Name: 严重卵巢功能障碍患者的生育保护 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: 了解无药物体外激活技术用于严重卵巢功能障碍患者的生育保护。该方法通过卵巢皮质碎片化破坏Hippo信号通路，促进次级卵泡生长，提高获卵数量，为卵巢低储备患者提供创新治疗方案。

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我们感谢 Tatsuji Ihana、Sachiyo Kurimoto、Kazuko Takahasih、Yuki Yoshizawa、Maho Arashi、Kentaro Fujita、Erina Kudo、Yuka Kurimoto 和 Mayuko Wakatsuki 在无药物 IVA 操作中的支持，感谢美国加利福尼亚州斯坦福大学医学院 Aaron J.W. Hsueh 教授对稿件的审阅与修改。同时感谢 Rebecca Truman 和 Gregory Truman 为视频添加英文旁白。本研究由日本促进科学基金（JSPS）科学研究 B 项目（19H03801）及挑战性探索研究项目（18K19624）资助。

所有参加无药物IVA治疗的卵巢储备功能减退POR患者均签署了书面知情同意书。本研究已获得国际健康福利大学伦理委员会的批准（编号：17-S-21）。临床试验注册号为UMIN000034464，并依照世界医学协会《医学伦理守则》（赫尔辛基宣言）进行。
1. 卵巢皮质提取
<ol>
	<li>在全身麻醉下，通过腹腔镜手术从一个或两个卵巢中取出部分卵巢皮质组织（10 × 10 mm，厚 2–3 mm），操作方法如先前所述19,20。</li>
	<li>将采集的卵巢皮质组织置于含有 10 mL 改良HTF（mHTF）的无菌容器中，保持温度为 37 °C。</li>
</ol>
2. 卵巢皮质碎裂
注意：在解剖卵巢皮质之前，将 mHTF 预热至 37 °C。整个操作过程中须保持无菌条件。本实验所需所有工具均列于材料表中。
<ol>
	<li>将收集的卵巢皮质组织置于含有 5–10 mL mHTF 的塑料培养皿中，于 37 °C 条件下放置在加热板上，以维持组织温度为 37 °C（图 2A）。</li>
	<li>在开始下一步操作前，使用数码相机拍摄每块皮质组织，并标注患者姓名，以便关联患者的背景资料。</li>
	<li>将单个卵巢皮质组织放置于经 mHTF 润湿的无菌纱布上（图 2B）。 
	注意：在此操作过程中，可使用一次性移液管向纱布上补充适量 mHTF，以防止皮质组织表面干燥。</li>
	<li>使用显微剪刀去除呈粉红色的残余髓质组织，使组织厚度达到 1–2 mm（图 2C 和 D）。 
	注意：为避免早期卵泡丢失，不要将皮质条切成小于 1 mm 的厚度，因为早期阶段的卵泡位于卵巢皮质表面下 1–2 mm 范围内21。</li>
	<li>使用精细手术刀从每条卵巢皮质组织上切取 1 mm × 1 mm × 5 mm 的组织样本，并进行组织学分析，以确定是否存在残留卵泡，方法如前所述18（图 2E）。 
	注意：用于组织学分析的组织样本应浸入 mHTF 中，并在 4 °C 保存直至固定（图 2F，见步骤 4）。</li>
	<li>使用精细手术刀将皮质组织切成 1 mm × 1 mm × 10 mm 的条状（图 2G）。 
	注意：切割时向下按压手术刀比拖拉更易于操作。</li>
	<li>将这些组织条进一步切成 1 mm × 1 mm × 1 mm 的小立方体（图 2H）。 
	注意：为避免培养基中渗透压发生变化，在进行组织自体移植前应适量添加 mHTF。</li>
</ol>
3.&#160;卵巢皮质碎片自体移植
<ol>
	<li>打开IVA套管针的包装，将其放置在无菌敷布上。</li>
	<li>通过反复抽吸和排出mHTF，用mHTF冲洗IVA套管针内部。</li>
	<li>抽吸100–200 µL的mHTF，填充IVA套管针的尖端，以避免在装载过程中皮质立方体干燥（图3A）。</li>
	<li>使用精细镊子将皮质立方体装入IVA套管针的尖端（图3B-E）。 
	注意：装载的皮质立方体数量取决于移植部位。通常可将20–30个立方体移植至原位残留卵巢，而10–15个立方体可移植至输卵管浆膜下袋状区域。</li>
	<li>装载皮质立方体后，在将IVA套管针移交给外科医生前，用手指握住含有皮质立方体的套管针尖端，以避免立方体温度下降。 
	&#8203;注意：腹腔镜手术下自体移植操作的详细步骤已有前期报道19。针对卵巢皮质立方体的移植，本研究合作者Kitazato Corporation开发了一种管状装置（IVA套管针）。</li>
</ol>
4.&#160;卵巢皮质的组织学分析
注意：为了计数残留卵泡的数量，需按照先前所述方法进行组织学分析15。
<ol>
	<li>在样本固定前，使用组织标记染料标记皮质条的表面，以指示组织条中皮质一侧，便于后续组织学分析。</li>
	<li>使用Bouin溶液在4 °C下过夜固定组织条。 
	注意：为检测闭锁卵泡，不建议使用多聚甲醛固定，以避免卵母细胞胞质收缩。</li>
	<li>将组织条进行脱水并包埋于石蜡中。</li>
	<li>对含有组织样本的石蜡块进行连续切片。</li>
	<li>使用苏木精和伊红对每张切片染色，以观察卵泡结构。</li>
	<li>按照先前描述的方法计数卵泡17。</li>
</ol>

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<li>Argyle, C. E., Harper, J. C., Davies, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+cryopreservation%3A+where+are+we+now%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">Oocyte cryopreservation: where are we now.</a> Human Reproduction Update. 22 (4), 440-449 (2016).</li>
</ol>

作者确认他们不存在利益冲突。

在本论文中，我们展示了一种无药物IVA的详细实验室方案。无药物IVA是一种针对卵巢储备功能减退的难治性卵巢反应不良（POR）患者的新型不孕症治疗方法，旨在促进次级卵泡的生长，从而在卵巢刺激后获得更多的成熟卵母细胞，并提高成功妊娠的几率20。在15例卵巢储备功能减退的POR患者中，该方法实现了1例自然妊娠，通过体外受精-胚胎移植技术获得了4例活产，另有1例持续妊娠19。
为制备用于移植的卵巢皮质组织，使用显微剪刀去除髓质组织，保留1-2 mm厚度的皮质。此前，我们已证实，在卵巢储备功能正常的患者中，原始卵泡、初级卵泡以及大部分次级卵泡均位于卵巢皮质表面下1 mm以内的区域21。在早发性卵巢功能不全（POI）患者中，我们发现次级卵泡位于皮质表面下超过1 mm但不超过2 mm的深度21。已知窦状卵泡主要位于髓质组织中21，但在POI患者的髓质组织中并未...

卵巢功能在衰老过程中以及某些病理生理状态下会逐渐衰退，这些状态包括核型异常、自身免疫性疾病、化疗和放疗、以及卵巢手术。对于患有严重卵巢功能障碍的未婚女性而言，生育力保存是保留其未来妊娠潜力的最佳选择之一。目前，生育力保存主要在肿瘤生殖医学领域有两种常用方法。卵母细胞冷冻保存是一种成熟的生育力保存技术，已有大量成功案例报道1,2。另一方面，卵巢组织冷冻保存也已在癌症患者中用于生育力保存，但目前仍属于实验性策略3,4。这两种方法均需要获取多个成熟卵母细胞才能实现妊娠。通常，早发性卵巢功能不全（POI）患者（即40岁之前出现闭经）以及卵巢储备功能低下的中年女性，对促排卵刺激的反应较差5,6,7。此外，窦卵泡数量较少的年轻患者也表现出对卵巢刺激的低反应7。这些患者即使经过充分的卵巢高刺激，可获得的卵母细胞数量仍极为有限，因此需要多次昂贵的治疗过程，以确保获得足够数量的卵母细胞用于妊娠。
对于难以获得自身卵母细胞的早发性卵巢功能不全（POI）和卵巢反应低下（POR）患者，使用供卵者卵母细胞，结合丈夫精子进行体外受精（IVF）并实施胚胎移植（ET），是目前唯一的治疗选择8,9,10。然而，供卵治疗存在伦理问题，并可能引发自身免疫反应及妊娠相关并发症11,12,13,14。为解决上述问题，亟需建立利用患者自身卵母细胞进行不孕治疗的新方法。针对POI患者，我们已开发出体外激活（IVA）技术，可有效促进卵泡生长并获得成熟卵母细胞，已成功实现多次妊娠与分娩15。在IVA过程中，我们通过腹腔镜手术切除卵巢后，将卵巢皮质组织进行机械切割成碎片，随后使用Akt通路激活药物进行为期两天的体外培养以激活卵泡，再通过第二次腹腔镜手术，将组织移植回输卵管浆膜下人工创建的异位移植袋中15。该操作通过卵巢皮质碎片化促进原始卵泡、初级卵泡和次级卵泡的生长，其机制涉及Hippo信号通路的中断16，随后通过两天的Akt信号通路激动剂培养进一步增强卵泡激活效果17。
与严重的原发性卵巢功能不全（POI）病例不同，卵巢反应低下（POR）且卵巢储备功能减退的患者通常存在多个次级卵泡。由于单独破坏Hippo信号通路已能有效促进次级卵泡的生长16，我们近期已证明，对于POR患者，采用无需药物的IVA技术（即仅通过卵巢皮质切割与原位移植，而不使用Akt激活药物）可成功实现妊娠并分娩。无需药物的IVA技术仅需一次手术即可刺激卵巢早期卵泡发育至前窦卵泡阶段，并增加可用于体外受精-胚胎移植（IVF-ET）的获卵数量15,18。与我们最初版本的IVA相比，无需药物的IVA具有多项优势：1）避免了体外培养过程中潜在的卵泡丢失；2）减少了二次手术的侵入性与成本；3）术后仅需短期卧床休息；4）由于采用原位移植，存在自然妊娠的可能性。我们近期发表了一篇视频文章，展示了无需药物IVA的手术操作流程19以及术后卵巢刺激的详细方案20。本文中，我们介绍了实施无需药物IVA所需的实验室方法细节。

<table><tbody><tr><td>4.5 盎司标本容器</td><td>FALCON</td><td>354013</td><td>其他产品也可能适用</td></tr><tr><td>60 毫米培养皿</td><td>FALCON</td><td>351007</td><td>其他产品也可能适用</td></tr><tr><td>50 x 50 厘米无菌铺巾</td><td>HOGY Medical</td><td>SR-823</td><td>任何类型的无菌产品也可能适用</td></tr><tr><td>一次性移液管</td><td>FALCON</td><td>357575</td><td>其他产品也可能适用</td></tr><tr><td>精细剪刀，弯型</td><td>WPI</td><td>#14224-G</td><td>尽管其他产品也可能适用，但我们强烈推荐使用此产品</td></tr><tr><td>加热板</td><td>TOKAI HIT</td><td>TPiE-SP</td><td>在手术室中用于维持移植前含卵巢组织的培养皿温度</td></tr><tr><td>人血清白蛋白溶液</td><td>Irvine Scientific</td><td>9988</td><td>用于处理卵巢组织的培养基</td></tr><tr><td>IVA 套管针</td><td>KITAZATO</td><td>446030 IVA-6030E</td><td>专用于组织自体移植的套管针</td></tr><tr><td>KAI 医用一次性手术刀</td><td>WPI</td><td>#5 10-A</td><td>尽管其他产品也可能适用，但我们强烈推荐使用此产品</td></tr><tr><td>显微剪刀，弯型</td><td>WPI</td><td>#503364</td><td>尽管其他产品也可能适用，但我们强烈推荐使用此产品</td></tr><tr><td>改良 HTF 培养基-HEPES</td><td>Irvine Scientific</td><td>90126</td><td>用于处理卵巢组织的培养基</td></tr><tr><td>无菌纱布</td><td>Osaki Medical</td><td>15004</td><td>任何类型的无菌产品也可能适用</td></tr><tr><td>瑞士镊子，弯头尖端</td><td>KAI</td><td>#504505</td><td>尽管其他产品也可能适用，但我们强烈推荐使用此产品</td></tr></tbody></table>

严重卵巢功能障碍患者的生育力保存

Fertility Preservation in Patients with Severe Ovarian Dysfunction

卵巢功能在衰老过程中以及某些病理生理条件下会逐渐衰退，这些条件包括核型异常、自身免疫性疾病、化疗和放疗，以及卵巢手术。对于患有严重卵巢功能障碍的未婚女性而言，生育力保存对其未来妊娠至关重要。尽管卵母细胞冷冻保存是目前公认的生育力保存方法，但即使经过卵巢促排卵刺激，这些患者也只能保存有限数量的卵母细胞，因此需要多次重复刺激以获得足够数量的卵母细胞，从而确保未来的妊娠机会。为解决这一问题，我们近期开发了一种无需药物的体外激活（IVA）技术，该技术可促使卵巢卵泡的早期阶段发育至前窦卵泡阶段。这些前窦卵泡能够对独特的促性腺激素刺激方案产生反应，从而在每次卵巢刺激中获得更多的可采集卵母细胞用于冷冻保存。这种无药物IVA技术包括外科操作和卵巢刺激两个部分。我们在腹腔镜手术下从患者单侧或双侧卵巢中取出部分皮质组织，将卵巢皮质组织切成小块，以破坏Hippo信号通路并促进早期卵泡的发育。随后将这些组织小块原位移植回残留的卵巢组织中，并移植至双侧输卵管浆膜下。我们此前已发表过无药物IVA的外科手术步骤及后续卵巢刺激方案，但本文将详细介绍实施无药物IVA所必需的实验室操作方法。

在IVA技术的首次发表中15，我们通过腹腔镜手术将卵巢皮质组织块逐一移植至移植部位（图1A）。由于使用了100–150个卵巢组织块，腹腔镜下的组织移植过程耗时3–4小时。此外，部分卵巢组织块在移植前即已丢失。由于IVA套管针可一次性将20–30个组织块转移至移植部位（图1B），我们将手术时间缩短至1–2小时。此外，IVA套管针还可避免卵巢皮质组织块在手术过程中的丢失。
<img alt="外科手术、组织操作、腹腔镜工具、医疗技术、特写、双重视图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62098/62098fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：IVA 套管的有效性。...

我们介绍了针对卵巢功能严重障碍患者进行无药物体外激活（IVA）卵巢卵泡的实验室操作步骤。该方法可增加每次卵巢超促排卵中可获取的卵母细胞数量，有助于此类患者的生育力保存。

卵巢功能在衰老过程中以及某些病理生理状态下（包括核型异常、自身免疫性疾病等）会逐渐下降。

本视频旨在展示我们针对卵巢功能障碍患者所采用新方法的操作流程。卵巢功能会随着年龄增长以及某些病理生理状况（包括核型异常、自身免疫性疾病、化疗和放疗、卵巢手术等）而逐渐下降。大多数卵巢储备功能低下的中年女性在接受促排卵治疗以获取成熟卵母细胞时，均表现出较差的卵巢反应。此外，窦卵泡数量较少的年轻患者也表现出对卵巢刺激的反应不良。生育力保存对于保留未来的妊娠潜力至关重要。为实现生育力保存，已建立了卵母细胞冷冻保存技术。然而，这些卵巢低反应患者即使经过适当的卵巢刺激，也只能获得数量极为有限的卵母细胞，因此需要反复进行昂贵的治疗程序，以确保获得足够数量的卵母细胞来保证生育一个婴儿。为解决这一问题，我们近期开发了体外激活（IVA）技术，该技术可促使卵巢卵泡的早期阶段发育至前窦状卵泡阶段。原始的IVA技术通过卵巢皮质碎片化，破坏Hippo信号通路，从而促进始基卵泡、初级卵泡和次级卵泡的生长。随后用 Akt 信号刺激剂培养两天。该方法适用于残余卵泡较少的卵巢早衰（POI）患者。然而，对于存在多个次级卵泡的患者而言，该方法属于过度治疗。对于仍存留部分次级卵泡的患者，我们建立了一种称为无药物IVA的方法，并已验证了仅通过破坏Hippo信号通路即可促进次级卵泡生长的可能性。我们已有一些通过无药物IVA成功分娩的病例。相关无药物IVA的手术操作步骤以及后续卵巢刺激方案均已发表。在本视频中，我们介绍了无药物激活（IVA）所需的实验室方法细节。我们根据博洛尼亚标准招募了适用于无药物激活的患者。这些患者可能具有多个次级卵泡。最初，通过腹腔镜手术从一侧或双侧卵巢去除部分皮质组织。卵巢反应低下（POR）患者具有中等大小的卵巢。在大多数患者中，我们仅从单侧或双侧卵巢中提取部分皮质组织。提取的关键组织立即转移至含有 HEPES 缓冲液的培养皿中，并将该小块组织分割成小立方体以破坏 Hippo 信号通路。本视频将展示该操作的详细步骤。Hippo 信号通路对于维持器官最佳大小至关重要。该通路包含多个负性生长调控因子。当Hippo信号通路受到干扰时，作为激酶级联反应中负性生长调控因子之一的YAP其磷酸化水平降低，而YAP的核内水平则升高。YAP与TEAD转录因子协同作用，促进下游CCN生长因子的表达。另一方面，球状肌动蛋白（G-actin）聚合为丝状肌动蛋白（F-actin）对于维持细胞形态和细胞运动至关重要。先前已有报道指出，F-actin 的形成可破坏Hippo信号通路，并导致人HeLa细胞过度增殖。我们此前报道过，卵巢碎片化可增加F-actin的形成，进而导致YAP磷酸化水平下降。这会促进CCN生长因子的表达增加。切割后，将这些组织块移植到残留的卵巢中。该操作可促进残余次级卵泡的生长，从而增加成熟卵母细胞的数量。无药物IVA包括四个步骤。我们已经发表了无药物IVA的手术流程。有关卵巢皮质提取和自体移植的详细信息，请参考相关文献。本文展示了无药物IVA所需实验室方法的详细步骤。第一步，我们介绍如何进行卵巢皮质分割。第二步，我们介绍如何将卵巢皮质组织块装入移植装置中。此处，我将演示卵巢皮质分割的操作过程。本研究经本机构伦理委员会批准，所有操作均遵循《世界医学协会伦理守则》。卵巢皮质组织切碎。此步骤所需工具包括：培养皿、无菌纱布、精细剪刀、精细镊子和手术刀。我们通常使用此类培养皿和无菌纱布，但其他产品如塑料培养皿、玻璃培养皿等也可适用于本操作，任何类型的无菌纱布同样适用。然而，我们强烈推荐使用此种形状的镊子和手术刀。此外，使用加热板以维持含有组织的培养皿的温度，并将其置于无菌洞巾下。将皮质组织立即转移至含有mHTF的培养皿中。拍摄带有患者姓名的照片，以便与患者的资料进行关联。记录组织的大小、厚度和状态。去除残留的髓质组织。在组织切碎前，先去除髓质组织。将皮质置于无菌纱布上。如视频所示，用培养基润湿纱布。在此过程中，需在皮层表面干燥之前，使用一次性移液管滴加培养基。使用显微剪刀去除多余的组织，直至组织厚度达到一至两毫米。在POR患者中，次级卵泡位于皮质表面以下超过一毫米的深度，因此组织厚度不应小于一毫米。将每块组织皮质的一侧切下一小条，尺寸为1×1×5毫米，用于组织学分析，以确定是否存在残留卵泡。将此小条放入含有培养基的1.5毫升离心管中，于4°C保存直至固定。卵巢皮质立方体的制备。去除髓质组织后，将卵巢皮质切碎以破坏Hippo信号通路。首先，使用手术刀将皮质切成10毫米×10毫米×10毫米的条状。然后将这些组织条切成边长为一立方毫米的小块。由于组织在培养基中较为滑腻，切割困难。为便于切割，应将解剖刀垂直下压进行切割，而不是拖拽解剖刀。切割后，计数组织块的数量并准备自体移植。为避免培养基渗透压的变化，在组织自体移植前应适量添加培养基。对于卵巢自体移植，使用管状装置可便于加载操作。此步骤包含两个阶段。此前，卵巢组织碎片需在腹腔镜下使用镊子逐个进行移植。然而，手术完成大约需要三到四个小时。在此操作中，我们使用一种由内层注射器和外层圆筒构成的管状装置。该装置结构简单且重量轻。此外，该装置的尖端为圆形。该器械没有尖锐的端点，可避免对移植部位造成损伤。使用此类装置可一次性将20至30个立方体移至植入部位，从而实现高效移植并缩短手术时间。加载卵巢皮质碎片。IVA导管的制备。准备IVA导管，并用mHTF冲洗该装置。反复吸取并排出培养基数次。通过吸取约100微升培养基来充满套管针的尖端，以避免在加载组织碎片时立方体被抽出。加载皮质组织块。用精细镊子夹取一个组织块，并将其放入套管针的尖端。自体移植的组织块数量取决于移植部位的大小。逐个重复加载立方体，直至达到目标数量。加载立方体后，小心地将套管针递给外科医生。如果移植部位尚未准备就绪，应用手指握住套管针中包含卵巢立方体的部分，以避免立方体温度下降。我们已报道无药物IVA的临床结果。请参阅有关临床结果的已发表论文。本实验室方案每例患者需要30至50分钟。卵巢皮质碎片化平均需要10至20分钟，将这些碎片装入IVA套管针平均需要20至30分钟。具体时间取决于组织大小，但几乎所有患者均可在该平均时间内完成。结论：无药物辅助的IVA是一种针对卵巢储备功能减退的不孕症患者（POR患者）的新型治疗方法。该实验室方案可缩短手术所需时间，并减少移植过程中组织碎片的丢失。无需药物的体外激活（IVA）实验室技术有望成为未来应用卵巢组织培养获得成熟卵母细胞而不进行移植的基础。

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