利用标准化肠段模型对小鼠肠道通透性及中性粒细胞跨上皮迁移进行功能评估

肠道模型是一种广泛应用且符合生理条件的方法，用于在活体小鼠中测量肠道通透性以及白细胞在肠道内的迁移情况。该方法有助于深入理解肠道通透性增加及病理性肠道炎症的潜在机制。该技术可用于增进我们对肠道屏障功能及病理性炎症机制的认识，这些机制可见于溃疡性结肠炎和克罗恩病。

该模型采用具有良好血管化且外置的小肠节段（回肠或近端结肠），用于检测小鼠肠道屏障功能或免疫细胞募集。由于其应用广泛，肠袢模型可为研究由肠道屏障通透性增加或炎症反应所导致的疾病提供重要见解。通过反复练习手术步骤，可以克服操作中的困难。

充分显露具有完整血供的肠段，并选择合适的结扎位置以避免出血，这是至关重要的。肠袢模型是一种显微外科技术，因此与其他手术操作一样，其实施过程极大受益于直观的演示以及对方法的逐步展示。在达到手术所需的麻醉平面后，首先使用酒精棉片或浸有70%乙醇的纱布海绵擦拭腹部正中线区域的毛发。

避免用酒精大面积浸湿毛发，以防发生低体温。使用剪刀行正中腹切口术，在腹部中央做一横向切口，暴露腹膜，注意勿损伤腹腔内器官。

将预先剪好并浸湿的棉纱布覆盖在暴露的腹腔上。用湿润的棉签游离并外置盲肠，并小心地将其放置在湿润的棉纱布上。然后，游离并轻柔地外置回肠。

将至少六厘米的末端回肠展开于湿润的棉纱布上，注意不要损伤肠系膜血管及其血液供应。始终用温热的HBSS保持暴露组织湿润。在靠近盲肠的肠系膜中辨认出供应回肠的主要动脉。

然后，在肠系膜上找到两个无重要血管的结扎位点。用钝头组织镊牢固夹住回肠末端，用精细尖头镊在肠系膜上穿孔，避开血管。将丝线穿过孔洞，打外科结完成第一处结扎。

使用直尺测量距离第一道结扎线四厘米处，制作第二道结扎线。用精细剪刀在每道结扎线旁小心剪开，以分离出四厘米长的回肠袢，同时保持血液供应和肠系膜膜的完整性。使用连接在10毫升注射器上的柔软黄色喂养管，以温热的HBSS轻轻冲洗回肠袢段内的内容物。

务必冲洗肠腔内容物，使其离开腹腔，以保持手术部位清洁。用丝线结扎已冲洗的回肠袢的两个切断端。使用带有30号针头的1毫升注射器，缓慢向肠腔内注射250 µL试剂，如FITC-葡聚糖或趋化因子。

回肠袢将膨胀，导致黏膜出现中度扩张。使用持针器、解剖镊和带反向切割针的3.0不可吸收丝线缝合关闭腹壁。将动物擦干以防止低体温后，将其放入温度可控的麻醉舱内，进行孵育期观察。

按照先前演示的方法准备小鼠手术，并将盲肠暴露于体外。使用湿润的棉签将整个回肠轻轻推出体外，并置于湿润的棉纱布上。辨认近端结肠以及位于结肠系膜中的血液供应。

游离近端结肠，并在距盲肠约0.5厘米远端的肠系膜无血管区域打第一个结扎线。从第一个结扎线处量取2厘米，于肠系膜无血供区域打第二个结扎线。使用精细剪刀，紧贴每条结扎线旁小心剪断，以分离出一段长2厘米的pcLoop。

使用连接在10毫升注射器上的柔性黄色喂养管，以温热的HBSS轻柔冲洗pcLoop，以清除粪便。确保将管腔内容物冲洗出腹腔，以保持手术部位清洁。随后，使用丝线结扎已冲洗的pcLoop的两个断端。

使用带30号针头的1毫升注射器，缓慢向肠腔内注射200微升试剂（如FITC-葡聚糖或趋化因子）。pcLoop将随之膨胀，导致黏膜适度扩张。用湿润的棉签轻柔地将结扎的pcLoop、回肠和盲肠复位。

使用持针器、解剖镊和带反向切割针的3.0不可吸收丝线缝合腹壁。孵育期结束后，处死麻醉小鼠并采集组织用于分析。为验证I型肠袢模型在评估肠道通透性方面的准确性，进行了FITC-葡聚糖pcLoop检测，以评估紧密连接相关蛋白Jam-a在体内调控肠道屏障功能中的作用。

使用pcLoop模型，与对照组相比，在Jam-a基因敲除小鼠中检测到血清FITC-葡聚糖水平升高了2.5倍。在肠道上皮细胞特异性缺失Jam-a的小鼠中也获得了类似结果。pcLoop模型被用于研究多形核中性粒细胞（PMN）向肠黏膜的募集及其随后在体内的跨上皮迁移过程。

通过流式细胞术分析定量了pcLoop管腔内容物中PMN的数量。在生理条件下，近端结肠节段中存在的PMN数量较低。手术前经促炎性细胞因子TNF alpha和IFN gamma预处理后，导致pcLoop管腔中募集的PMN数量增加。

给予中性粒细胞趋化因子LTB4后，中性粒细胞数量显著增加。结肠黏膜中中性粒细胞的免疫组织化学染色证实了在细胞因子和LTB4刺激后中性粒细胞募集增加。利用在肠上皮细胞中特异性缺失Jam-a的小鼠构建的pcLoop模型，研究了Jam-a在中性粒细胞跨上皮迁移中的作用。

Jam-a上皮缺失导致结肠腔内迁移的中性粒细胞（PMN）数量较同窝对照组减少。该技术的一个关键环节是在手术过程中需注意保持外置肠段的血液供应。按照本方案，还可开展其他方法，如肠道通透性检测和中性粒细胞跨上皮迁移检测，以在体内研究屏障完整性丧失及肠道炎症情况。