使用多体分析在发育中的鼠标大脑中进行翻译分析
2021年5月22日
哺乳动物大脑的发展需要在翻译水平上正确控制基因表达。在这里，我们描述了一个多体分析系统，该系统具有易于组装的蔗糖梯度制作和分馏平台，以评估 mRNA 在发育中的大脑中的转化状态。
转化调节在大脑发育中起着重要的作用。多体分析提供了一个有用和强大的工具来评估mRNA的转化状态，使得在大脑发育过程中检查转化控制功能成为可能。这种方法是一种简单和低成本的方法，使蔗糖梯度和评估多体分馏。
在此协议中，它用于分析正在发育的鼠标皮层。然而，它可以很容易地适应研究其他系统。首先稀释2.2摩尔蔗糖，准备6个10至50%蔗糖梯度。
用大约 16 毫升的 10% 蔗糖填充 30 毫升注射器，将其放在注射器泵上并将其连接到针头。确保注射器、管子或针头中没有气泡，并擦拭针尖以去除任何残留溶液。将电动舞台向上移动，使针尖接触底部管的中心。
将注射器泵设置为每分钟两毫升的流量，体积为 2.3 毫升。分配 2.3 毫升 10% 蔗糖溶液后，向下移动机动阶段，并重复所有六个梯度的过程。然后在管子底部加入20%蔗糖溶液，然后在第12天收集30、40和50%收集CD1小鼠胚胎，并将它们放在含有冰冷HBSS的10厘米板中。
在解剖范围下，将一个胚胎转移到一个含有冰冷HBSS的6厘米板上。使用 21 到 23 个仪表针，通过 45 度角穿透眼睛来固定头部位置，并施加力确保针头固定在盘子上。使用五号钳子去除从中间到两侧工作的皮肤和头骨，然后切开嗅球，去除脑膜，露出皮质组织。
使用弯曲的钳子将皮质组织切成冰上两到三毫升的神经巴萨介质。根据需要从不同的胚胎中提取组织。从8个胚胎到10个胚胎的组织通常给出大约200微克的总RNA。
将环丙酰胺加入神经巴氏介质，将解剖组织最终浓度为每毫升100微克，并在37摄氏度下孵育10分钟。在 500 x g 下将组织在摄氏 4 度下分离 5 分钟，然后丢弃超自然人。用冰冷的PBS两次清洗组织，并辅以每毫升环丙酰胺100微克。
加入500微升细胞裂解缓冲器，并辅以四微升的RNase抑制剂和移液器上下，以恢复组织。使用胰岛素针轻轻解洗组织。然后在冰上孵育10分钟，每两到三分钟短暂旋转一次。
孵化后，在2000×g下将离心解水在摄氏4度下5分钟，并将超自然物转移到冰上新的离心管。在 13，000 x g 时再次重复此过程离心。将超自然物转移到冰上的新离心管后，使用紫外线-维斯光谱仪测量组织测定液中的RNA浓度。
将利萨酸盐慢慢分配到超中轴管的墙壁上，将样品加载到蔗糖梯度上。轻轻地将蔗糖梯度放在桶中，并在 19 万 x g 和 4 摄氏度下将样品置于超中心，持续 90 分钟。在管穿孔器上放置一个空的超中心管，然后用针头从底部轻轻穿透管子。
用 25 毫升 60% 蔗糖追逐溶液填充 30 毫升注射器。然后轻轻按压注射器，使追逐液填充空管，并通过 254 纳米紫外线监视器设置基线进行检测。在紫外线监视器上按自动零度以注册基线进行检测，然后按"播放"软件开始录制。
一旦系统建立基线，暂停在软件上录制并收回追逐解决方案，确保系统中没有残余的追逐解决方案。将一个样品管加载到管穿孔器上，然后用针头从底部轻轻穿透管子。开始在软件上录制，确保线路中没有气泡。
然后启动注射器泵和分数收集器收集多体分数，将分水器设置为 30 秒。将分数收集到 1.5 毫升管中。从8个胚胎中提取的含有RNA的皮质分析液通过蔗糖梯度分离成12个分数。
254纳米的紫外线吸收峰值确定了包含40S亚单位60S亚单位和80S单体和多体的分数。对大型核糖体亚单位 Rpl10 的西方污点的分数的分析表明，它存在 60S 亚单位单体和聚体。相比之下，细胞质蛋白Gapdh和Csde1与核糖体无关，而是富含含有自由RNA的分数。
与不同分数的蛋白质分离一致，Gapdh 和 sox2 mRNA 在含有重聚体的分数中高度丰富，表明这些 mRNA 在发育中的皮层中得到了有效的转化。相比之下，rpl7和rpl35 mRNA在包含单体的分数中得到了丰富，这表明了压抑的翻译。为了获得可重复的结果，在制作蔗糖梯度时保持一致性非常重要。
注射器泵应用于喷射蔗糖。在分馏和样品收集过程中，使用无 RNase 水清洗系统非常重要。这减少了前一个样本中剩余的蔗糖。
此方法可用于评估各种组织中 mRNA 的转化状态。利用该平台，可以获得聚体分析的一致梯度，这为这种经典而有用的技术提供了低成本的解决方案。
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概述
本研究介绍了一种多核糖体分析系统，旨在评估发育中哺乳动物大脑中mRNA的翻译状态。该方法利用易于组装的蔗糖梯度制作和分离平台来分析发育中小鼠皮层的翻译控制功能。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 基因表达
- 发育生物学
背景
- 翻译调控对大脑发育至关重要。
- 多核糖体分析是检查mRNA翻译的有效技术。
- 该方法允许低成本实验，可以适应各种系统。
研究目的
- 开发一个平台来评估mRNA的翻译状态。
- 调查翻译控制在发育中大脑中的作用。
- 为该领域的研究人员提供一个易于使用的协议。
所用方法
- 该研究采用蔗糖梯度制作和分离平台。
- 生物模型包括发育中的小鼠皮层，特别是分析皮层组织。
- 重要的时间线包括各种蔗糖梯度的制备和随后的离心步骤。
- 其他关键步骤包括组织解剖、RNA测量和UV监测。
主要结果
- 该方法成功地根据翻译状态分离mRNA，识别出不同的核糖体亚基和多核糖体。
- 特定的mRNA与重多核糖体相关，表明活跃的翻译，而其他的则富集在单核糖体组分中，表明翻译受到抑制。
- Western blot 分析确认了在识别的组分中存在特定的核糖体蛋白。
结论
- 本研究实现了一种重复性方法来检查大脑发育过程中的mRNA翻译。
- 该方法的适应性允许在各种组织中进行评估，有助于我们理解神经元机制。
- 对翻译控制的见解可能为未来的神经元可塑性和发育研究提供信息。
常见问题
Executive Industry Relevance
Translational regulation is a critical inflection point in neurodevelopmental target validation and mechanistic de-risking for CNS drug discovery. Polysome profiling enables direct measurement of mRNA translation efficiency, providing predictive confidence in gene expression control during neural differentiation. This capability supports risk-adjusted portfolio decisions by clarifying translational bottlenecks in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of translational control mechanisms underlying neural stem cell fate decisions.
- Supports functional target validation by distinguishing actively translated mRNAs from repressed transcripts.
- Facilitates mechanistic de-risking by mapping translational outputs to specific gene targets.
- Improves predictive confidence in pathway modulation strategies for neurodevelopmental disorders.
Screening & Assay Development
- Prepares validated neural tissue systems for downstream compound screening workflows.
- Delivers quantitative, reproducible readouts of mRNA translation status across gene targets.
- Enables assay standardization and platform reuse for translational efficiency measurements.
- Supports reliable evaluation of candidate molecules impacting translational regulation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns translational biomarker discovery with disease-relevant neural models.
- Ensures continuity from early discovery through preclinical validation of translational control points.
- Informs risk-adjusted advancement decisions by clarifying translational bottlenecks.
- Provides mechanistic insight into gene expression regulation in developing brain tissue.
Pipeline & Workflow Integration
Polysome profiling integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical research, enabling direct assessment of translational regulation in neural tissues.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying translation of specific mRNAs.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Delivers UV absorbance and Western blot readouts to compare translational status across conditions.
- Translational Research: Connects molecular findings to disease-relevant neural systems for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable platform for translational studies across diverse tissues.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurodevelopmental target validation.
- Operational Value: Enables standardized, reproducible, and scalable translational profiling workflows.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization and advancement of CNS discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neural tissue dissection and RNA handling.
- Needs access to ultracentrifugation and UV absorbance instrumentation.
- Demands rigorous cross-team standardization of gradient preparation and sample processing.
- Adaptable to various tissue types and developmental stages with protocol optimization.
- Reproducibility depends on consistent gradient formation and RNase-free conditions.
