使用多体分析在发育中的鼠标大脑中进行翻译分析

转化调节在大脑发育中起着重要的作用。多体分析提供了一个有用和强大的工具来评估mRNA的转化状态，使得在大脑发育过程中检查转化控制功能成为可能。这种方法是一种简单和低成本的方法，使蔗糖梯度和评估多体分馏。

在此协议中，它用于分析正在发育的鼠标皮层。然而，它可以很容易地适应研究其他系统。首先稀释2.2摩尔蔗糖，准备6个10至50%蔗糖梯度。

用大约 16 毫升的 10% 蔗糖填充 30 毫升注射器，将其放在注射器泵上并将其连接到针头。确保注射器、管子或针头中没有气泡，并擦拭针尖以去除任何残留溶液。将电动舞台向上移动，使针尖接触底部管的中心。

将注射器泵设置为每分钟两毫升的流量，体积为 2.3 毫升。分配 2.3 毫升 10% 蔗糖溶液后，向下移动机动阶段，并重复所有六个梯度的过程。然后在管子底部加入20%蔗糖溶液，然后在第12天收集30、40和50%收集CD1小鼠胚胎，并将它们放在含有冰冷HBSS的10厘米板中。

在解剖范围下，将一个胚胎转移到一个含有冰冷HBSS的6厘米板上。使用 21 到 23 个仪表针，通过 45 度角穿透眼睛来固定头部位置，并施加力确保针头固定在盘子上。使用五号钳子去除从中间到两侧工作的皮肤和头骨，然后切开嗅球，去除脑膜，露出皮质组织。

使用弯曲的钳子将皮质组织切成冰上两到三毫升的神经巴萨介质。根据需要从不同的胚胎中提取组织。从8个胚胎到10个胚胎的组织通常给出大约200微克的总RNA。

将环丙酰胺加入神经巴氏介质，将解剖组织最终浓度为每毫升100微克，并在37摄氏度下孵育10分钟。在 500 x g 下将组织在摄氏 4 度下分离 5 分钟，然后丢弃超自然人。用冰冷的PBS两次清洗组织，并辅以每毫升环丙酰胺100微克。

加入500微升细胞裂解缓冲器，并辅以四微升的RNase抑制剂和移液器上下，以恢复组织。使用胰岛素针轻轻解洗组织。然后在冰上孵育10分钟，每两到三分钟短暂旋转一次。

孵化后，在2000×g下将离心解水在摄氏4度下5分钟，并将超自然物转移到冰上新的离心管。在 13，000 x g 时再次重复此过程离心。将超自然物转移到冰上的新离心管后，使用紫外线-维斯光谱仪测量组织测定液中的RNA浓度。

将利萨酸盐慢慢分配到超中轴管的墙壁上，将样品加载到蔗糖梯度上。轻轻地将蔗糖梯度放在桶中，并在 19 万 x g 和 4 摄氏度下将样品置于超中心，持续 90 分钟。在管穿孔器上放置一个空的超中心管，然后用针头从底部轻轻穿透管子。

用 25 毫升 60% 蔗糖追逐溶液填充 30 毫升注射器。然后轻轻按压注射器，使追逐液填充空管，并通过 254 纳米紫外线监视器设置基线进行检测。在紫外线监视器上按自动零度以注册基线进行检测，然后按"播放"软件开始录制。

一旦系统建立基线，暂停在软件上录制并收回追逐解决方案，确保系统中没有残余的追逐解决方案。将一个样品管加载到管穿孔器上，然后用针头从底部轻轻穿透管子。开始在软件上录制，确保线路中没有气泡。

然后启动注射器泵和分数收集器收集多体分数，将分水器设置为 30 秒。将分数收集到 1.5 毫升管中。从8个胚胎中提取的含有RNA的皮质分析液通过蔗糖梯度分离成12个分数。

254纳米的紫外线吸收峰值确定了包含40S亚单位60S亚单位和80S单体和多体的分数。对大型核糖体亚单位 Rpl10 的西方污点的分数的分析表明，它存在 60S 亚单位单体和聚体。相比之下，细胞质蛋白Gapdh和Csde1与核糖体无关，而是富含含有自由RNA的分数。

与不同分数的蛋白质分离一致，Gapdh 和 sox2 mRNA 在含有重聚体的分数中高度丰富，表明这些 mRNA 在发育中的皮层中得到了有效的转化。相比之下，rpl7和rpl35 mRNA在包含单体的分数中得到了丰富，这表明了压抑的翻译。为了获得可重复的结果，在制作蔗糖梯度时保持一致性非常重要。

注射器泵应用于喷射蔗糖。在分馏和样品收集过程中，使用无 RNase 水清洗系统非常重要。这减少了前一个样本中剩余的蔗糖。

此方法可用于评估各种组织中 mRNA 的转化状态。利用该平台，可以获得聚体分析的一致梯度，这为这种经典而有用的技术提供了低成本的解决方案。