Name: 使用多体分析在发育中的鼠标大脑中进行翻译分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: 学习多体分析技术用于发育中小鼠大脑皮层mRNA翻译效率评估的方法。该技术通过蔗糖梯度离心分离核糖体亚基、单体和多体，结合紫外吸收和蛋白质印迹分析，为神经科学研究提供经济可靠的研究手段。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由加拿大自然科学与工程研究委员会发现基金（NSERC Discovery Grant，项目号 RGPIN/04246-2018，授予 G.Y.）资助。G.Y. 是加拿大研究讲席学者。S.K. 受 Mitacs Globalink 研究生奖学金和 ACHRI 研究生学生奖学金资助。

所有动物使用均受到卡尔加里大学动物护理委员会的监督。实验所用的CD1小鼠购自商业供应商。
1. 溶液的配制
注意：为防止RNA降解，需使用RNase去污染溶液喷洒工作台和所有设备。实验中使用无RNase的枪头。所有溶液均用无RNase的水配制。
<ol>
	<li>用DMSO配制环己酰亚胺储存液（100 mg/mL），并于-20 °C保存。</li>
	<li>通过将75.3 g蔗糖加入无RNase水中，并定容至100 mL，配制2.2 M蔗糖储存液（适用于约16次梯度制备）。该溶液可于-20 °C长期保存。</li>
	<li>配制10x盐溶液（1 M NaCl；200 mM Tris-HCl，pH 7.5；50 mM MgCl2）。</li>
	<li>配制60%（w/v）蔗糖追踪溶液，包含30 g蔗糖、5 mL 10x盐溶液，并用无RNase水定容至50 mL。</li>
	<li>可选：向追踪溶液中加入少量溴酚蓝或约5 µL 1%溴酚蓝水溶液（溶于无RNase水）。1.6. 将溶液于4 °C保存。</li>
</ol>
2. 蔗糖梯度的制备
注意：蔗糖梯度的制备准确性对于获得一致且可重复的实验结果至关重要。
<ol>
	<li>为制备六份10-50%的蔗糖梯度，按表1稀释2.2 M蔗糖溶液。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>蔗糖溶液</td>
			<td>10%</td>
			<td>20%</td>
			<td>30%</td>
			<td>40%</td>
			<td>50%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.2 M 蔗糖</td>
			<td>2 mL</td>
			<td>4 mL</td>
			<td>6 mL</td>
			<td>8 mL</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X 盐溶液</td>
			<td>1.5 mL</td>
			<td>1.5 mL</td>
			<td>1.5 mL</td>
			<td>1.5 mL</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>放线菌酮（Cycloheximide）</td>
			<td>15 µL</td>
			<td>15 µL</td>
			<td>15 µL</td>
			<td>15 µL</td>
			<td>15 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>水</td>
			<td>11.5 mL</td>
			<td>9.5 mL</td>
			<td>7.5 mL</td>
			<td>5.5 mL</td>
			<td>3.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总体积</td>
			<td>15 mL</td>
			<td>15 mL</td>
			<td>15 mL</td>
			<td>15 mL</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：制备蔗糖梯度所需的蔗糖稀释液。
注意：在超速离心过程中为保持重量平衡，蔗糖梯度液的制备必须以偶数倍进行。
<ol start="2">
	<li>用 RNase 去污染溶液擦拭金属钝头针。使用无 RNase 水短暂冲洗超速离心管、管路和注射器。将离心管自然晾干，确保管内无水滴残留，因为残留水分会改变蔗糖浓度。</li>
	<li>将金属针固定在夹具支架上，并将离心管置于电机驱动的移动平台上。为确保梯度制备的一致性，使用一套自行组装的系统，该系统包含一个用于固定超速离心管的电机驱动平台和一个用于注入蔗糖溶液的注射泵（图1，详见步骤9）。</li>
	<li>用一个30 mL注射器吸取约16 mL的10%蔗糖溶液（足够制备六个梯度），将其安装在注射泵上，并与针头连接。确保注射器、管路和针头中无气泡。擦拭针头尖端以去除任何残留溶液。</li>
	<li>向上移动电机驱动平台，使针头尖端接触离心管底部中心位置。</li>
	<li>将注射泵设定为流速2 mL/min，体积2.3 mL。</li>
	<li>注入2.3 mL的10%蔗糖溶液后，向下移动电机驱动平台，并对全部六个梯度重复此过程。</li>
	<li>重复步骤2.4–2.7，依次向管底加入20%蔗糖溶液，随后分别为30%、40%和50%蔗糖溶液。</li>
	<li>梯度制备完成后，用石蜡膜密封超速离心管。</li>
	<li>将离心管在4 °C下静置过夜，使不同浓度的蔗糖层相互扩散，形成连续梯度。</li>
</ol>
3. 组织解剖
注意：先使用 5% 异氟烷进行麻醉，再通过颈椎脱位法处死怀孕小鼠。
<ol>
	<li>在胚胎第12天（或根据需要选择其他时间点）收集CD1小鼠胚胎，并将胚胎置于含有冰冻Hank's平衡盐溶液（HBSS）的Ø 10 cm培养皿中，置于冰上以保持细胞活性。</li>
	<li>在解剖显微镜下，将一个胚胎转移至含有冰冻HBSS的Ø 6 cm培养皿中。</li>
	<li>使用21–23 G针头以大约45°角穿刺眼睛以固定头部位置，并施加力量确保针头固定在培养皿上（图2A）。</li>
	<li>使用5号镊子从中间向两侧剥离皮肤和颅骨。</li>
	<li>用镊子切断嗅球并去除软脑膜，以暴露皮层组织。使用弯头镊子将皮层组织切割至盛有2–3 mL冰上预冷的Neurobasal培养基的容器中（图2B）。根据需要合并来自不同胚胎的皮层组织。通常8–10个胚胎的组织可获得约200 µg总RNA。</li>
</ol>
4. 细胞裂解
<ol>
	<li>在组织解剖当天，按照表2所述配制新鲜的细胞裂解缓冲液。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>溶液</td>
			<td>终浓度</td>
			<td>体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (pH 7.5)</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>100 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>100 mM</td>
			<td>250 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>5 mM</td>
			<td>25 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>1% (v/v)</td>
			<td>500 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>脱氧胆酸钠</td>
			<td>0.5% (w/v)</td>
			<td>500 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>二硫苏糖醇 (DTT)</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>放线菌酮</td>
			<td>100 µg/mL</td>
			<td>5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无RNase水</td>
			<td></td>
			<td>加至 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总量</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：制备&#160;多核糖体裂解缓冲液
注意：在裂解缓冲液中添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂。
<ol start="2">
	<li>向含有解剖组织的Neurobasal培养基中加入环己酰亚胺，使其终浓度为100 µg/mL，37 °C孵育10分钟。环己酰亚胺可阻断翻译延伸，从而防止核糖体脱离15。</li>
	<li>在4 °C下以500 × g离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用预冷的含100 µg/mL环己酰亚胺的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤组织两次。</li>
	<li>加入500 µL细胞裂解缓冲液，并添加4 µL RNase抑制剂。用移液器上下吹打，使组织在裂解缓冲液中充分重悬。使用胰岛素针头轻轻裂解组织。</li>
	<li>将组织置于冰上孵育10分钟，每2–3分钟短暂涡旋一次。 
	注意：为防止组织降解，所有组织裂解步骤均需在冰上操作。</li>
	<li>在4 °C下以2,000 × g离心5分钟。</li>
	<li>将上清液转移至冰上预冷的新离心管中。</li>
	<li>在4 °C下以约13,000 × g离心5分钟。</li>
	<li>将上清液转移至冰上预冷的新离心管中。</li>
	<li>使用紫外-可见分光光度计测定组织裂解液中的RNA浓度。 
	注意：若实验中包含多个样品，应用额外的细胞裂解缓冲液将各样品稀释至相同浓度，以减少差异。</li>
</ol>
5. 样品上样与超速离心
<ol>
	<li>将超速离心转子和摆动桶在 4 °C 预冷，并将超速离心机的温度设置为 4 °C。</li>
	<li>保留 20 µL 组织裂解液作为总 RNA 输入样本。</li>
	<li>通过将裂解液缓慢加至超速离心管管壁顶部，将样品（50–300 µg RNA，体积相等）加到蔗糖梯度上方。</li>
	<li>将超速离心管轻轻放入摆动桶中，确保所有对称位置的桶已平衡。</li>
	<li>将摆动桶安装到转子上，将超速离心机设置为 190,000 × g（约 39,000 rpm），4 °C 离心 90 分钟。</li>
	<li>离心后，将梯度液轻轻放置于冰上。</li>
</ol>
6. 组分分离与样品收集
注意：使用自制的分级、记录和收集系统对梯度样品进行分析和收集（图3，参见装置组件）。
<ol>
	<li>将空的超速离心管放置在管穿刺器上，从底部用针头轻轻刺入管中。</li>
	<li>打开紫外监测仪，并启动数字信号记录软件。</li>
	<li>用一个30 mL注射器吸取25 mL的60%蔗糖追赶溶液。轻轻推动注射器，使追赶溶液充满空管并流经254 nm紫外监测仪，以设定检测的基线。</li>
	<li>按下紫外监测仪上的自动调零按钮，设定检测基线。在软件中点击播放，开始记录。</li>
	<li>当系统建立稳定基线后，暂停软件中的记录，并回抽追赶溶液。确保系统中无残留的追赶溶液。 
	注意：使用无RNase水冲洗系统，以去除前次运行残留的蔗糖溶液。</li>
	<li>将一个样品管装入管穿刺器。从底部用针头轻轻刺入管中。</li>
	<li>在软件中开始记录。启动注射泵（流速为1 mL/min，体积为25 mL）和组分收集器，以收集多聚核糖体组分。将组分收集器设置为每30秒收集一管。 
	注意：每次运行前，应轻轻推动注射器，使追赶溶液持续通过针头，以确保注射器和管路中无气泡。</li>
	<li>使用组分收集器将组分收集至1.5 mL离心管中（每管500 µL）。</li>
	<li>收集的组分可立即进行后续处理，或保存于-80 °C。</li>
	<li>完成组分收集后，使用无RNase水冲洗系统，以去除残留的蔗糖。</li>
</ol>
7. RNA 的提取
<ol>
	<li>向每份组分中加入 10 ng 荧光素酶 mRNA 外参对照。</li>
	<li>向每份组分中加入三倍体积的基于盐酸胍的商用 RNA 分离试剂。</li>
	<li>涡旋振荡 15 秒，时间短暂。</li>
	<li>使用与步骤 7.2 中所用溶液兼容的 RNA 提取试剂盒提取 RNA。</li>
</ol>
8. 逆转录与实时 PCR
<ol>
	<li>使用紫外-可见分光光度计测定RNA的浓度。</li>
	<li>根据制造商提供的说明书，使用cDNA合成试剂盒对RNA进行逆转录反应。</li>
	<li>以gapdh mRNA为例，采用定量实时PCR（qPCR）检测其多聚核糖体分布。qPCR使用qPCR检测系统和qPCR预混试剂进行，循环条件如下：95 °C 预变性10分钟，然后进行40个循环（95 °C 变性15秒，60 °C 退火30秒，72 °C 延伸40秒），最后在95 °C 保持60秒。</li>
	<li>从扩增曲线中获取阈值循环（Ct）值，并采用ΔΔCt法计算相对表达量的变化倍数。</li>
</ol>
9. 蔗糖梯度制备系统的组装
注意：按照以下步骤组装蔗糖梯度混合器的各个部件（如表3所述，见图1）。
<ol>
	<li>在底板面包板（A1）上安装两个垂直支架（A2）。</li>
	<li>使用两个细型直角支架（B2）将线性位移台执行器安装到底板面包板（A1）上。</li>
	<li>使用Ø12.7 mm铝制支撑杆（C2）上的紧定螺钉，将其固定在管架底板面包板（C1）上，作为管架的支架。</li>
	<li>将Ø1/2&#34;转Ø6 mm的直角杆夹（C3）与支撑杆（C2）和微型光学杆（C4）组装在一起。</li>
	<li>使用光学杆（C4）上的紧定螺钉连接一个小V型夹（C5），作为管架。</li>
	<li>将离心管放入管架中，并调整角度使其垂直。标记离心管的位置，并在底板面包板（C1）上安装基座杆架（C6）以支撑离心管。</li>
	<li>在面包板（A1）的另一侧，使用Ø12.7 mm铝制支撑杆（D1）上的紧定螺钉将其固定，并通过一个Ø1/2&#34;转Ø6 mm的直角杆夹（D2）连接微型光学杆（D3）。</li>
	<li>将微型V型夹（D4）与钝端针头（D5）连接至支撑杆（D3）。调整夹具角度使针头保持垂直，并调节支撑杆长度，确保针头与离心管接触。</li>
	<li>将执行器（B1）连接至步进电机驱动器（E1），并使用UNO R3控制板及UNO入门套件中的摇杆模块（E2）控制执行器。可使用电源适配器（例如9–24 V AC/DC可调电源适配器）单独为电机供电。</li>
	<li>将注射泵（F）放置在梯度生成装置旁边，并将注射器与针头连接。</li>
	<li>使用摇杆控制管架平台上下移动。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组件</td>
			<td>项目</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B1</td>
			<td>线性滑台执行器</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E1</td>
			<td>步进电机驱动器</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E2</td>
			<td>UNO项目超级启动套件</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1</td>
			<td>面包板</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A2</td>
			<td>垂直支架</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B2</td>
			<td>窄型直角支架</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1</td>
			<td>微型系列面包板</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C5</td>
			<td>小型V型夹</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D4</td>
			<td>微型V型夹</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2</td>
			<td>Ø12.7 mm铝制立柱</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C4, D3</td>
			<td>微型系列光学立柱</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D1</td>
			<td>Ø12.7 mm铝制立柱</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C3, D2</td>
			<td>直角型Ø1/2&#34;转Ø6 mm立柱夹</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C6</td>
			<td>微型系列底座立柱固定座</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D5</td>
			<td>钝端针头</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F</td>
			<td>注射泵</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：梯度生成系统的组成部件。
10. 分离与检测系统组装（图2）。
<ol>
	<li>使用普通的圆口滴定管夹将紫外监测仪的光学模块固定在穿管器上。将一段 tubing（1 cm 长，内径 0.56 mm）一端连接至穿管器的接口，另一端连接至光学模块的 Fluid In 接口。将 Fluid Out 接口连接至组分收集器。</li>
	<li>根据制造商的操作手册，将光学模块与紫外监测仪的控制单元连接。</li>
	<li>根据制造商的操作手册，使用分线电缆将信号输出插座连接至地面的数字转换器，并连接模拟输入接口。</li>
	<li>使用普通 USB 线缆将数字转换器连接至笔记本电脑，并使用数据采集软件记录转换后的数字信号。</li>
</ol>

<ol><li>Götz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The cell biology of neurogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).</li>
<li>Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+specification+of+neural+fates+by+transcription+factor+codes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes.</a> Development. 134, 3771-3780 (2007).</li>
<li>Fiddes, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-Specific+NOTCH2NL+Genes+Affect+Notch+Signaling+and+Cortical+Neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Human-Specific NOTCH2NL Genes Affect Notch Signaling and Cortical Neurogenesis.</a> Cell. 173, 1356-1369 (2018).</li>
<li>Lennox, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+DDX3X+mutations+impair+RNA+metabolism+and+neurogenesis+during+fetal+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pathogenic DDX3X mutations impair RNA metabolism and neurogenesis during fetal cortical development.</a> Neuron. 106, 404-420 (2020).</li>
<li>Martynoga, B., Drechsel, D., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+control+of+neurogenesis%3A+A+view+from+the+mammalian+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspective+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular control of neurogenesis: A view from the mammalian cerebral cortex.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 4 (10), 008359(2012).</li>
<li>Amadei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Smaug2-based+translational+repression+complex+determines+the+balance+between+precursor+maintenance+versus+differentiation+during+mammalian+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Smaug2-based translational repression complex determines the balance between precursor maintenance versus differentiation during mammalian neurogenesis.</a> Journal of Neurosci. 35, 15666-15681 (2015).</li>
<li>Yang, G., Smibert, C. A., Kaplan, D. R., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+eIF4E1%2F4E-T+complex+determines+the+genesis+of+neurons+from+precursors+by+translationally+repressing+a+proneurogenic+transcription+program%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An eIF4E1/4E-T complex determines the genesis of neurons from precursors by translationally repressing a proneurogenic transcription program.</a> Neuron. 84, 723-739 (2014).</li>
<li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Glo1-Methylglyoxal+pathway+that+is+perturbed+in+maternal+diabetes+regulates+embryonic+and+adult+neural+stem+cell+pools+in+murine+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Glo1-Methylglyoxal pathway that is perturbed in maternal diabetes regulates embryonic and adult neural stem cell pools in murine offspring.</a> Cell Reports. 17, 1022-1036 (2016).</li>
<li>Kraushar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+defined+neocortical+translation+and+polysome+assembly+are+determined+by+the+RNA-binding+protein+Hu+antigen+R%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111, 3815-3824 (2014).</li>
<li>Rodrigues, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylglyoxal+couples+metabolic+and+translational+control+of+Notch+signalling+in+mammalian+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Methylglyoxal couples metabolic and translational control of Notch signalling in mammalian neural stem cells.</a> Nature Communications. 11, 2018(2020).</li>
<li>Iwasaki, S., Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+toolbox+for+protein+synthesis+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The growing toolbox for protein synthesis studies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).</li>
<li>Chekulaeva, M., Landthaler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyes+on+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Eyes on translation.</a> Molecular Cell. 63, 918-925 (2016).</li>
<li>Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Selective+mRNA+Translation+in+Mammalian+Cells+by+Polysome+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e52295(2014).</li>
<li>Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+translation+using+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of translation using polysome profiling.</a> Nucleic Acids Research. 45, 15(2017).</li>
<li>Schneider-Poetsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+eukaryotic+translation+elongation+by+cycloheximide+and+lactimidomycin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin.</a> Nature Chemical Biology. 6, 209-217 (2010).</li>
<li>Kraushar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalamic+WNT3+secretion+spatiotemporally+regulates+the+neocortical+ribosome+signature+and+mRNA+translation+to+specify+neocortical+cell+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%3A+Official+Journal+of+Society+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Thalamic WNT3 secretion spatiotemporally regulates the neocortical ribosome signature and mRNA translation to specify neocortical cell subtypes.</a> Journal of Neuroscience: Official Journal of Society of Neuroscience. 35, 10911-10926 (2015).</li>
<li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e51455(2014).</li>
</ol>

作者声明无竞争利益。

多核糖体分析是一种常用且强大的技术，可用于评估单个基因水平和全基因组水平的翻译状态14。在本报告中，我们介绍了一种使用自制平台进行多核糖体分析的实验方案，并展示了其在分析小鼠大脑皮层发育过程中的应用。该平台成本低廉、易于组装，能够生成稳定且可重复的蔗糖梯度，实现高灵敏度的多核糖体分析。
值得注意的是，制备均一且高质量的蔗糖梯度对于获得可重复的多聚核糖体分析结果至关重要17。在梯度制备过程中，10–50% 蔗糖溶液的体积变化可能导致多聚核糖体峰的偏移，并造成后续分析结果的不一致。此外，在插入和拔出针头时扰动梯度也会导致梯度制备的不一致。与其他方法及商用设备相比，我们自制的梯度制备系统采用电机驱动平台以减少制备过程中对梯度的扰动，并使用注射泵精确分配蔗糖溶液，从而为梯度制备提供了一种廉价且简便的解决方案。
将本研究中提供的多聚核糖体分析平台和方案应用于发育中的小鼠大脑皮层，我们发现核糖体蛋白 Rpl10 以及细胞质蛋白 Gapdh 和 ...

在哺乳动物大脑发育过程中，神经干细胞通过增殖和分化产生神经元和胶质细胞1,2。该过程若受到干扰，可能导致脑结构和功能的改变，这在许多神经发育障碍中可见3,4。神经干细胞的正常行为依赖于特定基因的协调表达5。尽管这些基因的表观遗传调控和转录调控已被广泛研究，但近期研究发现，其他层次的基因调控也在协调神经干细胞增殖与分化过程中发挥重要作用6,7,8,9,10。因此，深入研究翻译水平的调控机制将极大促进我们对神经干细胞命运决定及大脑发育机制的理解。
目前广泛应用于评估mRNA翻译状态的三种主要技术各有优势，包括核糖体谱分析（ribosome profiling）、翻译核糖体亲和纯化（translating ribosome affinity purification, TRAP）和多聚核糖体谱分析（polysome profiling）。核糖体谱分析利用RNA测序技术检测受核糖体保护的mRNA片段，从而全局分析每条转录本上翻译中核糖体的数量和位置，并通过与转录本丰度比较间接推断翻译速率11。TRAP技术则利用表位标记的核糖体蛋白来富集与核糖体结合的mRNA12。由于可通过遗传学方法在特定细胞类型中表达标记的核糖体蛋白，TRAP能够实现细胞类型特异性的翻译分析。相比之下，多聚核糖体谱分析采用蔗糖密度梯度离心法，将未结合或翻译效率较低的游离mRNA（较轻的单体核糖体）与正在被多个核糖体活跃翻译的mRNA（较重的多聚核糖体）分离开来，从而直接测量mRNA上的核糖体密度13。该技术的一个优势在于其灵活性，既可用于研究特定目标mRNA的翻译情况，也可用于全基因组范围的翻译组分析14。
本文中，我们描述了一种用于分析发育中小鼠大脑皮层的多聚核糖体分析详细实验方案。我们使用自行组装的系统制备蔗糖密度梯度，并收集用于下游应用的组分。此处提供的方案可轻松适用于分析其他类型的组织和生物体。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 无RNA酶离心管</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 培养皿</td><td>Greiner-Bio</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>1M MgCl₂</td><td>Invitrogen</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>21-23G 针头</td><td>BD</td><td>305193</td><td></td></tr><tr><td>2M KCl</td><td>Invitrogen</td><td>AM8640G</td><td></td></tr><tr><td>30 mL 注射器</td><td>BD</td><td>302832</td><td></td></tr><tr><td>钝头针头</td><td>VWR</td><td>20068-781</td><td></td></tr><tr><td>光学实验平台</td><td>Thorlabs</td><td>MB2530/M</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Sigma</td><td>115-39-9</td><td></td></tr><tr><td>CD1 小鼠</td><td></td><td>Charles River Laboratory</td><td></td></tr><tr><td>弯头镊子</td><td>Sigma</td><td>#Z168785</td><td></td></tr><tr><td>放线菌酮（Cycloheximide）</td><td></td><td>Sigma</td><td>66-81-9</td></tr><tr><td>数据采集软件 TracerDAQ</td><td>Measurement Computing</td><td></td><td></td></tr><tr><td>数字转换器</td><td></td><td>Measurement Computing</td><td>USB-1208LS</td></tr><tr><td>Direct-zol RNA 小量提取试剂盒</td><td>Zymo</td><td>R2070</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Bio-basic</td><td>12-03-3483</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Bioshop</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Dumont No.5 镊子</td><td>Sigma</td><td>#F6521</td><td></td></tr><tr><td>组分收集器</td><td>Bio-Rad</td><td>Model 2110</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Wisent</td><td>311-513-CL</td><td></td></tr><tr><td>线性位移执行器</td><td>Rattmmotor</td><td>CBX1605-100A</td><td></td></tr><tr><td>荧光素酶对照RNA</td><td>Promega</td><td>L4561</td><td></td></tr><tr><td>Maxima 第一链cDNA合成试剂盒</td><td>Thermo Fisher</td><td>M1681</td><td></td></tr><tr><td>微型V型夹具</td><td>Thorlabs</td><td>VH1/M</td><td></td></tr><tr><td>迷你系列光学实验平台</td><td>Thorlabs</td><td>MSB7515/M</td><td></td></tr><tr><td>迷你系列光学支架</td><td>Thorlabs</td><td>MS2R/M</td><td></td></tr><tr><td>迷你系列底座支架</td><td>Thorlabs</td><td>MBA1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bio-basic</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>&amp;Oslash;12.7 mm 铝制支架</td><td>Thorlabs</td><td>TRA150/M</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>Bemis</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>PerfeCTa SYBR Green FastMix</td><td>Quanta Bio</td><td>CA101414-274</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Wisent</td><td>311-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素（Puromycin）</td><td>Bioshop</td><td>58-58-2</td><td></td></tr><tr><td>直角夹具</td><td>Thorlabs</td><td>RA90/M</td><td></td></tr><tr><td>直角 &amp;Oslash;1/2&quot; 转 &amp;Oslash;6 mm 支架夹具</td><td>Thorlabs</td><td>RA90TR/M</td><td></td></tr><tr><td>RNase AWAY</td><td>Molecular BioProducts</td><td>7002</td><td></td></tr><tr><td>无RNase吸头</td><td>Frogga Bio</td><td>FT10, FT200, FT1000</td><td></td></tr><tr><td>无RNase水</td><td>Wisent</td><td>809-115-CL</td><td></td></tr><tr><td>RNasin</td><td>Promega</td><td>N2111</td><td></td></tr><tr><td>窄型直角支架</td><td>Thorlabs</td><td>AB90B/M</td><td></td></tr><tr><td>小型V型夹具</td><td>Thorlabs</td><td>VC1/M</td><td></td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma</td><td>302-95-4</td><td></td></tr><tr><td>步进电机驱动器</td><td>SongHe</td><td>TB6600</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Bioshop</td><td>57501</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti 转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-4500</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-4500</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bio-basic</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>管穿刺器</td><td>Brandel</td><td>BR-184</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机</td><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>L8-70M</td></tr><tr><td>超速离心管</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>UNO Project 超级入门套件</td><td>Elegoo</td><td>EL-KIT-003</td><td></td></tr><tr><td>紫外监测仪</td><td>Bio-Rad</td><td>EM-1 Econo</td><td></td></tr><tr><td>垂直支架</td><td>Thorlabs</td><td>VB01A/M</td><td></td></tr></tbody></table>

利用多聚核糖体分析法研究小鼠发育大脑中的翻译过程

Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling

哺乳动物大脑的正常发育依赖于神经干细胞增殖与分化为不同神经细胞类型的精细平衡。这种平衡受到基因表达的严格调控，而基因表达在多个层面（包括转录、转录后和翻译）被精确调节。在此背景下，越来越多的证据表明，翻译调控在协调神经干细胞命运决定中发挥着关键作用。多聚核糖体（polysome）分离是一种强大的工具，可用于在全基因组范围及单个基因水平上评估 mRNA 的翻译状态。本文介绍了一种自主建立的多聚核糖体分析流程，用于检测小鼠发育中大脑皮层细胞的翻译效率。我们详细描述了蔗糖梯度制备、组织裂解、超速离心以及基于组分分离的 mRNA 翻译状态分析的实验方案。

作为示例，将来自8个胚胎的皮层裂解液（含75 µg RNA）通过蔗糖梯度离心分离为12个组分。在254 nm处的紫外吸收峰可识别出含有40S亚基、60S亚基、80S单核糖体及多聚核糖体的组分（图4A）。通过蛋白质印迹分析各组分中大核糖体亚基Rpl10的分布，结果显示其存在于60S亚基（第3组分）、单核糖体（第4组分）以及多聚核糖体（第5–12组分）中（图4B）。相比之下，细胞质蛋白Gapdh和Csde1不与核糖体结合，而在含有游离RNA的组分（第1组分）中富集（图4B）。与不同组分中蛋白质的分离结果一致，我们发现gapdh和sox2 mRNA在富含重多聚核糖体（每个mRNA结合三个以上核糖体，位于第7–12组分）的组分中高度富集，表明gapdh和sox2 mRNA在发育中的皮层中被高效翻译（图4C，D</stron...

哺乳动物大脑的发育需要在翻译水平上对基因表达进行精确调控。本文介绍了一种多聚核糖体分析系统，该系统配备易于组装的蔗糖梯度制备与分级分离平台，可用于评估发育中大脑内mRNA的翻译状态。

哺乳动物大脑的正常发育依赖于神经干细胞增殖与分化为不同类型神经细胞之间的精细平衡……

转录调控在大脑发育过程中发挥着重要作用。多聚核糖体分析提供了一种有用且强大的工具，用于评估 mRNA 的翻译状态，从而能够研究大脑发育过程中翻译调控的功能。该方法是一种简便且低成本的制备蔗糖梯度并分析多聚核糖体分级组分的技术。在本实验方案中，该方法用于分析发育中的小鼠大脑皮层。然而，它也可轻松地适用于研究其他系统。首先将2.2摩尔的蔗糖稀释，制备六份10%至50%的蔗糖梯度溶液。用一个30毫升注射器吸取约16毫升10%蔗糖溶液，将其安装在注射泵上，并连接至针头。确保注射器、管路和针头中无任何气泡，并用擦拭纸擦去针尖处的残留液体。移动电动载物台，使针尖接触底部管壁的中心位置。将注射泵设置为流速每分钟2毫升，体积为2.3毫升。在加入2.3毫升10%蔗糖溶液后，下调电动载物台，并对全部六个梯度重复此过程。随后将20%蔗糖溶液加至管底，接着依次加入30%、40%和50%的溶液。在胚胎发育第12天收集CD1小鼠胚胎，并将其置于含有冰冻HBSS的10厘米培养皿中，置于冰上。在解剖镜下，将一个胚胎转移至含有冰冷 HBSS 的 6 厘米培养皿中。使用 21 至 23 号针头以 45 度角穿刺眼睛，固定头部位置，并施加力量确保针头牢固固定在培养皿上。用 5 号镊子从中线向两侧剥离皮肤和颅骨，随后切断嗅球并去除脑膜，以暴露皮层组织。使用弯头镊子将皮层组织剪碎，并放入冰上盛有 2 至 3 毫升神经基础培养基的容器中。根据需要，可分别取自不同胚胎的组织。通常 8 至 10 个胚胎的组织可获得约 200 微克总 RNA。将环己酰亚胺加入含有已解剖组织的神经基础培养基中，使其终浓度为 100 微克/毫升，并在 37 摄氏度孵育 10 分钟。在 4 摄氏度下以 500 × g 离心组织 5 分钟，弃去上清液。用预冷的 PBS 缓冲液（含 100 微克/毫升环己酰亚胺）洗涤组织两次。加入500微升细胞裂解缓冲液，其中添加4微升RNase抑制剂，用移液器吹打混匀以重悬组织。使用胰岛素针头轻轻裂解组织。然后将样品置于冰上孵育10分钟，每隔两到三分钟短暂涡旋振荡一次。孵育后，在 4 °C 条件下以 2000 × g 离心 5 分钟，将上清液转移至预冷的新离心管中。重复此步骤一次，离心条件为 13,000 × g。将上清液转移至预冷的新离心管后，使用紫外-可见分光光度计测定组织裂解液中的 RNA 浓度。将裂解液缓慢加样至超速离心管管壁，使样品加载到蔗糖梯度溶液的上方。将蔗糖梯度管轻轻放入转子套管中，并在190,000 × g、4°C条件下超速离心90分钟。将一支空的超速离心管置于穿刺架上，从底部用针头轻轻刺穿离心管。用一个30毫升注射器吸取25毫升60%蔗糖追赶溶液。然后轻轻推动注射器，使追赶溶液充满空管并流经254纳米紫外检测器，以设定检测基线。按下紫外检测器上的自动调零按钮以记录检测基线，然后点击软件上的播放按钮开始记录。系统建立基线后，暂停软件上的记录，并撤回追加溶液，确保系统中无残留的追加溶液。将一个样品管装入穿管针座，从底部轻轻用针头刺穿样品管。开始软件记录，确保管路中无气泡。然后启动注射泵和组分收集器，以收集多聚核糖体组分，将组分收集器设置为每30秒收集一管。将各组分收集至1.5毫升离心管中。来自八个胚胎皮层裂解液的RNA样品经蔗糖梯度离心后被分离为12个组分。在254纳米波长处的紫外吸收峰可识别出含有40S亚基、60S亚基、80S单体核糖体及多聚核糖体的组分。通过Western blot检测大核糖体亚基Rpl10发现，该蛋白存在于60S亚基、单体核糖体及多聚核糖体中。相比之下，细胞质蛋白Gapdh和Csde1不与核糖体结合，而在含有游离RNA的组分中富集。与不同组分中蛋白质的分离结果一致，Gapdh 和 sox2 mRNA 在富含重多聚核糖体的组分中显著富集，表明这些 mRNA 在发育中的大脑皮层中能够被高效翻译。相比之下，rpl7 和 rpl35 mRNA 则在含有单核糖体的组分中富集，提示其翻译受到抑制。为了获得可重复的实验结果，制备蔗糖梯度时保持操作的一致性至关重要。应使用注射泵来推出蔗糖。在进行梯度分离和样品收集过程中，需用无RNase的水清洗系统，以减少前一个样品残留的任何蔗糖。该方法可用于评估各种组织中 mRNA 的翻译状态。利用该平台可获得稳定的多聚核糖体分析梯度，为这一经典且有用的技术提供了一种低成本的解决方案。

analysis-translation-developing-mouse-brain-using-polysome

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

使用多体分析在发育中的鼠标大脑中进行翻译分析

本文介绍了一种用于分析真核细胞在应激条件下mRNA翻译起始变化的方法。该方法基于正在翻译的核糖体与非翻译核糖体在蔗糖梯度中沉降速度的差异进行分离。...

应激条件下通过多聚核糖体分析检测翻译起始

本方案介绍了多核糖体分级分离的关键改进方法，用于研究体内中枢神经系统（CNS）样本的翻译组。通过分离并比较总RNA与核糖体结合的RNA组分，可实现对翻译和转录调控的全局评估。...

in vivo 中通过多聚核糖体分级分离研究中枢神经系统翻译组

核糖体在蛋白质合成中起着核心作用。通过蔗糖密度梯度离心法对多核糖体（多聚体）进行分级分离，可直接在全基因组范围内测定各个mRNA的翻译效率。此外，该方法还可用于对与核糖体和多核糖体相关的分子（如分子伴侣和信号分子）进行生物化学分析。...

多聚核糖体分级分离及哺乳动物转译组的全基因组规模分析

细胞适应应激的能力对其存活至关重要。mRNA 翻译的调控即为一种此类适应策略，可实现对蛋白质组的快速调控。本文提供了一种标准化的多聚体分析流程，用于鉴定在应激条件下被选择性翻译的特定...

通过多聚体图谱分析评估哺乳动物细胞中mRNA的选择性翻译

蛋白质合成的调控主要发生在翻译起始阶段，该过程的缺陷与多种疾病相关。为了更好地理解这些疾病的病因，本文描述了一种利用非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵母细胞评估在翻译起始因子 eIF4G1 突变体存在条件下 mos...

Xenopus laevis 作为鉴定翻译障碍的模型

尽管核糖体结构已被广泛表征，多聚核糖体的结构组织仍研究较少。为弥补这一知识空白，本文提供了一种详细的制备方案，用于在空气和液体环境中通过原子力显微镜（AFM）对哺乳动物多聚核糖体进行精确成像。...

利用原子力显微镜观察脑组织多聚核糖体

多核糖体分析技术的总体目标是分析蛋白质合成过程中单个mRNA或转录组mRNA的翻译活性。该方法对于研究健康状态及多种人类疾病中的蛋白质合成调控、翻译激活与抑制具有重要意义。...

利什曼原虫、人细胞和小鼠睾丸中的多聚核糖体分析

本文介绍了一种在离体灌注小鼠心脏上进行多聚核糖体分析的实验方案。我们描述了心脏灌注、多聚核糖体分析的方法，以及针对多聚核糖体组分中mRNA、miRNA和多聚核糖体蛋白质组的分析方法。...

离体小鼠心脏Langendorff灌注后多聚核糖体的动态蛋白质组学与miRNA分析

本文介绍了利用RiboTag系统从成年雄性小鼠特定生殖细胞群体中免疫沉淀核糖体及其结合RNA的方法。通过合理的杂交育种和严谨的免疫沉淀操作，可获得纯净且可重复的结果，从而揭示生殖细胞的翻译组特征，并有助于深入理解突变表型的作用机制。...

雄性小鼠生殖细胞中的RiboTag免疫沉淀

本方案描述了一种报告基因检测方法，用于研究单个卵母细胞中mRNA翻译的调控过程 体外...

利用单卵母细胞报告基因检测法定义体外成熟过程中母源mRNA翻译程序

本实验方案描述了如何在不使用自动梯度生成仪或梯度分段收集系统的情况下，制备多聚核糖体图谱。...

无需梯度混合器或组分分离系统的多聚核糖体分析

学习多体分析技术用于发育中小鼠大脑皮层mRNA翻译效率评估的方法。该技术通过蔗糖梯度离心分离核糖体亚基、单体和多体，结合紫外吸收和蛋白质印迹分析，为神经科学研究提供经济可靠的研究手段。

利用多聚核糖体分析法研究小鼠发育大脑中的翻译过程

探索更多视频