Name: 在合并臭氧和LPS诱导穆林急性肺损伤期间可视化肺细胞适应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: 了解臭氧与细菌内毒素联合暴露诱导小鼠急性肺损伤期间肺细胞适应机制。本研究利用荧光显微技术评估细胞死亡、免疫反应及细胞骨架变化，为肺部炎症修复机制提供重要见解。

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本研究由加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）总统资助计划以及加拿大西尔维娅·费多鲁克核创新中心的启动资金资助。加拿大西尔维娅·费多鲁克核创新中心由萨斯喀彻温省创新基金（Innovation Saskatchewan）资助。荧光成像在WCVM影像中心完成，该中心由加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）资助。杰西卡·布罗科斯（Jessica Brocos，理学硕士生）和曼普丽特·考尔（Manpreet Kaur，理学硕士生）由加拿大西尔维娅·费多鲁克核创新中心的启动资金资助。

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<li>Shah, D., Romero, F., Stafstrom, W., Duong, M., Summer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+ATP+mediates+the+late+phase+of+neutrophil+recruitment+to+the+lung+in+murine+models+of+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Extracellular ATP mediates the late phase of neutrophil recruitment to the lung in murine models of acute lung injury.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 152-161 (2014).</li>
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<li>Peterson, M. L., Harder, S., Rummo, N., House, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ozone+on+leukocyte+function+in+exposed+human+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of ozone on leukocyte function in exposed human subjects.</a> Environmental Research. 15 (3), 485-493 (1978).</li>
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<li>Stieb, D. M., Burnett, R. T., Beveridge, R. C., Brook, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+ozone+and+asthma+emergency+department+visits+in+Saint+John%2C+New+Brunswick%2C+Canada%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Association between ozone and asthma emergency department visits in Saint John, New Brunswick, Canada.</a> Environmental Health Perspectives. 104 (12), 1354-1360 (1996).</li>
<li>Thomson, E. M., Pilon, S., Guenette, J., Williams, A., Holloway, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozone+modifies+the+metabolic+and+endocrine+response+to+glucose%3A+Reproduction+of+effects+with+the+stress+hormone+corticosterone%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Ozone modifies the metabolic and endocrine response to glucose: Reproduction of effects with the stress hormone corticosterone.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 342, 31-38 (2018).</li>
<li>Aulakh, G. K., Brocos Duda, J. A., Guerrero Soler, C. M., Snead, E., Singh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+low-dose+ozone-induced+murine+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of low-dose ozone-induced murine acute lung injury.</a> Physiological Reports. 8 (11), 14463(2020).</li>
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<li>Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+pulmonary+damage+induced+by+lipopolysaccharide+via+intranasal+instillation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation.</a> Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).</li>
<li>Southam, D. S., Dolovich, M., O'Byrne, P. M., Inman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+intranasal+instillations+in+mice%3A+effects+of+volume%2C+time%2C+body+position%2C+and+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position, and anesthesia.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 282 (4), 833-839 (2002).</li>
<li>Aulakh, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+CD34+produces+defects+in+platelets%2C+microparticles%2C+and+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Lack of CD34 produces defects in platelets, microparticles, and lung inflammation.</a> Cell Tissue Research. , (2020).</li>
<li>Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+and+recovery+of+the+alveolar+macrophage+phagocytic+system+during+continuous+exposure+to+0.5+ppm+ozone%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Lung+Research%22%5BJournal%5D)">Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone.</a> Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).</li>
<li>Yipp, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lung+is+a+Host+Defense+Niche+for+Immediate+Neutrophil-Mediated+Vascular+Protection%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Lung is a Host Defense Niche for Immediate Neutrophil-Mediated Vascular Protection.</a> Science Immunology. 2 (10), (2017).</li>
<li>Lee, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiostatin+regulates+the+expression+of+antiangiogenic+and+proapoptotic+pathways+via+targeted+inhibition+of+mitochondrial+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Angiostatin regulates the expression of antiangiogenic and proapoptotic pathways via targeted inhibition of mitochondrial proteins.</a> Blood. 114 (9), 1987-1998 (2009).</li>
<li>Hawkins, C. L., Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+identification%2C+and+quantification+of+oxidative+protein+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Detection, identification, and quantification of oxidative protein modifications.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (51), 19683-19708 (2019).</li>
<li>Hemming, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+Pollutant+Ozone+Causes+Damage+to+Lung+Surfactant+Protein+B+%28SP-B%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Environmental Pollutant Ozone Causes Damage to Lung Surfactant Protein B (SP-B).</a> Biochemistry. 54 (33), 5185-5197 (2015).</li>
<li>Oosting, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+of+surfactant+protein+A+to+ozone+in+vitro+and+in+vivo+impairs+its+interactions+with+alveolar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Exposure of surfactant protein A to ozone in vitro and in vivo impairs its interactions with alveolar cells.</a> American Journal of Physiology. 262 (1), Pt 1 63-68 (1992).</li>
<li>Roth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+necrotic+neutrophils+release+interleukin-16C+and+macrophage+migration+inhibitory+factor+from+stores+in+the+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Discovery%22%5BJournal%5D)">Secondary necrotic neutrophils release interleukin-16C and macrophage migration inhibitory factor from stores in the cytosol.</a> Cell Death & Discovery. 1, 15056(2015).</li>
<li>Kawaguchi, N., Zhang, T. T., Nakanishi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+CXCR4+in+Normal+and+Abnormal+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Involvement of CXCR4 in Normal and Abnormal Development.</a> Cells. 8 (2), (2019).</li>
<li>Gupta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrapulmonary+manifestations+of+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Extrapulmonary manifestations of COVID-19.</a> Nature Medicine. 26 (7), 1017-1032 (2020).</li>
<li>Aulakh, G. K., Kuebler, W. M., Singh, B., Chapman, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAulakh%2C+GK+%222017+IEEE+Nuclear+Science+Symposium+and+Medical+Imaging+Conference+%28NSS%2FMIC%29%22">2017 IEEE Nuclear Science Symposium and Medical Imaging Conference (NSS/MIC)</a>. , 1-2 (2017).</li>
<li>Aulakh, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+image+x-radiography+for+functional+lung+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+in+Medicine+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiple image x-radiography for functional lung imaging.</a> Physics in Medicine & Biology. 63 (1), 015009(2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突或需要披露的事项。

本研究中所展示的方法突显了多区室分析在研究肺部炎症过程中多种细胞事件中的实用性。我们已在表2中总结了相关发现。我们以及多个实验室已广泛研究了小鼠对鼻内滴注脂多糖（LPS）的反应，该反应以肺中性粒细胞的快速募集为特征，其峰值出现在6–24小时之间，随后进入缓解阶段。最近，我们发现亚临床浓度的臭氧（O3，0.05 ppm，持续2小时）单独即可在C57BL/6NJ亚系中诱导显著的肺损伤15，其特征为中性粒细胞在肺血管区室中的分布，而支气管肺泡灌洗液（BAL）中则观察到受损的巨噬细胞和细胞碎片，表明O3具有促炎潜力。在该模型中，由于O3诱导的肺泡上皮损伤以及肺泡巨噬细胞随之发生的吞噬作用，我们在肺泡区室中未观察到中性粒细胞。在O3模型中，我们不仅观察到细胞外DNA和碎片的存在，还发现BAL中的巨噬细胞形态异常，且与高水平的IL-16相关——IL-16是一种通常由凋亡中性粒细胞释放的警报素。因此，了解这些亚临床水平的O3是否会影响原本健壮的C57BL/6J亚...

急性肺损伤（ALI）是肺部对感染性或其他有害刺激产生的一种关键病理性反应，其特征是凝血系统、纤溶系统和先天免疫系统同时被激活1。中性粒细胞通过Toll样受体（TLR）家族迅速感知微生物及细胞内损伤的分子模式2,3,4。中性粒细胞释放预先形成的细胞因子和细胞毒性颗粒内容物，可能造成附带的组织损伤。继发的肺泡损伤伴随继发性细胞死亡，导致三磷酸腺苷（ATP）等分子的释放5，从而引发免疫失调的恶性循环。
关于急性肺损伤（ALI）机制的一个未解难题是肺泡膜内损伤如何被启动。电子传递链复合物V，即F1F0 ATP合酶，是一种线粒体蛋白，在炎症状态下可普遍表达于细胞（包括内皮细胞、白细胞、上皮细胞）的质膜上。细胞骨架由肌动蛋白和微管蛋白组成，分别携带多种调节细胞形态与功能以及线粒体相关的蛋白质。我们近期研究发现，内源性分子血管抑素（angiostatin）通过阻断ATP合酶，可抑制中性粒细胞的募集、活化以及脂多糖（LPS）诱导的肺部炎症6。因此，在肺部炎症过程中，生化机制（ATP合酶）和免疫机制（TLR4）可能共同调控肺泡屏障功能。
暴露于臭氧（O3）——一种环境污染物——会损害肺功能，增加对肺部感染的易感性，即使是短期低浓度的O3暴露，也会提高患有基础心肺疾病个体的死亡风险7,8,9,10,11,12,13,14。因此，暴露于生理相关浓度的O3为研究急性肺损伤（ALI）中炎症的基本机制提供了一个有意义的模型7,8。我们实验室近期建立了一种小鼠低剂量O3诱导的ALI模型15。在完成低浓度O3的剂量与时间反应实验后，我们发现暴露于0.05 ppm O3持续2小时可诱导急性肺损伤，其特征表现为肺组织ATP合酶复合物V亚基β（ATPβ）和血管抑素的表达，与脂多糖（LPS）模型相似。活体肺成像显示肺泡肌动蛋白微丝结构紊乱，提示肺组织损伤，同时在暴露于0.05 ppm O3 2小时后，肺泡隔内活性氧（ROS）水平降低（提示基础细胞信号传导被阻断）以及线粒体膜电位下降（提示急性细胞死亡）15，这些变化与肺部18FDG摄取的异质性分布16、中性粒细胞募集及细胞因子释放（尤其是IL-16和SDF-1α）相关。我们近期研究的核心结论是，当O3暴露浓度低于人类每日8小时暴露限值（0.063 ppm）时，其毒性呈指数级升高。重要的是，目前尚不清楚这些亚临床水平的O3暴露是否能够调节由细菌内毒素介导的TLR4相关机制17。因此，我们研究了O3与LPS双重暴露模型，并观察了免疫与非免疫细胞的适应性变化。
我们描述了一种全面的荧光显微镜分析方法，用于检测肺部及全身多个系统部位，包括支气管肺泡灌洗液（即BAL），用于取样肺泡腔；肺血管灌注液（即LVP），用于取样肺血管系统，以及在内皮屏障受损时取样肺泡隔间质；左肺冷冻切片，用于观察灌洗后残留在肺组织中的实质驻留白细胞及黏附的白细胞；外周血，代表循环中的白细胞；以及胸骨和股骨骨髓灌注液，分别用于取样炎症过程中造血细胞动员的近端和远端位点。

<table><tbody><tr><td>33-重生物plex趋化因子检测试剂盒</td><td>Biorad</td><td>12002231</td><td></td></tr><tr><td>63X油镜（NA 1.4-0.6）显微镜物镜</td><td>Leica</td><td>HCX PL APO CS (11506188)</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 350标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）</td><td>Invitrogen</td><td>A11045</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）</td><td>Invitrogen</td><td>A11002</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488标记的鬼笔环肽</td><td>Invitrogen</td><td>A12370</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555标记的小鼠抗&amp;alpha;微管蛋白单克隆抗体DM1A</td><td>Millipore</td><td>05-829X-555</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 568标记的山羊抗仓鼠IgG（H+L）</td><td>Invitrogen</td><td>A21112</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 568标记的山羊抗大鼠IgG（H+L）</td><td>Invitrogen</td><td>A11077</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 633标记的山羊抗兔IgG（H+L）</td><td>Invitrogen</td><td>A21070</td><td></td></tr><tr><td> Armenian hamster抗CD61（克隆2C9.G2）IgG1 kappa</td><td>BD Pharmingen</td><td>553343</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 J小鼠</td><td>Jackson Laboratories</td><td>64</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜</td><td>Leica</td><td>Leica TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>DAPI（4&amp;prime;,6-二脒基-2-苯基吲哚）</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>分装为2 &amp;micro;l储存液，保存于-20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>倒置荧光宽场显微镜</td><td>Olympus</td><td>Olympus IX83</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮（Narketan）</td><td>Vetoquinol</td><td>100 mg/ml</td><td>稀释10倍，配制成10 mg/ml储存液</td></tr><tr><td>活/死细胞毒性检测试剂盒（钙黄绿素/溴化乙锭同型二聚体-1）</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗ATP5A1 IgG2b（克隆7H10BD4F9）</td><td>Invitrogen</td><td>459240</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗ATP5&amp;beta; IgG2b（克隆3D5AB1）</td><td>Invitrogen</td><td>A-21351</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗NK1.1 IgG2a kappa（克隆PK136）</td><td>Invitrogen</td><td>16-5941-82</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 660 nm蛋白质定量试剂盒</td><td>Thermoscientific</td><td>22660</td><td></td></tr><tr><td>兔抗血管抑素（小鼠aa 98-116）IgG</td><td>Abcam</td><td>ab2904</td><td></td></tr><tr><td>兔抗CX3CR1 IgG（RRID 467880）</td><td>Invitrogen</td><td>14-6093-81</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗Ki-67（克隆SolA15）IgG2a kappa</td><td>Invitrogen</td><td>14-5698-82</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗Ly6G IgG2a kappa（克隆1A8）</td><td>Invitrogen</td><td>16-9668-82</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗Ly6G/Ly6C（Gr1）IgG2b kappa（克隆RB6-8C5）</td><td>Invitrogen</td><td>53-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠CD16/CD32 Fc阻断抗体（克隆2.4G2）</td><td>BD Pharmingen</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>还原型MitoTracker Orange</td><td>Invitrogen</td><td>M7511</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪（Rompun）</td><td>Bayer</td><td>20 mg/ml</td><td>稀释2倍，配制成10 mg/ml储存液</td></tr></tbody></table>

可视化臭氧与脂多糖联合诱导的小鼠急性肺损伤过程中的肺细胞适应性变化

Visualizing Lung Cellular Adaptations during Combined Ozone and LPS Induced Murine Acute Lung Injury

肺部持续面临无菌性（如颗粒物或反应性毒素）和感染性（如细菌、病毒或真菌）炎症因素带来的直接与间接损伤。过度的宿主反应可能导致呼吸功能受损及急性肺损伤，其特征是由于病理性宿主免疫反应、凝血反应及组织重塑反应引发的肺部中性粒细胞募集。为深入理解宿主的炎症与修复机制，亟需采用敏感的显微技术，以可视化并定量分析小鼠肺部细胞在低剂量（0.05 ppm）臭氧（一种强效环境污染物）联合细菌脂多糖（TLR4激动剂）刺激下的适应性变化。本文描述了一套全面的荧光显微分析方法，涵盖多种肺部及全身组织区室，包括支气管肺泡灌洗液、肺血管灌注液、左肺冷冻切片以及胸骨骨髓灌注液。我们展示了肺泡巨噬细胞、中性粒细胞、肺实质组织以及骨髓细胞的损伤情况，并揭示这些变化与迟发性（长达36–72小时）免疫反应相关，该反应在所分析的各组织区室中表现为明确的趋化因子梯度。此外，我们还呈现了肺细胞外基质与细胞骨架（肌动蛋白、微管蛋白）的相互作用、线粒体与活性氧物质、抗凝血纤溶酶原、其抗血管生成肽片段血管抑素、线粒体ATP合酶复合体V的α和β亚基等指标。当这些替代性标志物与适当的 体外 基于细胞的检测方法和 体内 活体成像技术，例如活体显微镜，可为理解肺部对新型免疫调节剂的反应提供重要信息。

联合O3 LPS暴露在72小时引起全身性炎症和骨髓动员： 不同区室中的细胞计数显示，联合O处理后，外周血和股骨骨髓的总细胞数发生显著变化3 以及LPS暴露。尽管联合O3 且LPS暴露未引起BAL总量的任何变化（图1A）或 LVP（图1B) 细胞计数，24小时时以多形核细胞为主要细胞类型图1F，补充图1），暴露后24小时、36小时和72小时。请注意，在24小时支气管肺泡灌洗液（BAL）细胞涂片图像中，多形核细胞无Siglec-f和CX3CR1染色。图1F). BAL 细胞离心涂片的三重 DAPI/CD11b/Gr1 染色显示，0 h 时存在大量 CD11b 和 Gr1 阳性的单核细胞，即...

经臭氧与细菌内毒素联合暴露的小鼠表现出广泛的细胞死亡，包括中性粒细胞的死亡。我们观察到细胞发生多种适应性变化，例如细胞骨架片状伪足结构的破坏、支气管肺泡灌洗液中复合体V ATP合酶β亚基和血管抑素的表达升高、肺部免疫反应受到抑制以及中性粒细胞募集延迟。

肺部持续面临各种直接和间接的损伤，这些损伤包括无菌性因素（如颗粒物或反应性毒素）和感染性因素（如细菌、病毒等）。

你好，我叫Gurpreet。我们的实验室研究肺部炎症与修复的机制。你好，我叫Jessica，我通过荧光显微技术研究臭氧诱导的大鼠肺泡损伤。大家好，我叫Manpreet。我使用动物成像方法研究肺部炎症。肺部会持续受到来自无菌性因素（例如臭氧）和微生物成分（例如细菌脂多糖或LPS）的直接和间接损伤。过度的宿主免疫反应可能导致呼吸功能受损和急性肺损伤，其特征是肺部中性粒细胞的募集，这是由于宿主免疫反应、凝血过程以及组织重塑失去调控所致。本文描述了对多个区室的全面分析，包括支气管肺泡灌洗液（即 BAL）、肺血管灌流液（即 LVP）、左肺冷冻切片、外周血以及胸骨和股骨骨髓。进行臭氧暴露时，将小鼠轻轻放入定制的诱导箱中，并持续暴露于 0.05 PPM 的臭氧环境中两小时。进行LPS暴露时，使用低剂量腹腔注射的氯胺酮和赛拉嗪混合物对小鼠进行麻醉。随后将50 µL的LPS溶液滴入小鼠外鼻孔。对照组小鼠则滴入50 µL无菌生理盐水。在指定时间点，使用足量的氯胺酮和赛拉嗪混合物对小鼠进行麻醉。随后对小鼠进行消毒，并检测足底反射，即轻捏任一后肢脚趾，观察肢体是否回缩。无反射表明已达到深度麻醉状态。现在在胸骨下方做一切口，暴露心脏。将连接肝素化注射器的25号针头插入右心室，通过心脏穿刺抽血。用肝素化注射器收集血液，并转移至微量离心管中以供进一步处理。使用镊子或钝头镊子小心清除覆盖在气管区域的组织。接着剪开肋骨以暴露肺部。将一根棉线穿过气管下方，并暂时留置于此。进行气管切开术时，在距肺部约气管长度三分之一处剪断气管。将一根28号聚乙烯导管插入气管，并用棉线结扎牢固固定导管位置。确保不要压塌套管。现在借助1 mL注射器，将0.5 mL的PBS缓慢注入套管中。注入PBS后，持续抽吸注射器，直至不再有阻力为止。将抽吸的液体收集到已标记的微量离心管中，并重复此操作两次。在胸段与腹段交界处切断降主动脉，以避免肺灌注过程中出现回流。用吸水纸将靠近切断的主动脉断端的腔隙血液吸净。接下来，通过右心室注入 0.5 mL 室温肝素化生理盐水灌注肺脏，并从降主动脉远端切口处的腔内收集血管灌流液。结扎右支气管后，使左肺充盈 0.5 mL 多聚甲醛，持续 5 分钟。现在对腹部区域进行消毒。切下腹部并从骨盆骨上剥离皮肤。收集骨盆骨，并将左侧和右侧股骨分离，置于盛有生理盐水且置于冰上的培养皿中。将腹侧肋骨和胸骨收集到盛有生理盐水且置于冰上的培养皿中。使用与1 mL注射器匹配良好的针头，以0.5 mL生理盐水对骨的切割端灌注四次。将每根骨收集的液体组分分别置于预先标记并装有滤器、且放置于冰上的Falcon管中。将所有样品在3000 RPM条件下离心10分钟。收集上清液并迅速冷冻。用至少200 µL的PBS重悬细胞。进行总白细胞计数。用钙黄绿素绿与红色碘化丙啶同型二聚体染料混合液对另一份支气管肺泡灌洗液进行染色。分析上清液中的趋化因子及总蛋白浓度。离心细胞，每张载玻片制备两个细胞涂片，并对生化和免疫蛋白进行染色。对所有组别的肺冷冻切片进行改良的H和E染色。在合并的图像面板中手动勾画150至200个细胞。将选定的目标区域复制到所有通道中。测量所有通道的预设参数。用染色分子的荧光强度除以DAPI或CD61的荧光强度。这些被称为DAPI或CD61标准化的荧光强度比值。接下来绘制参数以评估暴露后是否存在任何变化。尽管联合暴露未引起总支气管肺泡灌洗液（BAL）、左心室压（LVP）或胸骨骨髓细胞计数的改变，但小鼠在暴露后24小时出现全身性白细胞增多，随后在72小时出现白细胞减少。这些结果体现在外周血细胞计数中。与所有其他时间点相比，股骨骨髓细胞计数在72小时显示出晚期峰值。请注意，在支气管肺泡灌洗液（BAL）细胞涂片图像中，24小时时多形核细胞缺乏Siglec-F和CX3CR1染色。BAL 和 LVP 细胞涂片显示，在0小时存在大量CD11b和GR1阳性的单核细胞。暴露后，所有腔室中均以多形核细胞为主要细胞类型。联合暴露后36小时，BAL总蛋白含量最高。然而，暴露后LVP蛋白水平未发生变化。LVP中嗜酸性粒细胞趋化因子-2和白细胞介素-2的水平在4小时时最高。这些趋化因子在支气管肺泡灌洗液（BAL）组分中的水平降低。有趣的是，LVP 中性粒细胞警报因子 IL-16 及多种天然趋化因子发生了改变，但在 BAL 组分中未见变化。在基线时，超过 95% 的 BAL 细胞为单核细胞，显示皮层肌动蛋白、片状伪足、应力纤维和微管纤维，并对还原型线粒体染料（mitotracker）呈强阳性。在 4 小时时，我们观察到呈圆形的 BAL 细胞，这些细胞失去了肌动蛋白，但显示出扩散的微管网络（如红色所示），且还原型线粒体染料染色强度降低。联合暴露后早期，支气管肺泡灌洗（BAL）细胞对钙黄绿素和碘化丙啶同源二聚体-1呈双阳性，表明部分细胞膜完整性受损。在36小时时，BAL细胞大部分存活，即呈现绿色。我们在BAL肺泡巨噬细胞和中性粒细胞中观察到明显的ATPα和Ly6G染色信号。我们观察到DAPI归一化的ATPα减少，以及细胞内Ly6G蛋白含量增加。联合暴露在暴露后诱导了BAL细胞中Bal、自然杀伤细胞和K1.1、中性粒细胞ATP、亚基PETA、增殖因子Ki-67的瞬时表达，以及中性粒细胞GR1、血小板CX3CR1和抗血管生成的血管抑素蛋白的持续表达。尽管预期会出现细支气管和肺泡隔损伤，但在暴露后36小时观察到较大血管中出现细胞聚集物仍令人意外。最后，我们在本表中展示了摘要结果。我们希望本研究建立的小鼠模型可作为一种易于获取的原型，在二级生物安全水平的实验室中进行复制，用于研究侵袭性细胞死亡和感染的机制。谢谢。

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

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