至一个洁净无菌的1.5毫升离心管中，并盖紧管盖。重复切割操作，直至将所有目标菌落分别收集到不同的离心管中。使用单独的无菌18号针头，在微量离心管中轻轻切碎CAM组织。加入100 µL的1×胶原酶A溶液，在37 °C下孵育30分钟。在室温下以300 × g离心5分钟，沉淀细胞和CAM组织。吸除胶原蛋白A溶液，将细胞重悬于目标细胞系的完全培养基中。然后再次离心细胞和组织。将细胞和组织块重新悬浮于一毫升完全培养基中，如有需要，加入筛选因子。然后转移至一个12孔组织培养板的单个孔中。在接下来的一至三周内，每天监测癌细胞的生长情况和污染情况。当细胞融合度达到70%至80%时，将其转移至更大体积的培养皿中。一旦获得足够的癌细胞数量，立即进行测序或下一轮筛选。由于注射失败导致癌细胞积聚的胚胎，可在大多数毛细血管中观察到。当达到最佳细胞浓度和注射持续时间时，注射后第五天的转导细胞应产生多种多样的集落表型，其中大多数集落具有侵袭性，表现为癌细胞在绒毛尿囊膜（CAM）组织中呈弥散分布。应特别关注那些形态致密且与邻近集落相距较远的转移性集落，以便能够用镊子和剪刀连同一块CAM组织将其完整切除。一个独立的阳性筛选结果在再次注射后应仍表现出致密集落表型。在测量癌细胞与血管接触时，应注意血管壁染色的亮度，并注射适量的凝集素以获得清晰的血管壁信号。进行本方案时，应避免注射量过少或过多，并清除多余的出血或液体积聚。利用该技术，已鉴定出多个在观察者中驱动癌细胞侵袭的新型基因。

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