Name: 立体纤毛束成像在活哺乳动物听觉毛细胞中的纳米级分辨率 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: 学习使用跳跃探针离子电导显微镜（HPICM）对活体啮齿动物听觉毛细胞进行纳米级分辨率成像。该技术可在无接触条件下实现立体纤毛束的长时间动态观察，为研究机械电转导机制提供重要工具。

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我们感谢英国帝国理工学院的尤里·科尔切夫（Yuri Korchev）教授在本项目各个阶段提供的长期支持与指导。我们还感谢英国帝国理工学院的帕维尔·诺瓦克（Pavel Novak）博士和安德鲁·舍夫丘克（Andrew Shevchuk）博士，以及俄罗斯国家听力学研究中心的奥列格·贝洛夫（Oleg Belov），他们在软件开发方面提供了帮助。本研究得到了美国国立耳聋与其他沟通障碍研究所/国立卫生研究院（NIDCD/NIH）的资助（项目编号：R01 DC008861 和 R01 DC014658，授予 G.I.F.）。

本研究严格遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》中的建议进行。所有动物实验程序均经肯塔基大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准（方案编号 00903M2005）。
1.&#160;纳米移液管的制备与测试
<ol>
	<li>在微移液管拉制仪中创建程序，以制备电阻在 200 至 400 MΩ 之间的移液管，这对应于约 50–70 nm 的尖端内径。具体参数取决于所用的微移液管拉制仪。若需获得具有非柔性细尖的短移液管，请参考拉制仪的操作手册。</li>
	<li>使用外径/内径为 1/0.58 mm 并带有内丝的硼硅酸盐玻璃毛细管，以利于填充。移液管的长度至关重要，因为它决定了移液管横向机械共振的频率。移液管越长，共振频率越低，越难以避免该共振。 
	注意：操作者应尽量制造可被夹持器容纳的最短移液管。本实验中纳米移液管的长度通常为 15–25 mm（图 2A）。</li>
	<li>用灌流液（Leibovitz's L-15 或添加了 20 mM D-葡萄糖以调节渗透压的 Hank's 平衡盐溶液 HBSS）将纳米移液管填充至其中点位置（图 2A）。为避免潜在的假象，应使用与记录时浴槽中相同的溶液。</li>
	<li>使用 10 倍光学显微镜检查移液管尖端是否存在气泡（图 2B）。气泡会阻碍电流通过。若移液管在实验数小时前已拉制完成，则更难去除气泡。因此，建议每次实验时均制备新的移液管。</li>
	<li>确认移液管无气泡后，将其安装至 HPICM 移液管夹持器中（图 2C）。</li>
	<li>将样品（组织或校准标准品）置于自制&#160;腔室中，并加入 4 mL 上述灌流液。</li>
	<li>将&#160;自制&#160;腔室放置于 HPICM 载物台上，并将接地电极插入溶液中。</li>
	<li>确保膜片钳放大器施加于移液管的电压为零。</li>
	<li>在 Z 方向上移动移液管，直至其接触液体表面。</li>
	<li>将放大器偏移设为零，然后施加 +100 mV 以检测移液管电流。</li>
	<li>根据欧姆定律计算移液管的电阻和直径： 
	R = V/I 
	其中 R 为电阻（MΩ），V 为施加于纳米移液管的电压（mV），I 为流经纳米移液管的电流（nA）。
	<ol>
		<li>根据已有文献所述方法，使用以下公式计算移液管的内径12： 
		IDTip&#160;= 1000/ √R 
		注意：理想电阻值应在 200 至 400 MΩ 之间。电阻高于 400 MΩ 的移液管因尺寸过小（&#60; 50 nm 内径）可能导致电流不稳定；相反，电阻低于 200 MΩ 的移液管过大（&#62; 70 nm 内径），无法分辨微小结构。建议从 200 MΩ 电阻的移液管开始成像，因其更易制备且通常电噪声更小。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2.&#160;最小化样品漂移和振动
注意：为了在成像过程中降低系统的机械噪声，请将样品安装在使用厚玻璃片（约 1.2 mm）的定制腔室中：
<ol>
	<li>取下50 mm玻璃底培养皿的玻璃部分，保留塑料壁完整。</li>
	<li>使用硅胶将细胞培养皿的塑料部分粘附在厚玻璃载片的顶部。</li>
	<li>使用硅胶或薄型双面胶带将校准样品固定在腔室中央（玻璃载片上方）。</li>
	<li>使用双面胶带将腔室牢固地固定在HPICM载物台上。</li>
	<li>成像过程中，关闭法拉第笼，并用毯子覆盖，以分别最大程度减少电干扰和热漂移。</li>
</ol>
3.使用原子力显微镜校准标准品测试分辨率
注意：在对活细胞进行成像之前，强烈建议先对原子力显微镜（AFM）标准样品进行成像（参见材料表），以排查系统问题并测试其在X、Y、Z轴方向的分辨率。校准标准品为5 × 5 mm的硅芯片，其表面具有不同形状但高度/深度固定（即20 nm或100 nm）的二氧化硅柱状结构和孔状结构。建议首先使用100 nm的校准标准品，以确保Z轴分辨率低于100 nm。在成功获得该校准样品中柱状或孔状结构的高分辨率图像后（图3A），再切换至20 nm的标准品。若对后者标准品的成像也取得成功（图3B），则可确保Z轴分辨率低于20 nm，满足对毛细胞静纤毛束成像的要求12。以下步骤适用于对两种校准标准品的成像。
<ol>
	<li>用硅胶将校准标准品固定在腔室内。</li>
	<li>向腔室中加入 4 mL HBSS 以覆盖校准样品。然后，使用双面胶带将腔室固定在 HPICM 装置的 XY 载物台上。</li>
	<li>将接地电极的磁性支架夹在记录 chamber 附近的台面上，并将电极浸入灌流液中（图1B).</li>
	<li>将纳米移液管安装到持针器中，浸入浴液溶液，并按照第1节所述步骤将其电流设定为约1 nA。</li>
	<li>使用粗调膜片钳操纵器将纳米移液电极大致定位在校准标准品的中心区域上方。由于二氧化硅结构覆盖的区域相对较大（1 × 1 mm），通常通过目视观察即可完成此定位。与耳蜗柯蒂氏器外植体（见下文）不同，该校准标准品不透明，因此无法通过光学成像进行更精确的定位。</li>
	<li>在示波器上实时监测Z压电驱动器传感器信号的同时，逐步提高设定值。在建立稳定且可重复的Z轴逼近循环后（如 图1C，底部），将设定值降低至略高于不稳定点的数值。此操作可确保该特定纳米移液管达到最佳设定值。</li>
	<li>使用膜片钳显微操作器以约5 µm/s的速度将移液管向下移动，直至到达样本位置。此时，实时Z轴定位信号的底部水平（图1C）将增加，表明纳米移液管因 &#34;传感&#34; 样品表面。纳米移液管的任何进一步移动都将导致Z轴定位信号进一步正向偏移。 
	注意：切勿超过Z轴压电驱动器的运动上限。</li>
	<li>从低分辨率开始成像（参见 表1由于AFM标准样品的安装不平整，感兴趣区域的最高点可能未知。因此，将移液管回缩的振幅（跳跃振幅）设置为至少200-500 nm。
	<ol>
		<li>确定成像区域内样品的最高点后，降低跳跃幅度。较小的跳跃幅度可实现更快的扫描，由于漂移效应减弱且振动减少，因此更适合高分辨率成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在将移液器移动至新的X-Y位置之前，先在Z轴方向回撤约200 µm，以避免与样品发生意外碰撞。 
	注意：当纳米移液管未与校准标准的中心对齐时，扫描可能恰好从表面特征区域之外开始。</li>
	<li>找到目标区域后，开始以更高分辨率进行成像（参见&#160;表1).</li>
</ol>
4.&#160;制备定制腔室以固定耳蜗外植体
注意：使用带有定制夹紧系统的腔室安装耳蜗外植体，该系统可采用柔性玻璃移液管（步骤 4.1）（图 4A）或牙线（步骤 4.2）（图 4B）。玻璃移液管腔室可进行灭菌，适用于柯蒂氏器培养；而牙线腔室则在安装过程中能更牢固地固定样本，并更好地控制静纤毛束的方向。这些定制腔室需提前制备，但可在多次成像实验中清洗后重复使用。
<ol>
	<li>使用柔性玻璃移液管制作腔室
	<ol>
		<li>使用移液管拉制仪从玻璃毛细管中拉制两根细而柔韧的玻璃纤维。我们拉制的玻璃纤维通常长度为1至2厘米，具有较好的柔韧性。</li>
		<li>在玻璃盖玻片上滴加少量硅胶弹性体。使用直径为2厘米的盖玻片。</li>
		<li>将两根玻璃纤维的末端置于硅胶液滴上，并使两根纤维之间保持微小的间距（图4A）。</li>
		<li>将盖玻片置于加热板上，快速固化弹性体（1至3分钟）。</li>
		<li>使用少量（1–3 µL）硅胶弹性体将盖玻片粘附到第2节所述腔室的玻璃底部，并静置过夜使其完全固化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用牙线制作腔室：
	<ol>
		<li>移除50毫米玻璃底培养皿的玻璃部分，保留塑料壁完整。然后使用硅胶将细胞培养皿的塑料部分粘接到一块厚度为1.2毫米的玻璃载片上。</li>
		<li>用相同的胶水将一片塑料盖玻片（6.5 × 6.5毫米）固定在腔室中央。随后在前一片之上重复此步骤，再固定另一片盖玻片。</li>
		<li>用硅胶将两根小型钨丝或镀金导线（长度12毫米，直径约0.5毫米）分别固定在盖玻片相对的两侧。导线应固定在距离盖玻片足够远的位置（&#62; 10–15毫米）（图4B）。</li>
		<li>分开两股牙线，将其放置在盖玻片上方，并通过打结方式固定在导线上。两股牙线之间应留有微小间隙（图4B，短箭头）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每次使用后清洁腔室
	<ol>
		<li>使用精细镊子小心地从腔室中取出组织，并轻轻刮除残留的组织碎片。</li>
		<li>先用70%乙醇冲洗腔室，再用蒸馏水冲洗。</li>
		<li>如有需要，可重复冲洗步骤。</li>
		<li>将腔室倒置放置在滤纸上，使其干燥，直至下次实验使用。除非计划在成像后继续培养耳蜗器官，否则腔室无需灭菌。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5.&#160;啮齿类动物耳蜗器官的解剖
<ol>
	<li>按照 elsewhere13 中详细描述的方法进行幼年出生后耳蜗外植体的解剖。</li>
	<li>对于 HPICM 成像，从小鼠出生后第 3 至 6 天（P3-6）以及大鼠出生后第 3 至 8 天（P3-8）分离柯蒂氏器。 
	注意：较年长的毛细胞在解剖过程中更容易受损，因此不能用于持续数小时的长时间延时 HPICM 成像。</li>
	<li>在进行 HPICM 成像前，务必去除盖膜。</li>
	<li>解剖完成后，立即将组织固定在第 4 节所述的任一成像室中，将其置于柔性玻璃移液管下方或两根牙线之间（图 4）。在这些成像室中预先加入 4 mL 室温灌流液（以尽量减少气泡形成）。</li>
</ol>
6.&#160;听觉毛细胞成像
<ol>
	<li>使用双面胶将带有新鲜分离的耳蜗柯蒂氏器的腔室固定在X-Y压电平台上，并确保其牢固固定，以尽量减少腔室在X和Y轴方向的漂移（图1B）。</li>
	<li>按照第1节中的步骤安装新的纳米移液管，并检查移液管电阻是否正确。</li>
	<li>使用膜片钳显微操作器，在倒置显微镜下观察柯蒂氏器外植体的同时，将纳米移液管定位至毛细胞区域上方。</li>
	<li>通过示波器记录实时电流和Z轴定位信号，检查系统是否稳定（设定值应为0.5%或更低）（如 图1C 所示）。如果Z信号不稳定，可尝试降低膜片钳放大器低通滤波器的截止频率。但该频率不能低于Z轴压电执行器的响应时间（以避免因电流读取延迟导致移液管与样品发生碰撞）。 
	注意：实践中发现，该滤波器设置为5 kHz时效果最佳。若Z信号仍不稳定，建议更换纳米移液管。</li>
	<li>一旦获得稳定记录，确定最佳设定点，并按照上述步骤3.6–3.7所述，使用HPICM移液管接近样品。</li>
	<li>首先进行低分辨率成像（见&#160;表1），跳跃幅度至少设为6至8 µm。为了对毛细胞静纤毛束等较高结构进行成像，需确保跳跃幅度足够大，以避免与这些结构发生碰撞。 
	注意：若跳跃幅度不足，移液管将无法跳过静纤毛，从而导致即将发生的碰撞。HPICM探针与静纤毛的碰撞可能损伤毛细胞束。因此，当静纤毛束高度不确定时，应使用更大的跳跃幅度。</li>
	<li>通过先进行或研究扫描电子显微镜获得的图像，熟悉柯蒂氏器的表面形貌（图5）。 
	注意：如果HPICM图像显示各成像点的高度均小于1 µm且图像均匀，则移液管很可能正在扫描玻璃底面而非组织。或者，移液管可能&#34;着陆&#34;在耳蜗外植体中远离毛细胞的其他区域。</li>
	<li>若需将移液管移动至新的X-Y位置，应先将其回撤约500 nm，以避免与组织内任何较高的结构发生碰撞。重复进行低分辨率HPICM成像，直至找到包含毛细胞的目标区域。</li>
	<li>找到目标区域后，开始进行更高分辨率的成像（见 表1）。对整个毛细胞束成像时，尽量将时间控制在15分钟以内。 
	注意：活体组织中的毛细胞束并非静止不动，其方向可能发生变化（例如由于下方支持细胞的形态改变）。因此，若图像采集速度过慢，图像可能出现运动伪影。</li>
	<li>在降低跳跃幅度以进行高分辨率成像之前，再次根据低分辨率图像确定区域内最高的结构。对于覆盖整个毛细胞束的目标区域，将跳跃幅度减小至4–5 µm；而对于束内相对较小且&#34;平坦&#34;的区域（例如2 × 2 µm），可进一步降低跳跃幅度至低于1 µm，从而提高成像速度和分辨率。</li>
</ol>
7.&#160;图像处理
注意：高分辨率离子电导显微镜（HPICM）成像中常见成像伪影。其中一些可通过调整图像采集参数进行校正，而另一些则需要在采集后使用专用的SICM查看软件或更通用的数据处理程序（如ImageJ或MatLab）进行处理。本文将介绍最常见的伪影类型，并说明如何使用SICM查看软件对其进行修正。
<ol>
	<li>进行斜率校正 
	&#8203;注意：初学者可能并不明显意识到，如果成像区域的整体倾斜度等于或大于亚微米尺度，人眼将无法分辨细胞表面的亚微米级特征（图3A、B，左侧）。因此，有必要通过将高分辨率离子电导显微镜（HPICM）三维图像数据拟合到单一平面来确定成像区域的平均斜率，并从原始HPICM图像中减去该斜率（图3A、B，中间）。
	<ol>
		<li>点击 打开，使用SICM查看器打开图像。</li>
		<li>选择 图像校正 选项卡。</li>
		<li>选择 校正斜率 选项卡。</li>
		<li>按下 校正斜率 按钮，执行自动斜率校正。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>执行扫描线对齐 
	&#8203;注意：如前所述，机械和/或热漂移以及细胞运动伪影在HPICM成像中是一个显著问题。在常规膜片钳实验中，每分钟小于一微米的微小漂移通常不易察觉；然而，在HPICM成像中，这种漂移可能导致数十纳米量级的伪影，远超过HPICM的分辨率。因此，在成像过程中，相邻HPICM扫描线之间出现Z轴方向的突然跳跃并不罕见。该问题可通过分析相邻扫描线起始点（和/或终止点）Z值的差异进行校正。
	<ol>
		<li>点击 打开，使用SICM查看器打开图像。</li>
		<li>选择 图像校正 选项卡。</li>
		<li>选择 校正斜率 选项卡。</li>
		<li>选择需要对齐的扫描线宽度，然后点击 ButtonDestripeLineFit&#160; 按钮，执行自动扫描线对齐校正。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>执行噪声抑制 
	&#8203;注意：在获取HPICM图像过程中，纳米移液管电流的微小波动可能导致移液管在远离样品表面的位置停止，尤其是在设定点较低的情况下。这会在图像中表现为细小的白色斑点。为了校正此类成像伪影，有必要识别出Z值显著高于邻近点的成像点，并将其Z值替换为邻近点的平均值。该过程可通过可调节的中值滤波器实现。
	<ol>
		<li>点击 打开，使用SICM查看器打开图像。</li>
		<li>选择 图像处理 选项卡。</li>
		<li>选择 噪声抑制 选项卡。</li>
		<li>设置需去除像素的 阈值滤波器（µm）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无竞争利益。

为了获得成功的HPICM图像，用户需要建立一个低噪声、低振动的系统，并制备合适的移液管。我们强烈建议在尝试进行任何活细胞成像之前，使用原子力显微镜（AFM）校准标准品来测试系统的稳定性。在系统分辨率经过测试后，用户可先考虑对固定的耳蜗柯蒂氏器样本进行成像，以熟悉成像参数设置，然后再进行活细胞成像。
成像的最佳设定点因不同移液管而异，具体取决于其尖端的个体形状（在通过电子显微镜检查之前未知）以及尖端附着的污物量，后者同样不可预测。设定点高于0.7%的纳米移液管应予以弃用。
在活细胞成像过程中，细胞外溶液中的灰尘和碎屑会随时间逐渐增多。这些颗粒物可能最终聚集在移液管尖端，导致电流减小，从而无法继续扫描组织——图像将完全变白，因为反馈系统会&#34;认为&#34;纳米移液管始终处于样品附近。若发生这种情况，建议将移液管沿Z轴从该组织区域撤回。此操作可能清除&#34;污染&#34;。如果移液管仍然被污染，则必须更换移液管并转移到样品的另一区域，之后用户可继续扫描组织。
目前，高分...

尽管听觉毛细胞中的静纤毛束足够大，可以通过光学显微镜观察，并在活细胞的膜片钳实验中发生偏转，但换能机制的关键结构组分（如顶端连接）只能在死细胞中通过电子显微镜成像。在哺乳动物的听觉毛细胞中，换能机制位于顶端连接的下端，即较短排静纤毛的顶端1，并通过静纤毛顶端的局部信号进行调控2,3。然而，由于静纤毛尺寸微小，目前尚无法在活体毛细胞中对该位置的表面结构进行无标记成像。
哺乳动物的耳蜗包含两种听觉感觉细胞：内毛细胞和外毛细胞。在内毛细胞中，静纤毛比外毛细胞中的更长且更粗4。在小鼠或大鼠的内毛细胞中，第一排和第二排静纤毛的直径为300–500 nm。由于光的衍射效应，无标记光学显微镜所能达到的最大分辨率约为200 nm。因此，利用光学显微镜相对容易观察到内毛细胞束中第一排和第二排的单个静纤毛&#160;。相比之下，内毛细胞中较短排的静纤毛以及外毛细胞中的所有静纤毛直径约为100–200 nm，无法通过光学显微镜进行观察5。尽管超分辨率成像技术近年来取得了进展，但这一基本限制在任何无标记光学成像中仍然存在。目前所有 commercially available 的超分辨率技术均需要使用某种类型的荧光分子6，这限制了其应用范围。除了需要特异性荧光标记分子的局限性之外，强光照射已被证明会诱导细胞损伤，并可能影响细胞过程，这在研究活细胞时是一个显著缺点7。
目前，我们对毛细胞静纤毛束超微结构细节的认识主要来自多种电子显微镜（EM）技术，例如扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）、冷冻断裂电子显微镜以及近年来应用的三维技术，如聚焦离子束连续切片或冷冻电子显微镜断层成像8,9,10,11,12,13,14,15,16。然而，所有这些电子显微技术均需要对样品进行化学固定或冷冻固定。根据所研究现象的时间尺度，这一要求使得对静纤毛顶端动态过程的研究变得要么不可能，要么极为耗时费力。
目前利用原子力显微镜（AFM）对活体毛细胞的毛束进行成像的研究还很有限17,18。由于AFM可在生理溶液中操作，理论上能够随时间推移观察活体毛细胞静纤毛束的动态变化。然而问题在于高分辨率AFM的工作原理本身，意味着AFM探针与样品之间必然存在一定的物理接触，即使在损伤最小的&#34;轻敲&#34;模式下也是如此19。当AFM探针接触到静纤毛时，通常会撞击其上，从而破坏毛束的结构。因此，该技术并不适用于观察活体，甚至固定后的毛细胞毛束17,18。使用较大的球形AFM探针可能在一定程度上缓解这一问题，因为此类探针仅对样品表面施加流体动力学力20。然而，尽管这种探针非常适合测试样品的机械特性21，但在成像柯蒂器官时仅能提供亚微米级分辨率22，且仍会对样品施加可能对高度敏感的静纤毛束产生显著影响的作用力。
扫描离子电导显微镜（SICM）是一种扫描探针显微镜，其使用充满导电溶液的玻璃移液管探针23。当移液管接近细胞时，通过移液管的电流会减小，SICM即以此检测样品表面。由于该过程发生在探针接触细胞之前，因此SICM特别适用于在生理溶液中对活细胞进行非接触式成像24。SICM的最佳分辨率可达单个纳米级别，能够分辨活细胞质膜上的单个蛋白质复合物25。然而，与其他扫描探针技术类似，SICM仅能对相对平坦的表面进行成像。我们通过发明跳跃式探针离子电导显微镜（HPICM）克服了这一限制26，在该技术中，纳米移液管在每个成像点处短暂接近样品（图1A）。利用HPICM，我们实现了对活体听觉毛细胞中静纤毛束的纳米级分辨率成像27。
该技术的另一个基本优势在于，HPICM不仅是一种成像工具。与其他扫描探针技术不同，HPICM/SICM探针本身是一种电极，广泛用于细胞生理学中的电信号记录以及局部施加各种刺激。离子通道活动通常不会干扰HPICM成像，因为通过HPICM探针的总电流远大于最大离子通道所产生的细胞外电流，相差数个数量级25。然而，HPICM能够将纳米移液管精确定位到感兴趣结构上方，并随后从此结构进行单通道膜片钳记录28。我们正是利用这一方法，首次获得了在外毛细胞静纤毛尖端的单通道活动的初步记录数据29。需要指出的是，即使纳米移液管中存在较大的电流，由于细胞外介质具有极强的电学分流作用，也不会在质膜上产生显著的电位变化。然而，可以通过液体流经纳米移液管产生的流体剪切力机械性地激活单个离子通道30，或通过局部施加激动剂实现化学激活31。
在高分辨率扫描离子电导显微镜（HPICM）中，成像过程是通过纳米移液管依次在某一点上逐次接近样品、回撤，然后在横向移动以重复接近过程来实现的（图1A）。膜片钳放大器持续向移液管内的Ag/AgCl导线施加电压，从而在浴液中产生约1 nA的电流（图1B）。当移液管远离细胞表面时，该电流的数值被确定为参考电流（Iref，图1C）。随后，移液管沿Z轴方向向样品逼近，直至电流下降至用户预设的数值（设定点），通常为Iref的0.2%–1%（图1C，上部曲线）。此时系统将该位置的Z值记录为样品的高度，并结合该成像点的X和Y坐标进行保存。接着，移液管以用户设定的速度（通常为700–900 nm/ms）从样品表面回撤（图1C，底部曲线）。回撤完成后，移液管（或在本实验中为样品——见图1B）被横向移动至下一个成像点，获取新的参考电流值，移液管再次接近样品，重复上述过程。在通常用于记录毛细胞机械转导电流的直立显微镜配置中，优先采用移液管在X-Y方向上的移动方式。在此设置下，HPICM探针并非从正上方，而是以一定角度接近毛细胞束32。然而，HPICM成像的最佳分辨率是在倒置显微镜配置中实现的（图1A，B），因为在该配置下，样品在X-Y方向上的移动与纳米移液管的Z向运动相互解耦，从而消除了潜在的机械伪影。
利用HPICM，我们获得了小鼠和大鼠内耳及外耳毛细胞静纤毛束的形貌图像，甚至可视化了直径约为5 nm的静纤毛间连接结构26,27。该技术成功成像毛细胞束依赖于多个因素。首先，纳米移液管电流的噪声（方差）应尽可能小，以实现HPICM成像尽可能低的设定值。较低的设定值可使HPICM探针在更远距离以及相对于探针接近方向的任意角度下“感知”静纤毛表面，令人意外的是，这还能提高HPICM成像的X-Y分辨率（见讨论部分）。其次，系统中的振动和漂移应减少至10 nm以下，因为它们会直接导致成像伪影。最后，尽管HPICM探针和样品台由经过校准的反馈控制压电驱动器在Z轴和X-Y轴方向移动，其精度可达单个纳米或更高，但纳米移液管尖端的直径决定了电流的扩散范围（感知体积），从而影响分辨率（图1A）。因此，在对活体毛细胞进行成像之前，至关重要的是要制备合适的移液管，使用校准样品达到所需的分辨率，并在记录系统中实现低噪声水平。
几十年来，扫描离子电导显微镜（SICM）技术一直未实现商业化，仅由全球少数实验室进行研发，其中以英国帝国理工学院 Korchev 教授的实验室处于领先地位。最近，一些基于原始高分辨率离子电导显微镜（HPICM）原理的 SICM 系统已实现商业化（见材料表）。然而，在毛细胞中对静纤毛束进行成像需要若干定制化改造，而这些改造在封闭式的“即用型”系统中在技术上具有挑战性（甚至无法实现）。因此，需要进行一定的组件集成。由于 HPICM 装置本质上是一个膜片钳系统，但对振动和漂移控制的要求更为严格，并且需要通过压电驱动实现 HPICM 探针和样品的运动（图1D），因此对于熟悉膜片钳技术的研究人员而言，这种集成相对容易完成。然而，缺乏相关背景的科研人员则必须首先接受一定的电生理学培训。尽管仍存在一些挑战，例如提高成像速度（见讨论），我们已成功在不损伤活体毛细胞的情况下，以纳米级分辨率对其静纤毛束进行了成像。&#160;
本文介绍了一种使用我们定制的系统对新生后幼年大鼠或小鼠耳蜗外植体中的活体听觉毛细胞束进行成功高分辨率离子电导显微镜（HPICM）成像的详细方案。集成组件列于材料表中。本文还描述了可能遇到的常见问题及其解决方法。

<table><tbody><tr><td>模拟示波器</td><td>B&amp;amp;K 精密</td><td>2160C</td><td>用于实时监测纳米移液管电流和Z轴接近的模拟示波器</td></tr><tr><td>原子力显微镜校准标准品</td><td>TED PELLA 公司</td><td>HS-100MG；HS-20MG</td><td>这些100纳米和20纳米的校准标准用于测试HPICM系统的性能</td></tr><tr><td>台式振动隔离器</td><td>AMETEK/TMC</td><td>Everstill K-400</td><td>主动振动隔离</td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>世界精密仪器公司（WPI）</td><td>1B100F-4</td><td>用于纳米移液管的硼硅酸盐玻璃毛细管</td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>用于调节浴液渗透压</td></tr><tr><td>数字化仪</td><td>国家仪器公司</td><td>PCI-6221</td><td>多通道输入/输出数字化仪</td></tr><tr><td>用于Z轴运动的快速模拟比例-积分-微分（PID）控制</td><td>斯坦福研究系统</td><td>SIM900，SIM960，SIM980</td><td>集成于外部PID控制器中的用于Z向移动的仪器模块。该系统需要快速响应，而这种响应速度通常未在商用压电放大器中实现。</td></tr><tr><td>法拉第笼</td><td>AMETEK/TMC</td><td>II型</td><td>用于屏蔽电磁干扰</td></tr><tr><td>玻璃底培养皿</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>FD5040-100</td><td>用作组织培养腔室的培养皿</td></tr><tr><td>Hanks' 平衡盐溶液 (HBSS)</td><td>Gibco，赛默飞世尔科技</td><td>14025092</td><td>细胞外（灌流）溶液</td></tr><tr><td>仪器放大器</td><td>布朗利精密仪器</td><td>Model 440</td><td>仪器放大器提供所需的偏移、滤波以及二次放大或衰减</td></tr><tr><td>基于激光的微电极拉制仪</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-2000/G</td><td>使用微电极拉制仪制备纳米移液管。制备尖锐的石英移液管需要使用激光。</td></tr><tr><td>Lebovitz's L-15，不含酚红</td><td>Gibco，赛默飞世尔科技</td><td>21083027</td><td>细胞外（浴）溶液</td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>Scientifica</td><td>PatchStar</td><td>用于 &quot;课程&quot; Z轴压电驱动器的定位</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>尼康</td><td>Eclipse TS100</td><td>倒置光学显微镜</td></tr><tr><td>膜片钳放大器</td><td>Molecular Devices</td><td>Axopatch 200B</td><td>膜片钳放大器测量通过纳米移液管的电流</td></tr><tr><td>压电放大器（XY轴）</td><td>Physik Instrumente (PI)</td><td>E-500.00，E-505.00，E-509.C2A</td><td>XY压电平移台的放大与PID控制</td></tr><tr><td>压电放大器（Z轴）</td><td>Piezosystem jena</td><td>ENT 400 &amp;和 800</td><td>由 ENT 400 电源和两台并联的 ENT 800 放大器组成的定制放大器，以实现最大 1.6 nA 的电流</td></tr><tr><td>塑料盖玻片</td><td>TED PELLA 公司</td><td>26028</td><td>用于组织培养室的制备&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SICM 控制器 &amp;和软件*</td><td>Ionscope，英国（ionscope.com）</td><td>N/A</td><td>基于Innovative Integration Ltd公司的SBC6711数字信号处理板的定制控制器</td></tr><tr><td>硅酮弹性体（Sylgard）</td><td>世界精密仪器公司（WPI）</td><td>SYLG184</td><td>用于将柔性玻璃纤维连接至组织腔室</td></tr><tr><td>硅胶</td><td>陶氏化学公司</td><td>734</td><td>用于粘合组织培养腔室的各个部件</td></tr><tr><td>钨棒</td><td>A-M Systems</td><td>717500</td><td>用于在组织腔室内固定牙线股</td></tr><tr><td>XY压电纳米定位器</td><td>Physik Instrumente (PI)</td><td>P-733.2DD</td><td>带有电容传感器的XY平移台</td></tr><tr><td>Z轴压电纳米定位器</td><td>Piezosystem jena</td><td>RA 12/24 SG</td><td>带应变片传感器的环形压电驱动器</td></tr><tr><td>Ionscope 不再销售独立的 SICM 控制器。目前还有少数其他商用系统：&amp;nbsp; NX12-Bio 和 NX10 SICM，&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Park Systems，韩国；ICAPPIC Limited，英国（icappic.com）的SICM模块。所有这些系统均基于原始&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPICM 原理。然而，对毛细胞中的静纤毛束进行成像需要若干技术上的定制改装&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>在封闭环境中具有挑战性（甚至不可能） &amp;ldquo;即用型&amp;rdquo; 系统，例如 Ionscope 或 NX12-Bio/NX10。目前仅有一种&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>模块化系统（ICAPPIC），具有灵活的配置，可适用于任何扫描离子电导显微镜（SICM）或高通量离子电导显微镜（HPICM）实验，但需要一定的组件集成。&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

活体哺乳动物听觉毛细胞中纳米级分辨率的静纤毛束成像

Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells

内耳毛细胞可检测声音引起的位移，并通过由静纤毛组成的毛束将这些刺激转化为电信号，其中静纤毛按高度递增的行排列。当静纤毛发生偏转时，会牵拉连接相邻静纤毛、直径约5 nm的微小细胞外顶端连接（tip links），从而将力学力传递至机械敏感性转导通道。尽管数十年来研究人员已在活体毛细胞中对机械转导过程进行了研究，但位于静纤毛顶端、与功能密切相关的关键超微结构细节（如顶端连接的动态变化或转导依赖性的静纤毛重塑）仍只能通过电子显微镜在固定死亡细胞中进行观察。理论上，扫描探针技术（如原子力显微镜）具备足够的分辨率以可视化静纤毛表面结构。然而，无论采用何种成像模式，原子力显微镜探针与毛束之间即使发生最轻微的接触，通常也会造成毛束损伤。本文介绍了一种用于活体啮齿类动物听觉毛细胞成像的跳跃式探针离子电导显微镜（HPICM）详细实验方案。这种非接触式扫描探针技术能够在不与样品发生物理接触的前提下，以单纳米级分辨率对具有复杂拓扑结构的活细胞表面（如毛细胞）进行长时间延时成像。HPICM利用通过玻璃纳米移液管的电流来检测探针附近细胞表面的位置，同时由三维压电定位系统扫描表面并生成图像。借助HPICM，我们成功对活体听觉毛细胞中的静纤毛束及其相互连接的结构进行了数小时的连续成像，且未观察到明显损伤。我们预期，HPICM的应用将有助于直接探究活体毛细胞静纤毛中发生的超微结构变化，从而更深入地理解其功能机制。

本文所介绍的方案可用于可视化具有复杂拓扑结构的任何活细胞。按照这些步骤，我们常规获得了活体大鼠听觉毛细胞束的图像（图6B，D）。尽管与扫描电镜（SEM）图像相比，其X-Y方向分辨率较低，但我们的高分辨率离子电导显微镜（HPICM）图像仍能成功分辨出静纤毛的不同排布、静纤毛顶端的形态，甚至连接相邻静纤毛的细小连接结构（直径约5 nm）（图6F）。此外，HPICM图像具备SEM图像所缺乏的三维信息。由于该成像技术为非接触式，我们还能够对同一毛细胞束连续进行数小时（通常为5–6小时）的时间序列HPICM成像，而不会破坏细胞束的完整性（图7）。因此，HPICM在研究毛细胞束随时间发生的动态结构变化方面展现出巨大潜力。
尽管我们提供了移液器尺寸、当前设定点、低分辨率和高分辨率参数以及跳跃幅度的多个范围，但每位用户可能仍需略微优化其设置，以成功获得活体毛细胞束的高分辨率离子电导显微成...

本文介绍了一种跳跃探针离子电导显微镜（HPICM）的实验方案，这是一种非接触式扫描探针技术，可用于对活体听觉毛细胞中的静纤毛束进行纳米级成像。

内耳毛细胞可检测声音引起的位移，并将这些刺激转导为电信号，该过程发生于由静纤毛组成的毛束中。

该实验方法可帮助我们研究毛细胞静纤毛束表面机械电转导装置中纳米结构组分的动态变化。该技术的主要优势在于，无需与样品发生物理接触，即可对具有复杂拓扑结构的活细胞表面进行单纳米级分辨率的时间序列成像。该技术可应用于几乎任何类型的活细胞。我们此前将感染病毒的肺上皮细胞系、肌细胞与我的图像中的细菌进行了匹配。在每次成像开始前测试纳米移液管。制备纳米移液管后，检查是否存在气泡，如有气泡则将其去除，并将纳米移液管安装到跳跃式探针离子电导显微镜的移液管支架上。向浴槽中加入四毫升浴液，并将浴槽放置于HPICM载物台上。将接地电极插入浴液中，并确保通过膜片钳放大器施加到移液管上的电压为零。将显微操作器置于垂直位置后，移动移液管的Z轴方向直至其接触液面，将放大器的偏移量调零，然后施加+100毫伏电压以检测移液管电流。使用硅胶将原子力显微镜校准标准品固定在样品室中，并用四毫升 HBSS 覆盖样品。使用双面胶带将样品室固定在高速离子电导显微镜（HPICM）装置的 X Y 载物台上，并按照演示方法将新的纳米移液管安装到夹持器上。在测试纳米移液管的电阻和直径后，将电流设定为一纳安（1 nA）。使用粗调钳制操纵器将纳米移液管定位在标定标准品中心位置的上方，同时在示波器上实时监测Z轴压电驱动器传感器的信号，并逐步提高设定值。在建立稳定且可重复的Z轴逼近循环后，将设定值降低至接近不稳定点但略高于该点的数值，然后以大约每秒五微米的速度向下移动移液管，直至其到达样品表面。实时Z轴定位信号的底部水平将会上升，表明纳米移液管因感应到样品表面而被回撤。由于在原子力显微镜标准样品台上安装不平整，感兴趣区域的最高点可能未知。因此，将移液管回缩的振幅设置为至少200至500纳米。注意不要超过Z轴压电驱动器移动的上限，从低分辨率开始成像。确定成像区域中样品的最高点后，减小跳跃幅度，并沿 Z 轴将移液管回撤约 200 微米，以在将其移动至新的 X Y 位置前避免与样品发生意外碰撞。当定位到目标区域后，以更高分辨率开始成像。对于听觉毛细胞成像，使用牙线或柔性玻璃移液管将新鲜分离的科尔蒂器官牢固地固定在成像腔室中。使用双面胶带将腔室牢固地固定在 XY 压电载物台上，并按照演示方法将新的纳米吸管安装到持管器上。检查纳米吸管电阻后，使用膜片钳显微操作器在倒置显微镜下将纳米吸管定位至毛细胞区域上方。在示波器上记录实时电流和 Z 轴定位信号，以检查系统在设定点为 0.5% 或更低时是否稳定，并据此确定最佳设定点，然后按照演示方式接近样品。以至少六到八微米的跳跃幅度对样品进行低分辨率成像。若需将纳米移液管移动至新的 X Y 位置，应先将移液管回撤约 500 纳米，以避免与组织中较高的结构发生碰撞，随后重复低分辨率 HPICM 成像，直至定位到包含毛细胞的目标区域。然后在 15 分钟或更短时间内对目标区域进行高分辨率成像。HPICM 技术可用于观察具有复杂表面形貌的任何活细胞，例如活体大鼠听觉毛细胞束。尽管其在 X Y 方向上的分辨率低于扫描电子显微镜图像，但 HPICM 图像仍能成功分辨出静纤毛的不同排布结构，包括静纤毛尖端的形态，甚至可观察到连接相邻静纤毛的、直径仅五纳米的细小连接结构。由于HPICM成像具有非接触特性，可对同一毛细胞束进行数小时的连续时间序列成像，而不会破坏束的完整性。需要注意的是，若设定点过低，系统可能会将电流的微小波动误判为已接触到细胞表面，从而在图像中产生白点噪声。类似地，过大的跳跃幅度可能会增加移液管的横向共振，同样会导致图像中出现噪声像素。相反，如果跳跃幅度太小，或设定点过高，纳米移液管可能会与样品发生碰撞，导致成像伪影或毛束损伤。进行该操作时最重要的是：处理活细胞时，每个毛束的操作时间应少于15分钟。在获得毛束图像后，可尝试从静纤毛表面特定位置获取单通道记录，以研究机械转导通道的特性。

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