可视化臭氧与脂多糖联合诱导的小鼠急性肺损伤过程中的肺细胞适应性变化

你好，我叫Gurpreet。我们的实验室研究肺部炎症与修复的机制。你好，我叫Jessica，我通过荧光显微技术研究臭氧诱导的大鼠肺泡损伤。

大家好，我叫Manpreet。我使用动物成像方法研究肺部炎症。肺部会持续受到来自无菌性因素（例如臭氧）和微生物成分（例如细菌脂多糖或LPS）的直接和间接损伤。

过度的宿主免疫反应可能导致呼吸功能受损和急性肺损伤，其特征是肺部中性粒细胞的募集，这是由于宿主免疫反应、凝血过程以及组织重塑失去调控所致。本文描述了对多个区室的全面分析，包括支气管肺泡灌洗液（即 BAL）、肺血管灌流液（即 LVP）、左肺冷冻切片、外周血以及胸骨和股骨骨髓。进行臭氧暴露时，将小鼠轻轻放入定制的诱导箱中，并持续暴露于 0.05 PPM 的臭氧环境中两小时。

进行LPS暴露时，使用低剂量腹腔注射的氯胺酮和赛拉嗪混合物对小鼠进行麻醉。随后将50 µL的LPS溶液滴入小鼠外鼻孔。对照组小鼠则滴入50 µL无菌生理盐水。

在指定时间点，使用足量的氯胺酮和赛拉嗪混合物对小鼠进行麻醉。随后对小鼠进行消毒，并检测足底反射，即轻捏任一后肢脚趾，观察肢体是否回缩。无反射表明已达到深度麻醉状态。

现在在胸骨下方做一切口，暴露心脏。将连接肝素化注射器的25号针头插入右心室，通过心脏穿刺抽血。用肝素化注射器收集血液，并转移至微量离心管中以供进一步处理。

使用镊子或钝头镊子小心清除覆盖在气管区域的组织。接着剪开肋骨以暴露肺部。将一根棉线穿过气管下方，并暂时留置于此。

进行气管切开术时，在距肺部约气管长度三分之一处剪断气管。将一根28号聚乙烯导管插入气管，并用棉线结扎牢固固定导管位置。

确保不要压塌套管。现在借助1 mL注射器，将0.5 mL的PBS缓慢注入套管中。注入PBS后，持续抽吸注射器，直至不再有阻力为止。

将抽吸的液体收集到已标记的微量离心管中，并重复此操作两次。在胸段与腹段交界处切断降主动脉，以避免肺灌注过程中出现回流。用吸水纸将靠近切断的主动脉断端的腔隙血液吸净。

接下来，通过右心室注入 0.5 mL 室温肝素化生理盐水灌注肺脏，并从降主动脉远端切口处的腔内收集血管灌流液。结扎右支气管后，使左肺充盈 0.5 mL 多聚甲醛，持续 5 分钟。

现在对腹部区域进行消毒。切下腹部并从骨盆骨上剥离皮肤。收集骨盆骨，并将左侧和右侧股骨分离，置于盛有生理盐水且置于冰上的培养皿中。

将腹侧肋骨和胸骨收集到盛有生理盐水且置于冰上的培养皿中。使用与1 mL注射器匹配良好的针头，以0.5 mL生理盐水对骨的切割端灌注四次。将每根骨收集的液体组分分别置于预先标记并装有滤器、且放置于冰上的Falcon管中。

将所有样品在3000 RPM条件下离心10分钟。收集上清液并迅速冷冻。用至少200 µL的PBS重悬细胞。

进行总白细胞计数。用钙黄绿素绿与红色碘化丙啶同型二聚体染料混合液对另一份支气管肺泡灌洗液进行染色。分析上清液中的趋化因子及总蛋白浓度。

离心细胞，每张载玻片制备两个细胞涂片，并对生化和免疫蛋白进行染色。对所有组别的肺冷冻切片进行改良的H和E染色。在合并的图像面板中手动勾画150至200个细胞。

将选定的目标区域复制到所有通道中。测量所有通道的预设参数。用染色分子的荧光强度除以DAPI或CD61的荧光强度。

这些被称为DAPI或CD61标准化的荧光强度比值。接下来绘制参数以评估暴露后是否存在任何变化。尽管联合暴露未引起总支气管肺泡灌洗液（BAL）、左心室压（LVP）或胸骨骨髓细胞计数的改变，但小鼠在暴露后24小时出现全身性白细胞增多，随后在72小时出现白细胞减少。

这些结果体现在外周血细胞计数中。与所有其他时间点相比，股骨骨髓细胞计数在72小时显示出晚期峰值。请注意，在支气管肺泡灌洗液（BAL）细胞涂片图像中，24小时时多形核细胞缺乏Siglec-F和CX3CR1染色。

BAL 和 LVP 细胞涂片显示，在0小时存在大量CD11b和GR1阳性的单核细胞。暴露后，所有腔室中均以多形核细胞为主要细胞类型。联合暴露后36小时，BAL总蛋白含量最高。

然而，暴露后LVP蛋白水平未发生变化。LVP中嗜酸性粒细胞趋化因子-2和白细胞介素-2的水平在4小时时最高。这些趋化因子在支气管肺泡灌洗液（BAL）组分中的水平降低。

有趣的是，LVP 中性粒细胞警报因子 IL-16 及多种天然趋化因子发生了改变，但在 BAL 组分中未见变化。在基线时，超过 95% 的 BAL 细胞为单核细胞，显示皮层肌动蛋白、片状伪足、应力纤维和微管纤维，并对还原型线粒体染料（mitotracker）呈强阳性。在 4 小时时，我们观察到呈圆形的 BAL 细胞，这些细胞失去了肌动蛋白，但显示出扩散的微管网络（如红色所示），且还原型线粒体染料染色强度降低。

联合暴露后早期，支气管肺泡灌洗（BAL）细胞对钙黄绿素和碘化丙啶同源二聚体-1呈双阳性，表明部分细胞膜完整性受损。在36小时时，BAL细胞大部分存活，即呈现绿色。我们在BAL肺泡巨噬细胞和中性粒细胞中观察到明显的ATPα和Ly6G染色信号。

我们观察到DAPI归一化的ATPα减少，以及细胞内Ly6G蛋白含量增加。联合暴露在暴露后诱导了BAL细胞中Bal、自然杀伤细胞和K1.1、中性粒细胞ATP、亚基PETA、增殖因子Ki-67的瞬时表达，以及中性粒细胞GR1、血小板CX3CR1和抗血管生成的血管抑素蛋白的持续表达。尽管预期会出现细支气管和肺泡隔损伤，但在暴露后36小时观察到较大血管中出现细胞聚集物仍令人意外。

最后，我们在本表中展示了摘要结果。我们希望本研究建立的小鼠模型可作为一种易于获取的原型，在二级生物安全水平的实验室中进行复制，用于研究侵袭性细胞死亡和感染的机制。谢谢。