严重卵巢功能障碍患者的生育力保存

本视频旨在展示我们针对卵巢功能障碍患者所采用新方法的操作流程。卵巢功能会随着年龄增长以及某些病理生理状况（包括核型异常、自身免疫性疾病、化疗和放疗、卵巢手术等）而逐渐下降。大多数卵巢储备功能低下的中年女性在接受促排卵治疗以获取成熟卵母细胞时，均表现出较差的卵巢反应。

此外，窦卵泡数量较少的年轻患者也表现出对卵巢刺激的反应不良。生育力保存对于保留未来的妊娠潜力至关重要。为实现生育力保存，已建立了卵母细胞冷冻保存技术。

然而，这些卵巢低反应患者即使经过适当的卵巢刺激，也只能获得数量极为有限的卵母细胞，因此需要反复进行昂贵的治疗程序，以确保获得足够数量的卵母细胞来保证生育一个婴儿。为解决这一问题，我们近期开发了体外激活（IVA）技术，该技术可促使卵巢卵泡的早期阶段发育至前窦状卵泡阶段。原始的IVA技术通过卵巢皮质碎片化，破坏Hippo信号通路，从而促进始基卵泡、初级卵泡和次级卵泡的生长。

随后用 Akt 信号刺激剂培养两天。该方法适用于残余卵泡较少的卵巢早衰（POI）患者。然而，对于存在多个次级卵泡的患者而言，该方法属于过度治疗。

对于仍存留部分次级卵泡的患者，我们建立了一种称为无药物IVA的方法，并已验证了仅通过破坏Hippo信号通路即可促进次级卵泡生长的可能性。我们已有一些通过无药物IVA成功分娩的病例。相关无药物IVA的手术操作步骤以及后续卵巢刺激方案均已发表。

在本视频中，我们介绍了无药物激活（IVA）所需的实验室方法细节。我们根据博洛尼亚标准招募了适用于无药物激活的患者。这些患者可能具有多个次级卵泡。

最初，通过腹腔镜手术从一侧或双侧卵巢去除部分皮质组织。卵巢反应低下（POR）患者具有中等大小的卵巢。在大多数患者中，我们仅从单侧或双侧卵巢中提取部分皮质组织。

提取的关键组织立即转移至含有 HEPES 缓冲液的培养皿中，并将该小块组织分割成小立方体以破坏 Hippo 信号通路。本视频将展示该操作的详细步骤。Hippo 信号通路对于维持器官最佳大小至关重要。

该通路包含多个负性生长调控因子。当Hippo信号通路受到干扰时，作为激酶级联反应中负性生长调控因子之一的YAP其磷酸化水平降低，而YAP的核内水平则升高。YAP与TEAD转录因子协同作用，促进下游CCN生长因子的表达。

另一方面，球状肌动蛋白（G-actin）聚合为丝状肌动蛋白（F-actin）对于维持细胞形态和细胞运动至关重要。先前已有报道指出，F-actin 的形成可破坏Hippo信号通路，并导致人HeLa细胞过度增殖。我们此前报道过，卵巢碎片化可增加F-actin的形成，进而导致YAP磷酸化水平下降。

这会促进CCN生长因子的表达增加。切割后，将这些组织块移植到残留的卵巢中。该操作可促进残余次级卵泡的生长，从而增加成熟卵母细胞的数量。

无药物IVA包括四个步骤。我们已经发表了无药物IVA的手术流程。有关卵巢皮质提取和自体移植的详细信息，请参考相关文献。

本文展示了无药物IVA所需实验室方法的详细步骤。第一步，我们介绍如何进行卵巢皮质分割。第二步，我们介绍如何将卵巢皮质组织块装入移植装置中。此处，我将演示卵巢皮质分割的操作过程。

本研究经本机构伦理委员会批准，所有操作均遵循《世界医学协会伦理守则》。卵巢皮质组织切碎。此步骤所需工具包括：培养皿、无菌纱布、精细剪刀、精细镊子和手术刀。

我们通常使用此类培养皿和无菌纱布，但其他产品如塑料培养皿、玻璃培养皿等也可适用于本操作，任何类型的无菌纱布同样适用。然而，我们强烈推荐使用此种形状的镊子和手术刀。此外，使用加热板以维持含有组织的培养皿的温度，并将其置于无菌洞巾下。

将皮质组织立即转移至含有mHTF的培养皿中。拍摄带有患者姓名的照片，以便与患者的资料进行关联。记录组织的大小、厚度和状态。

去除残留的髓质组织。在组织切碎前，先去除髓质组织。将皮质置于无菌纱布上。

如视频所示，用培养基润湿纱布。在此过程中，需在皮层表面干燥之前，使用一次性移液管滴加培养基。使用显微剪刀去除多余的组织，直至组织厚度达到一至两毫米。

在POR患者中，次级卵泡位于皮质表面以下超过一毫米的深度，因此组织厚度不应小于一毫米。将每块组织皮质的一侧切下一小条，尺寸为1×1×5毫米，用于组织学分析，以确定是否存在残留卵泡。将此小条放入含有培养基的1.5毫升离心管中，于4°C保存直至固定。

卵巢皮质立方体的制备。去除髓质组织后，将卵巢皮质切碎以破坏Hippo信号通路。首先，使用手术刀将皮质切成10毫米×10毫米×10毫米的条状。

然后将这些组织条切成边长为一立方毫米的小块。由于组织在培养基中较为滑腻，切割困难。为便于切割，应将解剖刀垂直下压进行切割，而不是拖拽解剖刀。

切割后，计数组织块的数量并准备自体移植。为避免培养基渗透压的变化，在组织自体移植前应适量添加培养基。对于卵巢自体移植，使用管状装置可便于加载操作。

此步骤包含两个阶段。此前，卵巢组织碎片需在腹腔镜下使用镊子逐个进行移植。然而，手术完成大约需要三到四个小时。

在此操作中，我们使用一种由内层注射器和外层圆筒构成的管状装置。该装置结构简单且重量轻。此外，该装置的尖端为圆形。

该器械没有尖锐的端点，可避免对移植部位造成损伤。使用此类装置可一次性将20至30个立方体移至植入部位，从而实现高效移植并缩短手术时间。

加载卵巢皮质碎片。IVA导管的制备。准备IVA导管，并用mHTF冲洗该装置。

反复吸取并排出培养基数次。通过吸取约100微升培养基来充满套管针的尖端，以避免在加载组织碎片时立方体被抽出。

加载皮质组织块。用精细镊子夹取一个组织块，并将其放入套管针的尖端。自体移植的组织块数量取决于移植部位的大小。

逐个重复加载立方体，直至达到目标数量。加载立方体后，小心地将套管针递给外科医生。如果移植部位尚未准备就绪，应用手指握住套管针中包含卵巢立方体的部分，以避免立方体温度下降。

我们已报道无药物IVA的临床结果。请参阅有关临床结果的已发表论文。本实验室方案每例患者需要30至50分钟。

卵巢皮质碎片化平均需要10至20分钟，将这些碎片装入IVA套管针平均需要20至30分钟。具体时间取决于组织大小，但几乎所有患者均可在该平均时间内完成。结论：无药物辅助的IVA是一种针对卵巢储备功能减退的不孕症患者（POR患者）的新型治疗方法。

该实验室方案可缩短手术所需时间，并减少移植过程中组织碎片的丢失。无需药物的体外激活（IVA）实验室技术有望成为未来应用卵巢组织培养获得成熟卵母细胞而不进行移植的基础。