Name: 使用附睾白色脂肪组织进行脂肪覆盖的胰岛移植 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: 了解使用附睾白色脂肪组织进行脂肪覆盖胰岛移植的方法，该技术无需生物粘合剂或缝合即可检测腹腔内移植的胰岛，操作简便且易于复制，可应用于多种疾病模型和癌症小鼠模型的构建。

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本研究由日本文部科学省科学研究费补助金（C）（19K09839，NS）资助。

以下操作分为三个步骤进行。第一步包括在受体小鼠中诱导糖尿病以及分离供体胰岛。第二步涉及移植前对胰岛的准备。第三步为将胰岛移植至附睾脂肪组织，并用脂肪组织覆盖胰岛。之后，评估治疗效果。本研究中对小鼠的处理及实验操作均遵循《实验动物护理与使用指南》（《实验动物护理与使用原则》，美国国立卫生研究院第8th&#160;版，2011年）的规定，实验方案已获福冈大学动物护理与使用委员会批准（批准编号：186018）。
1. 手术准备
<ol>
	<li>糖尿病的诱导：通过静脉注射用0.1 M柠檬酸盐缓冲液配制的18 mg/mL链脲佐菌素溶液（180 mg/kg体重），在20–25 g体重、8–12周龄的雄性受体小鼠中诱导糖尿病。血糖水平超过400 mg/dL的小鼠被视为糖尿病小鼠。在诱导糖尿病后1周内使用糖尿病小鼠，以避免附睾白色脂肪组织过度萎缩而影响胰岛包覆。</li>
	<li>胰岛分离：按照Gotoh等人报道的方法27，在移植前一天进行小鼠胰岛的分离。</li>
	<li>简而言之，使用胶原酶溶液消化胰腺组织，通过适当的细胞分离溶液进行密度梯度离心以分离胰岛。随后将胰岛在22 °C和5% CO2条件下培养过夜（据报道，在&#60;37 °C条件下培养可防止胰岛死亡28,29,30,31）。 
	注意：&#160;在生物安全柜中操作纯化的胰岛培养物。所有用于胰岛分离和培养的溶液均需使用0.22 µm滤器过滤除菌。</li>
</ol>
2. 移植用胰岛的制备
<ol>
	<li>按照图1A所示准备相应的仪器和材料。</li>
	<li>由于消化酶（如淀粉酶和脂肪酶）可能损伤分离和移植的胰岛，且胰岛可能因被困在培养皿中的污染性纤维组织中而丢失，因此在移植前，应在解剖显微镜下使用镊子手动挑取胰腺中的非胰岛成分，包括腺泡组织和纤维组织（图1B）。挑取后，使用细胞筛过滤去除单个腺泡细胞。</li>
	<li>将过滤后的胰岛转移至含有适当培养基或缓冲液（例如低糖DMEM、RPMI1640、CMRL1066或HBSS）的新培养皿中，并添加牛血清或白蛋白以防止胰岛黏附于塑料表面，轻轻旋转培养皿使胰岛集中于皿中央（图1C）。使用P200微量移液器并在显微镜下将单个胰岛挑入适当的收集管中（图1D）。</li>
	<li>将一个新的40 μm细胞筛置于50 mL塑料离心管上方（图1E 左图和中图），并用新鲜培养基冲洗滤膜（图1E 右图）。</li>
	<li>使用1000 μL移液器将胰岛加入筛网中，以分离胰岛与单个腺泡细胞（图1F1 和 图1F2）。 
	注意：细胞筛上获得的纯化胰岛纯度可达约100%。</li>
	<li>使用镊子将筛网倒置在含有培养基或添加了牛血清或白蛋白的适当缓冲液的新60 mm或100 mm未处理培养皿上（图1F3 和 图1F4）。用新鲜培养基/缓冲液冲洗胰岛至新的培养皿中。然后向培养皿中加入足够的培养基/缓冲液，使总体积达到约20 mL。</li>
	<li>在显微镜下计数胰岛，并根据供体动物数量将胰岛均分至若干个1.5 mL塑料离心管中（图1G）。例如，来自两只小鼠的共400个100–200 µm胰岛当量（IEQ）应平均分配至两个离心管中，每管加入200个。</li>
	<li>在室温下以2,100 x g离心1分钟&#160;，弃去上清液。通常管内会残留约20–30 µL溶液（图1H）。</li>
</ol>
3. 将胰岛移植至附睾脂肪组织并用附睾白色脂肪组织覆盖
<ol>
	<li>手术前，准备小型动物麻醉机、体视显微镜、光源、50–200 µL 微量移液器及 200 µL 移液器吸头、棉签、4-0 缝合器械包以及已消毒的外科手术器械（图 2A）。将铜剪、眼科剪、Pean 止血钳、镊子和持针器进行高压灭菌。灭菌后，将器械&#160;浸入 1% 聚维酮碘溶液&#160;中（图 2A）。使用棉签用于游离附睾白色脂肪组织，以及在出血时进行止血。使用配备 50–200 µL 吸头的微量移液器进行胰岛移植。</li>
	<li>使用吸入性麻醉剂（2% 异氟烷与氧气混合）对糖尿病受体小鼠实施麻醉。在双眼涂抹眼用润滑剂以防止角膜干燥。随后将小鼠置于仰卧位（图 2B 左），使用电动剃毛器和/或脱毛膏去除腹部毛发以防止感染。&#160;使用聚维酮碘溶液和 70% 乙醇交替擦拭至少三遍，对腹部及腹股沟区域进行消毒&#160;（图 2B 右）。手术前通过检测脚趾夹捏反射是否消失来确认麻醉深度。术中使用加热垫提供保温支持，并使用&#160;手术巾覆盖以维持无菌手术区域。</li>
	<li>在腹部中下部切开皮肤（图 2C 左）。建议切口长度约为 2 cm。使用 Pean 止血钳夹住左侧腹壁（也可使用无创钳或牵开器），将组织向小鼠左侧牵拉以暴露手术视野（图 2C 右）。开腹后，将异氟烷浓度降低至 1.0–1.5% 以维持麻醉。</li>
	<li>使用棉签将小肠和大肠推向小鼠右侧（即操作者左侧）。腹腔内的左侧附睾白色脂肪组织位于左侧腹股沟区域。将左侧附睾白色脂肪组织和左睾丸游离并拉出腹腔外（图 2D 左），并将其组织拉伸展开（图 2D 右）。</li>
	<li>使用配备 200 µL 吸头的 P200 微量移液器，通过轻柔吹打，从一个 1.5 mL 离心管中吸取全部体积的胰岛（图 2E 左），注意确保收集过程中无胰岛残留在管内。让收集的胰岛在重力作用下自然沉降至移液器吸头尖端（图 2E 右）。</li>
	<li>将移液器吸头轻轻接触扩张的脂肪组织表面。注意避免吸头内培养基/缓冲液过度冲出，小心地将胰岛接种至组织表面（图 2F 左）。接种完成后，在解剖显微镜下确认胰岛位置是否正确（图 2F 右）。</li>
	<li>用附睾白色脂肪组织覆盖胰岛（图 2G）。无需使用缝线或生物粘合剂。</li>
	<li>将左睾丸置于附睾白色脂肪组织下方，并将组织复位回腹腔内（图 2H）。使用 4-0 缝线分两层缝合皮肤（先缝合腹膜，再缝合肌肉和皮肤）（可使用尼龙&#160;或可吸收缝线）（图 2I）。在伤口附近皮下注射&#160;乙酰水杨酸（300 mg/kg；SQ）&#160;以进行术后镇痛。&#160;随后将小鼠置于保温灯下&#160;并持续监测直至完全苏醒。</li>
</ol>
4. 胰岛移植后的监测（摘要）
<ol>
	<li>通过监测术后第28天（POD 28）的血糖水平、葡萄糖耐量试验和组织学评估，评估胰岛移植的治疗效果。
	<ol>
		<li>使用小型血糖仪监测血糖水平，包括葡萄糖耐量试验期间的血糖测量。</li>
		<li>从尾静脉采集少量微升体积的血液样本。对于组织学评估，通过免疫组织化学方法检测回收的附睾脂肪组织中移植胰岛内的小鼠胰岛素（用于标记移植成功的胰岛）和血管性血友病因子（用于标记血管，作为胰岛成功植入的证据）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

我们不存在利益冲突。

脂肪覆盖的胰岛移植方法结合了两种不同移植技术的操作：腹腔内胰岛移植和脂肪组织内胰岛移植。由于附睾白色脂肪组织的表面膜被视为被腹膜覆盖且附着于附睾的白色脂肪组织，因此从解剖学角度而言，脂肪覆盖的胰岛移植方法可归类为一种腹腔内胰岛移植。然而，该方法将胰岛递送至受体动物的方式则更接近于脂肪组织内胰岛移植所采用的技术。我们的数据显示，脂肪覆盖的胰岛移植方法的治疗效果优于腹腔内胰岛移植。我们先前的研究还表明，该方法的移植效率几乎与肾包膜下胰岛移植相当，而后者是一种移植效率极高的胰岛移植方法23。据推测，该方法的优势可能源于白色脂肪组织中存在的黏附分子以及脂肪细胞因子，这些成分被认为有助于胰岛的植入与存活10,23。
附睾白色脂肪组织的体积较大，可容纳大量胰岛。相比之下，啮齿动物的大网膜过小，难以容纳并方便地获取大量胰岛。附睾白色脂肪组织作为潜在的实验性胰岛移植部位，唯一的物理限制是其不提供胰岛素的门脉循环<sup class="...

胰岛移植是一种针对严重糖尿病患者的细胞替代疗法。近期报告显示，移植后三年内胰岛素非依赖率可提高至44%1，接受超过600,000个总胰岛当量的受者中约有80%可实现胰岛素非依赖2。此外，在最新的协作性胰岛移植注册报告中显示，超过70%仅接受胰岛移植的患者在5年以上的随访期间空腹血糖水平维持在60–140 mg/dL之间。该研究还发现，约90%仅接受胰岛移植或在肾移植后接受胰岛移植的患者在5年以上未发生任何严重低血糖事件3。
尽管该治疗的临床效果已不断改善，但仍需解决一些局限性，包括需要确定最佳的移植部位。肝脏是临床胰岛移植的典型移植部位，因为它是能够容纳大量胰岛的最大器官。然而，在部分患者中肝脏并不适用（例如由于门静脉高压、肝炎和/或肝硬化4），因此已考虑将其他部位作为替代移植部位，包括肾包膜下间隙5,6、大网膜囊7,8,9,10、肠系膜11、胃肠道12、骨骼肌13、皮下组织13、骨髓14以及脾脏15,16,17。
尽管胰岛的腹腔内移植可在局部麻醉下轻松进行，使得腹腔成为临床胰岛移植的诱人部位，但在移植后，胰岛会分散在整个腹腔内，导致胰岛移植物的检测以及成功植入的确认变得困难。因此，腹腔尚未被广泛认为是理想的临床移植部位。相反，它常被用作临床前研究中的对照模型，以评估包封胰岛18和生物工程化胰岛19移植的效果。然而，由于难以准确评估移植物的植入情况，对生物工程化胰岛与对照胰岛进行精确比较仍存在挑战。
相比之下，将腹膜内白色脂肪组织用于大网膜囊中8，肠系膜及其他肝外部位的受累已有充分报道10,20,21,22,23 并且许多研究利用白色脂肪组织移植生物工程化胰岛，均报告了具有前景的治疗效果20,24,25,26由于使用附睾脂肪组织有助于检测移植的胰岛，因此 &#34;脂肪包裹的胰岛移植方法&#34;利用附睾脂肪组织，开发了脂肪包裹的胰岛移植技术，以克服腹腔内胰岛移植的局限性。本文描述了使用附睾脂肪组织进行脂肪包裹的胰岛移植方法。

<table><tbody><tr><td>4-0 尼龙线</td><td>Alfresa</td><td>ER2004NA45-KF2</td><td>关闭腹腔</td></tr><tr><td>Alexa 488 标记的驴抗豚鼠抗体</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>706-546-148</td><td>胰岛素抗体的二抗</td></tr><tr><td>Alexa 647 标记的驴抗兔抗体</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>711-606-152</td><td>血管性血友病因子抗体的二抗</td></tr><tr><td>DMEM，低糖，含丙酮酸</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11885084</td><td>胰岛培养、胰岛移植</td></tr><tr><td>伊红</td><td>Fujifilm Wako Chemicals</td><td>051-06515</td><td>用于组织的伊红染色</td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock 管，1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>收集胰岛&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL 圆锥形离心管</td><td>Corning</td><td>352095</td><td>收集胰岛</td></tr><tr><td>Falcon 40 &amp;micro;m 细胞筛</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td>用于分离胰岛与胰腺其他组织</td></tr><tr><td>Falcon 50 mL 圆锥形离心管</td><td>Corning</td><td>352070</td><td>弃去过量培养基/缓冲液</td></tr><tr><td>豚鼠抗胰岛素抗体</td><td>Agilent Technologies Japan, Ltd. (Dako)</td><td>IR002</td><td>小鼠胰岛素的一抗</td></tr><tr><td>苏木精</td><td>Muto Pure Chemicals Co., Ltd.</td><td>30002</td><td>用于组织的苏木精染色</td></tr><tr><td>聚维酮碘溶液 10%</td><td>Shionogi&amp;Co., Ltd.</td><td>无目录号</td><td>用于消毒</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Fujifilm Wako Chemicals</td><td>095-06573</td><td>用于麻醉</td></tr><tr><td>Labcon 1000 &amp;micro;L ZapSilk 低吸附移液枪头</td><td>Labcon</td><td>1177-965-008</td><td>用于分离胰岛与胰腺其他组织</td></tr><tr><td>Labcon 200 &amp;micro;L ZapSilk 低吸附移液枪头</td><td>Labcon</td><td>1179-965-008</td><td>用于将胰岛接种至附睾白色脂肪组织</td></tr><tr><td>Mintsensor</td><td>Sanwa Kagaku Kenkyusho Co. Ltd.,</td><td>8AEB02E</td><td>用于监测血糖</td></tr><tr><td>Pipetteman P-1000</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td>用于分离胰岛与胰腺其他组织</td></tr><tr><td>Pipetteman P-200</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td>用于将胰岛接种至附睾白色脂肪组织</td></tr><tr><td>兔抗 vWF 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab6994</td><td>小鼠血管性血友病因子的一抗</td></tr></tbody></table>

利用附睾白色脂肪组织进行脂肪包裹的胰岛移植

Fat-Covered Islet Transplantation Using Epididymal White Adipose Tissue

胰岛移植是一种用于治疗重度糖尿病的细胞替代疗法。该手术通常将腹腔作为移植部位。然而，腹腔内胰岛移植存在一些局限性，包括移植效果不佳、移植物检测困难，以及无法在移植后进行移植物切除以供分析。本文采用一种利用附睾白色脂肪组织的“脂肪覆盖式胰岛移植”方法，用于评估生物工程化胰岛的治疗效果。该方法的简便之处在于将胰岛接种于附睾白色脂肪组织表面，并利用该组织覆盖胰岛。尽管该方法可归类为腹腔内胰岛移植技术，但它也具有脂肪组织内胰岛移植的特征。与脂肪组织内胰岛移植相比，脂肪覆盖式胰岛移植表现出更强的治疗效果，包括改善血糖和血浆胰岛素水平，以及具备移植物切除的可行性。我们建议采用该方法来研究胰岛在白色脂肪组织中植入的机制，以及评估生物工程化胰岛的治疗作用。

为了比较脂肪包裹的胰岛移植与腹腔内胰岛移植的移植效果，将相同数量的胰岛移植至对照组糖尿病动物左侧结肠旁间隙的腹膜上。与接受腹腔内胰岛移植的小鼠相比，接受脂肪包裹胰岛移植的小鼠血糖水平逐渐显著降低（p = 0.0023；图3A）。移植后一个月，通过腹腔葡萄糖耐量试验评估发现，脂肪包裹胰岛移植小鼠的血糖水平维持在较腹腔内胰岛移植小鼠更低的水平（p = 0.0046；图3B）。此外，正如我们先前报道的那样，血浆胰岛素水平在脂肪包裹胰岛移植后也有所改善。同时，血糖水平的再次升高也得到了证实。这些数据表明，使用200 IEQs进行腹腔内脂肪包裹胰岛移植可显著改善受体小鼠的糖尿病状况。
还进行了组织学检查，以评估胰岛在附睾白色脂肪组织中的移植情况。在脂肪覆盖的胰岛移植受体动物中，苏木精-伊红染色显示附睾白色脂肪组织内存在胰岛（图3C，上方图像）。此外，荧光标记的胰岛素阳性胰岛抗体染色...

这种脂肪包裹的胰岛移植方法适用于检测腹膜腔内植入的胰岛。值得注意的是，该方法无需使用生物结合剂或缝合。

胰岛移植是一种针对重度糖尿病的细胞替代疗法。腹腔通常是该疗法的移植部位……

本方案可评估胰岛移植至白色脂肪组织的植入机制。这种脂肪包裹的胰岛移植方法主要优势在于技术上易于重复。该方法可应用于其他疾病模型。例如，该方法可用于构建小鼠癌症模型。本实验操作由福冈大学副教授 Naoaki Sakata 演示。在解剖显微镜下，使用 P 200 微量移液器去除胰腺消化物中多余的胰岛成分，包括腺泡组织和纤维组织。然后使用细胞筛过滤，分离出单个腺泡细胞。将过滤后的胰岛转移至新的培养皿中，培养皿内含有适当的培养基或缓冲液，并补充牛血清或白蛋白，轻轻摇晃培养皿使胰岛集中于中央。使用P200微量移液器将单个胰岛挑取至合适的收集管中。将一个新的40微米细胞筛置于一个50毫升塑料管上方。使用1000微升移液器将胰岛加入筛网中，以分离胰岛和单个腺泡细胞。用镊子将筛网倒置到一个新的60或100毫升未处理的培养皿上，该培养皿中含有添加了牛血清或白蛋白的培养基或适当的缓冲液。使用新鲜的培养基或缓冲液将胰岛冲洗至新的培养皿中，然后向培养皿中加入足够的培养基或缓冲液，使总体积达到约 20 毫升。在显微镜下计数胰岛，并根据供体动物的数量将胰岛数目均等分配至各个 1.5 毫升塑料离心管中。在室温下以 2,100 ×g 离心 1 分钟，弃去上清液。通常会有 20 至 30 微升的残留液体留在管中。去除腹部毛发以防止感染后，将小鼠置于仰卧位。对腹部及腹股沟区域进行消毒后，在下腹正中区域切开皮肤，形成一条长约两厘米的皮肤切口。用镊子或拉钩夹住小鼠左侧腹壁，并将组织拉向小鼠左侧以暴露手术视野。使用棉签将小肠和大肠推至小鼠右侧。腹腔内左侧表皮白色脂肪组织位于左腹股沟区域。将表皮白色脂肪组织和左侧睾丸移至腹腔外，并拉伸组织。使用P 200微量移液器从一个1.5毫升离心管中吸取全部胰岛体积，注意收集过程中确保管内无残留胰岛。通过重力作用使收集的胰岛沉降至移液器吸头的尖端。将微量移液器吸头轻轻接触膨胀的脂肪组织，注意避免吸头中的培养基或缓冲液过度冲洗。小心地将胰岛接种到组织上。接种后，在解剖显微镜下确认胰岛的正确位置。用表皮白色脂肪组织覆盖胰岛，然后将左侧睾丸置于表皮白色脂肪组织下方，并将组织还纳至腹膜腔内。使用4-0缝线分两层缝合皮肤。操作结束后，将小鼠置于加热灯下，并监测直至其完全恢复。为了比较脂肪包裹的胰岛移植与腹腔内胰岛移植的移植效果，将相同数量的胰岛移植至对照组糖尿病动物受体的左侧结肠旁区腹膜处。与接受腹腔内胰岛移植的小鼠相比，接受脂肪包裹胰岛移植的小鼠血糖水平逐渐且显著降低。移植后一个月进行腹腔内葡萄糖耐量试验。在脂肪覆盖的胰岛移植小鼠中，血糖水平维持在较腹腔内胰岛移植小鼠更低的水平。通过组织学检查评估胰岛在表皮白色脂肪组织中的植入情况。在脂肪覆盖的胰岛移植受体动物中，苏木精-伊红染色显示表皮白色脂肪组织内存在胰岛。此外，使用荧光标记的抗体对胰岛素阳性的胰岛进行染色，有助于检测所有受体小鼠表皮白色脂肪组织中冯·维勒布兰德因子阳性微血管的存在。为确保该操作成功，需让胰岛完全沉降到移液管尖端，并将其接种至脂肪组织时避免溢出。

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使用附睾白色脂肪组织进行脂肪覆盖的胰岛移植

本方案旨在小鼠肾包膜下清晰、简便地移植胰岛或细胞。细胞在最终用于移植的导管中被浓缩成团。该技术操作简便，可减少对细胞和小鼠造成的应激损伤。...

将胰岛移植到糖尿病小鼠的肾包膜下

已提出移植分离的胰岛可能成为治疗1型糖尿病的一种潜在方法。本文介绍一种从小鼠胰腺中分离胰岛并将其移植至肾包膜下空间的方法。...

小鼠胰岛分离与肾包膜下移植方法

本方案演示了小鼠胰岛的分离及其在脱细胞支架上的接种。将支架支持的胰岛移植到链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠的附睾脂肪垫中。胰岛在移植部位存活，并逆转了高血糖状态。...

支架支持的胰岛移植至糖尿病小鼠附睾脂肪垫

介绍了一种在小鼠体内进行网膜移植胰岛的方法。分离的胰岛与水凝胶混合后，将混合物植入糖尿病小鼠的网膜囊内。随后监测血糖水平，并进行免疫组织化学分析。...

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胰岛移植是一种实现1型糖尿病患者血糖正常化的方法。本文重点介绍通过门静脉途径进行移植的技术，以维持糖尿病小鼠的正常血糖水平。...

小鼠模型中胰岛的门静脉移植

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小鼠胰岛的腹股沟皮下白色脂肪组织（ISWAT）移植模型

本文介绍了在小鼠体内成功实施门静脉内胰岛移植的优化手术步骤。该手术是一种具有临床相关性但技术上具有挑战性的外科操作。...

小鼠肝内胰岛移植过程中减少输注后门静脉出血的方法

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小鼠肌肉内移植人多能干细胞衍生的胰腺内分泌细胞

为了理解组织工程心脏瓣膜中新生组织形成和狭窄发展的细胞与分子机制，研究人员建立了一种小鼠异位心脏瓣膜移植模型。采用异位心脏移植技术，将肺动脉瓣移植至受体动物体内。...

异位心脏移植小鼠模型中肺动脉瓣移植

了解使用附睾白色脂肪组织进行脂肪覆盖胰岛移植的方法，该技术无需生物粘合剂或缝合即可检测腹腔内移植的胰岛，操作简便且易于复制，可应用于多种疾病模型和癌症小鼠模型的构建。

利用附睾白色脂肪组织进行脂肪包裹的胰岛移植

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