Name: 研究脊椎动物轴向伸长和分割的三维和四维可视化分析方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: 学习利用光学投影断层扫描和全组织免疫荧光技术对小鼠胚胎进行三维和四维成像分析的方法，以研究脊椎动物轴向伸长和体节形成过程中的神经中胚层祖细胞动态变化及发育机制。

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我们感谢Olivier Pourquié和Alexander Aulehla提供LuVeLu报告基因小鼠品系，感谢SunJin实验室提供RapiClear测试样品，感谢Hugo Pereira在使用BigStitcher软件方面的帮助，感谢Nuno Granjeiro协助搭建活体成像装置，同时感谢IGC动物实验中心以及Mallo实验室的历任和现任成员在本研究进行过程中提供的有益建议与支持。
我们感谢葡萄牙IGC先进影像中心（Advanced Imaging Facility）提供的技术支持，该中心获得葡萄牙资助项目编号PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122和PTDC/BII-BTI/32375/2017的支持，由里斯本地区运营计划（Lisboa 2020）在葡萄牙2020合作伙伴协议框架下，通过欧洲区域发展基金（FEDER）以及葡萄牙科学技术基金会（FCT, Portugal）共同资助。本论文所述工作获得了M.M.主持的FCT（葡萄牙科学技术基金会）项目LISBOA-01-0145-FEDER-030254和Santa Casa da Misericórdia（葡萄牙）项目SCML-MC-60-2014的资助，同时得到研究基础设施Congento（项目编号LISBOA-01-0145-FEDER-022170）的支持，以及A.D.获得的博士奖学金PD/BD/128426/2017。

作者声明无利益冲突。

轴向伸长和体节化是脊椎动物胚胎发育过程中最复杂且动态的两个过程。长期以来，研究人员已将单细胞追踪的三维（3D）和四维（4D）成像技术应用于斑马鱼和鸡胚胎中对这些过程的研究，因为这些模型在可及性和培养条件方面有利于进行复杂的成像19,44,45,46,47,48,49。相比之下，尽管已有部分进展（例如活体成像技术的应用50），小鼠胚胎在器官发生的中晚期阶段仍缺乏如此精细的研究。在本论文中，我们提供了多种方法的具体实验方案，可用于获取多维图像并对其进行分析，以促进对颈、躯干和尾部形成过程中神经中胚层前体细胞（NMPs）及其中胚层衍生物...

脊椎动物体轴的形成是胚胎发育过程中一个高度复杂且动态的过程。在原肠胚形成结束时（小鼠约在胚胎第8.0天），一群被称为神经中胚层前体细胞（neuromesodermal progenitors, NMPs）的外胚层前体细胞成为头尾方向体轴延伸的关键驱动因素，在颈、躯干和尾部形成过程中生成神经管和轴旁中胚层组织1,2,3,4。有趣的是，这些NMPs在外胚层尾部所处的位置似乎在决定其分化为中胚层或神经外胚层的过程中起着关键作用5。尽管目前我们尚缺乏NMPs精确的分子特征标记，但通常认为这些细胞共同表达T（Brachyury）和Sox25,6。调控NMP命运决定（即向神经或中胚层方向分化）的确切机制才刚刚开始被明确界定。Tbx6在原条区域的表达是NMP命运决定的早期标志，因为该基因参与中胚层的诱导与特化6,7。有趣的是，早期中胚层细胞似乎高表达Epha18，而Wnt/β-catenin信号通路以及Msgn1也被证实对轴旁中胚层的分化和体节形成具有重要作用9,10。对NMPs在单细胞水平上进行完整的时空分析，必将有助于深入理解调控中胚层特化的分子机制。
体节（脊椎的前体）的形成是脊椎动物的一个关键特征。在体轴伸长过程中，轴旁中胚层会分节形成一系列左右对称的重复单元，称为体节。不同物种之间体节的数量以及新体节形成所需的时间各不相同11,12。体节发生过程涉及周期性的信号振荡（称为&#34;分节时钟&#34;），这种振荡可通过前体节中胚层中Notch、Wnt和Fgf信号通路多个基因（如Lfng）的周期性表达来观察11,12。目前的体节发生模型还假设存在一个&#34;成熟波前&#34;，即由Fgf、Wnt和视黄酸信号构成的复杂信号梯度，用于确定每个新体节后边界的位置。因此，&#34;分节时钟&#34;与&#34;成熟波前&#34;之间的协调相互作用对于这些脊椎前体结构的形成至关重要，因为这些关键形态发生过程的扰动可能导致胚胎致死或先天性畸形（如脊柱侧弯）13,14,15。
尽管近年来成像技术、生物图像分析方法及软件取得了显著进展，大多数关于体轴伸长和体节发生的研究仍依赖于单一或孤立的二维图像数据（如组织切片），这无法实现组织的完整多维可视化，并且难以清晰区分病理性畸形（即由突变引起） 与 胚胎发育过程中发生的正常形态学变异16三维成像技术已揭示出以往通过标准二维方法未能识别的新型形态发生运动17,18,19,20，凸显了全组织成像在解析脊椎动物体节发生和轴向延伸机制方面的强大能力。
小鼠胚胎的3D和4D显微成像，尤其是活体成像，在技术上具有挑战性，在样本制备、图像采集和数据预处理过程中需要关键步骤，以实现&#160;准确且有意义的时空分析。本文中，我们描述了一种用于小鼠胚胎活体成像和整体免疫荧光染色的详细方案，可用于研究轴向延伸和体节形成过程中的神经中胚层前体细胞（NMPs）和中胚层细胞。此外，我们还介绍了一种针对较晚期胚胎和胎儿的光学投影层析成像（OPT）方案，可实现对体节发生过程中可能出现的病理异常（如骨骼融合和脊柱侧弯）进行完整的三维可视化与定量分析13,21,22。最后，我们展示了3D成像重建技术在脊椎动物体节形成和轴向伸长研究与教学中的强大应用价值。

<table><tbody><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Sigma</td><td>A9414</td><td>用于包埋胚胎（例如用于光学投影断层成像）</td></tr><tr><td>Amira 软件</td><td>Thermofisher</td><td>-</td><td>商业软件工具</td></tr><tr><td>抗 Brachyury 抗体（山羊多克隆）</td><td>R and D Systems</td><td>AF2085 RRID:AB_2200235</td><td>用于免疫荧光染色</td></tr><tr><td>抗 Sox2 抗体（兔单克隆）</td><td>Abcam</td><td>ab92494 RRID:AB_10585428</td><td>用于免疫荧光染色</td></tr><tr><td>抗 Tbx6 抗体（山羊多克隆）</td><td>R and D Systems</td><td>AF4744 RRID:AB_2200834</td><td>用于免疫荧光染色</td></tr><tr><td>抗层粘连蛋白111 抗体（兔多克隆）</td><td>Sigma</td><td>L9393 RRID:AB_477163</td><td>用于免疫荧光染色</td></tr><tr><td>抗山羊 IgG 488 标记二抗（驴多克隆）</td><td>Molecular Probes</td><td>A11055 RRID:AB_2534102</td><td>用于免疫荧光染色</td></tr><tr><td>抗兔 IgG 568 标记二抗（驴多克隆）</td><td>ThermoFisher &amp;nbsp; Scientific</td><td>A10042 RRID:AB_2534017</td><td>用于免疫荧光染色</td></tr><tr><td>苯甲醇（99+%）</td><td>（任意品牌）</td><td>-</td><td>用于胚胎透明化处理（BABB 试剂组分之一）</td></tr><tr><td>苯甲酸苄酯（99+%）</td><td>（任意品牌）</td><td>-</td><td>用于胚胎透明化处理（BABB 试剂组分之一）</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Biowest</td><td>P6154</td><td>用于免疫荧光染色</td></tr><tr><td>盖玻片 20×20 mm #0</td><td>（任意品牌）</td><td>-</td><td>厚度为 100 μm</td></tr><tr><td>盖玻片 20×20 mm #1</td><td>（任意品牌）</td><td>-</td><td>厚度为 170 μm</td></tr><tr><td>盖玻片 20×60 mm #1.5</td><td>（任意品牌）</td><td>-</td><td>用作 &amp;ldquo;载玻片&amp;rdquo;</td></tr><tr><td>DAPI（4&amp;rsquo;,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐）</td><td>Life Technologies</td><td>D3571</td><td>用于免疫荧光染色</td></tr><tr><td>Drishti 软件</td><td>（开源）</td><td>-</td><td>免费软件工具</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>ED2SS</td><td>用于脱矿处理</td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ 软件</td><td>（开源）</td><td>-</td><td>免费软件工具</td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>NZYtech</td><td>MB01401</td><td>用于免疫荧光染色</td></tr><tr><td>Huygens 软件</td><td>Scientific Volume Imaging</td><td>-</td><td>商业软件工具</td></tr><tr><td>HyClone 定义型胎牛血清</td><td>GE Healthcare</td><td>#HYCLSH30070.03</td><td>用于活体成像培养基</td></tr><tr><td>30% 过氧化氢溶液</td><td>Milipore</td><td>1085971000</td><td>用于透明化处理</td></tr><tr><td>Imaris 软件</td><td>Bitplane / Oxford instruments</td><td>-</td><td>商业软件工具</td></tr><tr><td>iSpacers</td><td>SunJin Lab</td><td>（型号各异）</td><td>用作样品制备中的间隔物</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>#25030&amp;ndash;024</td><td>用于活体成像培养基</td></tr><tr><td>低糖 DMEM 培养基</td><td>Gibco</td><td>11054020</td><td>用于活体成像培养基</td></tr><tr><td>M2 培养基</td><td>Sigma</td><td>M7167</td><td>用于胚胎解剖</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>VWR</td><td>VWRC20847.307</td><td>用于脱水和再水化步骤</td></tr><tr><td>水杨酸甲酯</td><td>Sigma</td><td>M6752</td><td>用于胚胎透明化处理</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>用于配制胚胎固定液</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma</td><td>#P0781</td><td>用于活体成像培养基</td></tr><tr><td>PBS（磷酸盐缓冲液）</td><td>Biowest</td><td>L0615-500</td><td>-</td></tr><tr><td>RapiClear</td><td>SunJin Laboratory</td><td>RapiClear 1.52</td><td>用于胚胎透明化处理</td></tr><tr><td>Secure-Sea 杂交室</td><td>Sigma</td><td>C5474</td><td>用作样品制备中的间隔物</td></tr><tr><td>simLab 软件</td><td>SimLab soft</td><td>-</td><td>商业软件工具</td></tr><tr><td>凹面载玻片 - 75×25 mm</td><td>（任意品牌）</td><td>-</td><td>用于包埋较厚的胚胎</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>用于免疫荧光染色</td></tr></tbody></table>

三维与四维可视化及分析方法在脊椎动物体轴伸长与分节研究中的应用

Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation

体节发生是脊椎动物胚胎发育的一个标志性过程。多年来，研究人员利用多种技术，包括离体和体外方法，在多种生物体中对这一过程进行了研究。然而，大多数研究仍然依赖于二维（2D）成像数据的分析，这限制了对涉及复杂三维空间中高度动态相互作用的发育过程（如轴向延伸和体节发生）的准确评估。本文介绍了一系列技术，可实现小鼠胚胎的活体成像数据采集、数据集处理、三维（3D）和四维（4D）可视化与分析，用于研究参与这些发育过程的细胞（例如神经中胚层前体细胞）。我们还提供了小鼠胚胎光学投影断层成像和整体免疫荧光显微镜技术的逐步操作方案（从样品制备到图像采集），并展示了一个用于处理和可视化三维图像数据的分析流程。我们拓展了部分技术的应用，并重点介绍了多种现有软件（如 Fiji/ImageJ、Drishti、Amira 和 Imaris）的特定功能，这些功能可用于提升我们对轴向延伸和体节形成（例如三维重建）的理解。综上所述，本文所述技术强调了三维数据可视化与分析在发育生物学中的重要性，可能有助于其他研究人员更好地在脊椎动物轴向延伸与体节分节的研究背景下处理三维和四维图像数据。最后，本研究还采用了新型工具，以促进脊椎动物胚胎发育的教学。

本文中展示的活体成像和免疫荧光成像的代表性结果均使用双光子系统获得，配备20 × 1.0 NA水镜物镜，激发激光调至960 nm，并使用GaAsP光电探测器（详见Dias等，(2020)43）。光学投影断层扫描采用自行搭建的OPenT扫描仪完成（详见Gualda等，(2013)28）。
活体成像（4D 分析） 
根据“活体成像样品制备”（第 1.1 步；“3D 成像样品制备”部分）、“活体成像数据集预处理”（第 3 步；“图像数据集预处理”部分）以及“使用 Imaris 进行 3D 可视化与分析”（第 4.4 步；“3D 渲染、可视化与分析”部分）所述方案获得的小鼠胚胎在体轴延伸过程中的 LuVeLu 报告基因活性代表性分析结果，可见于 图 1 和 视频 1。
三维可视化与分析</st...

本文介绍了用于可视化和分析小鼠胚胎在体轴伸长和体节形成过程中三维和四维图像数据的计算工具与方法，这些图像数据通过整体光学投影断层成像技术、活体成像以及基于多光子显微镜的全胚免疫荧光染色获得。

体节形成是脊椎动物胚胎发育的显著特征。多年来，研究人员已在多种生物体中利用……对这一过程进行了研究。

小鼠胚胎的器官发生阶段由于胚胎复杂结构难以观察，目前研究仍不充分。本方案描述了可在体轴延伸和体节形成期间实现小鼠胚胎三维（3D）和四维（4D）可视化与分析的技术。该技术的主要优势在于，使研究人员能够将小鼠胚胎的复杂结构作为三维动态对象进行研究和展示。本方案包含可用于研究影响哺乳动物椎骨和脊髓的先天性畸形（如脊柱侧弯）的技术。这些技术也可用于体外模型系统，从而实现对人类胚胎发育的研究。为对胚胎第8.25天至胚胎第10.5天的小鼠胚胎进行活体成像，需在37摄氏度预热的M2培养基中解剖胚胎。使用洁净的镊子轻轻去除卵黄囊，并用新鲜的M2培养基洗涤胚胎一次，以清除解剖过程中产生的血液和碎片。在活体成像过程中，将胚胎孵育于添加了10% HyClone定义型胎牛血清、2毫摩尔L-谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素的低糖DMEM培养基中，置于37摄氏度加热培养室，且在65%氧气与5%二氧化碳的环境中。为了制备适用于免疫荧光显微镜观察的相似发育阶段小鼠胚胎，无需使用预热的M2培养基，而应在冷的PBS中进行胚胎解剖，并用4%多聚甲醛固定。按照文中所述完成整体免疫荧光染色方案后，可使用 RapiClear 进行组织透明化。首先，将胚胎置于一个 75 × 25 毫米凹面载玻片的中央，移除显微镜凹面载玻片中的所有 PBST，并加入 200 微升透明化溶液，然后用盒子盖住玻片样本。避光放置 10 分钟后，当胚胎开始变得透明时，更换透明化溶液，并继续孵育额外 20 分钟。从一侧开始，轻轻将盖玻片覆盖在胚胎上，并逐渐移向另一侧。样品现已准备好进行成像。若使用水杨酸甲酯或BABB进行透明化处理，需确保胚胎已在100%甲醇中完全脱水，然后开始BABB与甲醇的系列处理，每步增加20%浓度，并孵育20分钟。当BABB溶液达到100%时，需更换两次新鲜溶液。准备一个20 × 60毫米的1.5号盖玻片用于封片，以避免压扁样本。添加由薄金属垫片制成的间隔物。使用牙签、细棉签或巴斯德移液管将透明化的胚胎转移至显微镜载玻片上。然后加入一滴封片剂，盖上另一块相同的盖玻片，并用熔化的石蜡密封，以更好地稳定样品并避免产生气泡。将盖玻片从一侧轻轻放置，然后逐渐且缓慢地侧向滑动，必要时可添加更多封片剂。样本现已准备好用于显微镜成像。成像后，使用 Fiji/ImageJ 将胚胎重新定位至标准化的前后轴和背腹轴方向。在 Fiji 中减小图像数据集的大小，然后进行缩放，并输入必要的 X、Y 和 Z 轴比例值，以将数据集减小到 200 兆字节以下。确保勾选“创建新窗口”选项。然后进入插件菜单并打开3D Viewer。在3D Viewer窗口中，单击胚胎以选中它，此时将出现一个红色的3D方框。使用此模式时，用鼠标控制数据集的旋转。在确保胚胎处于理想位置后，选择编辑，变换图像，然后在3D查看器窗口中导出变换后的图像。检查不同的正交切面，然后转到图像，再选择堆栈并选择正交视图。当胚胎位置正确后，选择 3D Viewer 窗口菜单，然后依次点击编辑、变换，并将变换矩阵保存为扩展名为 mat 的文本文件。使用 Fiji/ImageJ 打开该文本文件，删除前两行后重新保存。这样即可生成与 TransformJ 插件兼容的变换矩阵文件。切换到全分辨率数据集，执行插件 TransformJ 和 TransformJ 仿射变换操作。在新窗口中，浏览并查找之前保存的矩阵文件，选择三次B样条插值法，并进行各向同性重采样，然后点击确定。在胚胎被正确重新定位后，裁剪掉大部分生成的空白区域。要生成完整的Z轴投影图像，请点击图像堆栈（stacks）、Z投影（Z Project），并选择最大强度投影。然后绘制包含整个胚胎在 X 和 Y 方向上的最小 ROI。通过点击编辑、选择、恢复选择，并选择图像进行裁剪，切换到原始数据集的图像窗口。选择图像并打开图像栈，点击工具，选择切片移除工具，指定要移除的第一个和最后一个切片，确保将步长更改为 1，以修剪不与胚胎组织相交的起始和结束切片。如有需要，可按照文稿中的说明进行进一步分析和 3D 重建。为了对发育较完全的胚胎进行三维分析，需在冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中解剖胚胎第18.5天的胎鼠，去除所有胚外膜，然后用新鲜PBS多次洗涤胎鼠，以清除解剖过程中产生的血液和碎片。将胎鼠置于PBS配制的4%多聚甲醛（PFA）中，于4°C固定5至7天。用PBS多次洗涤胚胎后，通过在甲醇溶液中逐级递增浓度（每次增加10%）的方式对胎鼠进行脱水处理，直至达到100%甲醇。在室温下于摇床上每步孵育25分钟。接着，将胚胎分别在摇床上先用含5%过氧化氢的甲醇溶液孵育1天，再用含10%过氧化氢的甲醇溶液孵育最多3天，直至胚胎完全失去天然色素。随后在去离子水中用逆向甲醇梯度逐步重水化，每次在室温下于摇床上孵育20分钟，然后将胚胎在去离子水中洗涤3次，每次洗涤30分钟。为了将胚胎包埋在1%琼脂糖块中，先将熔化的琼脂糖注入50毫升塑料管或注射器内，然后将胚胎垂直放入琼脂糖中，并在琼脂糖凝固过程中用镊子保持其垂直位置。将带有琼脂糖块的模具置于4摄氏度环境中30分钟，使琼脂糖充分凝固，随后将含有胚胎的琼脂糖块从模具中取出，放入盛有去离子水的容器中。使用甲醇浓度每步递增10%的溶液（以去离子水或PBS稀释）逐步进行胚胎脱水处理，在摇床中室温孵育，每步至少保持45分钟，直至甲醇浓度达到100%。将胚胎依次通过一系列BABB溶液和甲醇进行处理，每种浓度处理2.5小时，BABB浓度每次增加25%，直至达到100% BABB。每天更换新鲜的BABB溶液，直到胚胎完全透明为止。此过程可能需要三到五天。使用胶水将透明化的琼脂糖块固定在OPT扫描仪的电机轴上，然后调整光学系统以获得整个胚胎的图像，并继续采集完整的投影数据集。4D活体成像技术可实现对LuVeLu报告基因表达及胚胎第8.5天Snai1条件性敲除胚胎的动态分析。除了在体节前中胚层上出现正常的LuVeLu信号外，Snai1条件性敲除胚胎还在从原条延伸出的异位隆起区域表现出LuVeLu表达。整体免疫荧光检测可用于识别潜在的神经中胚层前体细胞（NMPs）以及中胚层分化的重要调控因子。白色和黄色箭头标示了突变体与野生型胚胎之间的差异。对整体免疫染色样本进行三维重建，有助于更深入理解所研究的组织或结构。在此情况下，研究了尾芽中潜在NMPs的位置。三维组织重建对于理解与表征小鼠胚胎中的形态学缺陷也具有重要意义。三维重建的交互式可视化也可以以用户友好的格式构建。例如，在PDF文件中。这些三维胚胎尾部结构可用于向更广泛的受众展示三维模型的强大功能，并有助于教学和研究脊椎动物的轴向伸长与分节过程。最后，利用OTP显微成像技术，可以实现对更晚期小鼠胚胎的完整三维可视化。此处展示的是动画渲染图像，突出显示了胚胎第18.5天胎儿的关键切片。最重要的是，结果必须真实反映在胚胎中观察到的内容。研究人员可利用这些方法，不仅呈现静态图像，还可包含视频、三维重建图像，甚至其数据的交互式3D模型。

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科研

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Developmental Biology

发育生物学

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