Name: 用于刺激生物组织的电动和磁场设备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 29 s
Description: 了解如何使用COMSOL Multiphysics进行电场和磁场计算模拟，以验证用于刺激软骨细胞、成骨细胞和纤维母细胞的生物组织刺激设备。该协议为神经科学和生物物理学研究提供了全面的构建和测试指南。

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作者感谢&#34;Fondo Nacional de Financiamiento para la Ciencia, la Tecnología, y la Innovación -Fondo Francisco José de Caldas- Minciencias&#34;以及哥伦比亚国立大学通过项目编号80740-290-2020提供的资金支持，同时感谢Valteam Tech - Research and Innovation 在视频编辑过程中提供的设备和技术支持。

作者声明不存在利益冲突。

用于治疗影响人体组织不同病理状况的方法包括药物疗法32或外科手术干预33，旨在局部缓解疼痛或通过移植体或移植物替代受损组织。近年来，自体细胞治疗被提出作为一种治疗损伤组织的替代疗法，该方法从患者体内分离细胞，并通过体外技术进行扩增，随后将其植入损伤部位34。鉴于自体细胞治疗已被证明对组织修复具有直接促进作用，研究人员已开发出多种策略以提高该技术的有效性。例如，生物物理刺激已被用作一种非侵入性替代疗法，用于刺激多种生物样本，通过促进细胞增殖和分子合成来调节细胞功能35,36。在常用的生物物理刺激中，电刺激和磁疗已被广泛应用于刺激细胞、组织移植体及支架材料。已有证据表明，电刺激可减轻疼痛并加速多种组织的愈合过程37。关于磁疗，已有研究报道该刺激可改善植入物与宿主组织的整合、加快愈合过程、局部缓解疼痛并增强瘢痕强度<sup class="...

已证明电场（EFs）和磁场（MFs）能够改变细胞动态，促进细胞增殖，并增加与组织细胞外基质相关的主要分子的合成1。这些生物物理刺激可通过特定设置和设备以不同方式施加。关于产生电场的设备，直接耦合刺激器使用与体外生物样本接触或直接植入动物及患者体内组织的电极2；然而，仍存在一些局限性和缺陷，包括电极接触导致的生物相容性不足、pH值以及分子氧水平的变化1。相反，间接耦合设备在两个电极之间产生电场，电极平行放置于生物样本两侧3，从而提供一种非侵入性替代技术来刺激生物样本，避免组织与电极的直接接触。此类设备可推广至未来的临床应用，以实现对患者创伤最小化的操作。关于产生磁场的设备，感应耦合刺激器产生随时间变化的电流，该电流流经环绕细胞培养物的线圈4,5。最后，还存在组合式设备，利用电场和静态磁场共同产生瞬态电磁场1。鉴于存在多种刺激生物样本的配置方式，在施加生物物理刺激时必须考虑电压和频率等变量。电压是一个重要变量，因其影响生物组织的行为；例如，已有研究表明细胞迁移、定向和基因表达依赖于所施加电压的幅值3,6,7,8,9,10&#160;。频率在生物物理刺激中也起着重要作用，已有证据表明这些频率在体内自然存在。研究表明，高频和低频均对细胞具有有益效应；特别是作用于细胞膜上的电压门控钙通道或内质网，可在细胞内水平触发不同的信号通路1,7,11。
根据上述内容，一种用于产生电场（EFs）的装置由连接至两个平行电容器的电压发生器组成12。Armstrong 等人采用该装置刺激软骨细胞的增殖速率和分子合成13。Brighton 等人对该装置进行了改进，通过在细胞培养板的顶盖和底盖上钻孔进行改造，并用盖玻片填充孔洞，其中底部玻璃用于培养生物组织。在每片盖玻片上放置电极以产生电场14。该装置被用于电刺激软骨细胞、成骨细胞和软骨组织外植体，结果显示细胞增殖14,15,16以及分子合成3,17均有所增加。Hartig 等人设计的装置包含一个波形发生器和一个电压放大器，二者连接至平行电容器，电极由高质量不锈钢制成，并置于绝缘外壳中。该装置用于刺激成骨细胞，结果显示其增殖和蛋白质分泌显著增加18。Kim 等人所使用的装置包含一个双相电流刺激芯片，该芯片采用高压金属氧化物互补半导体制造工艺制备。同时设计了一种细胞培养板，可在导电表面进行细胞培养并施加电刺激，电极以金镀层覆盖于硅片之上19。该装置用于刺激成骨细胞时，显示出增殖能力增强以及血管内皮生长因子的合成增加19，同时促进碱性磷酸酶活性、钙沉积和骨形态发生蛋白的产生20。类似地，该装置也被用于刺激人骨髓间充质干细胞的增殖速率及其血管内皮生长因子的表达21。Nakasuji 等人设计的装置由连接至铂片的电压发生器组成，电极可测量24个不同位置的电势。该装置用于刺激软骨细胞，结果表明电场未改变细胞形态，但可提高细胞增殖和分子合成水平22。Au 等人使用的装置由一个玻璃腔室构成，内含两根碳棒，并通过铂丝连接至心脏刺激器。该刺激器用于刺激心肌细胞和成纤维细胞，可改善细胞伸长及成纤维细胞的排列23。
已基于亥姆霍兹线圈制造出多种用于刺激不同类型生物样本的磁场（MF）装置。例如，亥姆霍兹线圈已被用于促进软骨细胞的增殖和分子合成24,25，增强关节软骨组织外植体的蛋白聚糖合成26，改善成骨样细胞中与骨形成相关的基因上调27，以及提高内皮细胞的增殖和分子表达28。亥姆霍兹线圈通过两个前后相对的线圈产生磁场。为确保磁场均匀，线圈之间的距离必须等于线圈半径。使用亥姆霍兹线圈的缺点在于其尺寸，因为线圈必须足够大才能产生所需的磁场强度。此外，线圈之间的距离必须适当，以确保生物组织周围磁场的均匀分布。为避免亥姆霍兹线圈带来的问题，已有不同研究专注于螺线管线圈的制造。螺线管线圈基于一个缠绕铜线的管状结构以产生磁场。铜线的输入端可直接连接至电源插座或电源装置，以激励线圈并在螺线管中心产生磁场。线圈匝数越多，产生的磁场越强。磁场强度还取决于施加于线圈的电压和电流29。螺线管线圈已被用于磁刺激多种不同类型的细胞，如HeLa、HEK293和MCF730，或间充质干细胞31。
不同作者所使用的装置均未考虑电极的适当尺寸或线圈的正确长度，因而无法在生物样本上均匀分布电场和磁场。此外，现有装置仅能产生固定的电压和频率，限制了其在特定生物组织刺激中的应用。因此，本方案中采用计算模拟方法，对电容系统和线圈进行仿真，以确保电场和磁场在生物样本上的均匀分布，避免边缘效应。同时，本文还展示了电子电路的设计可在线圈与电极之间产生可调的电压和频率，从而生成能够克服细胞培养板及空气阻抗所带来限制的电场和磁场。这些改进将有助于开发出可适用于任意生物组织刺激的非侵入性且具有适应性的生物反应器。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;电刺激器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>运算放大器</td><td>Motorola</td><td>LF-353N</td><td>----&lt;br/&gt; 数量：1</td></tr><tr><td>电阻器</td><td>----</td><td>----</td><td>22 k&amp;Omega;&lt;br/&gt; 数量：1</td></tr><tr><td>电阻器</td><td>----</td><td>----</td><td>10 k&amp;Omega;&lt;br/&gt; 数量：3</td></tr><tr><td>电阻器</td><td>----</td><td>----</td><td>2.6 k&amp;Omega;&lt;br/&gt; 数量：2</td></tr><tr><td>电阻器</td><td>----</td><td>----</td><td>2.2 k&amp;Omega;&lt;br/&gt; 数量：1</td></tr><tr><td>电阻器</td><td>----</td><td>----</td><td>1 k&amp;Omega;&lt;br/&gt; 数量：1</td></tr><tr><td>电阻器</td><td>----</td><td>----</td><td>220 &amp;Omega;&lt;br/&gt; 数量：2</td></tr><tr><td>电阻器</td><td>----</td><td>----</td><td>22 &amp;Omega;&lt;br/&gt; 数量：5</td></tr><tr><td>电阻器</td><td>----</td><td>----</td><td>10 &amp;Omega;&lt;br/&gt; 数量：1</td></tr><tr><td>电阻器</td><td>----</td><td>----</td><td>6.8 &amp;Omega;&lt;br/&gt; 数量：1</td></tr><tr><td>电阻器</td><td>----</td><td>----</td><td>3.3 &amp;Omega;&lt;br/&gt; 数量：2</td></tr><tr><td>聚酯电容器</td><td>----</td><td>----</td><td>1 nF&lt;br/&gt; 数量：2</td></tr><tr><td>聚酯电容器</td><td>----</td><td>----</td><td>100 nF&lt;br/&gt; 数量：1</td></tr><tr><td>甚高频波段放大器场效应晶体管（JFET）</td><td>Toshiba</td><td>2SK161</td><td>----&lt;br/&gt; 数量：1</td></tr><tr><td>功率双极结型晶体管（BJT）NPN</td><td>Mospec</td><td>TIP 31C</td><td>----&lt;br/&gt; 数量：1</td></tr><tr><td>齐纳二极管</td><td>Microsemi</td><td>1N4148</td><td>----&lt;br/&gt; 数量：1</td></tr><tr><td>开关</td><td>Toogle Switch</td><td>SPDT - T13</td><td>----&lt;br/&gt; 数量：3</td></tr><tr><td>环形铁氧体磁芯</td><td>Caracol</td><td>----</td><td>T*22*14*8&lt;br/&gt; 数量：1</td></tr><tr><td>铜线</td><td>Greenshine</td><td>----</td><td>AWG &amp;ndash; 24&lt;br/&gt; 数量：1</td></tr><tr><td>带母端外壳的Relimate接头</td><td>ADAFRUIT</td><td>----</td><td>8针连接器&lt;br/&gt; 数量：1</td></tr><tr><td>带母端外壳的Relimate接头</td><td>ADAFRUIT</td><td>----</td><td>2针连接器&lt;br/&gt; 数量：1</td></tr><tr><td>母插式端子连接器</td><td>JIALUN</td><td>----</td><td>4 mm灯笼插头（插头+插座）15 A&lt;br/&gt; 数量：1</td></tr><tr><td>铝制散热片</td><td>AWIND</td><td>----</td><td>适用于TIP 31C晶体管&lt;br/&gt; 数量：1</td></tr><tr><td>发光二极管（LED）</td><td>CHANZON</td><td>----</td><td>5 mm红色&lt;br/&gt; 数量：1</td></tr><tr><td>集成电路插座连接器</td><td>Te Electronics Co., Ltd.</td><td>----</td><td>双排8针DIP&lt;br/&gt; 数量：1</td></tr><tr><td>3针连接器套装</td><td>STAR</td><td>----</td><td>JST PH 2.0&lt;br/&gt; 数量：3</td></tr><tr><td>2针螺钉连接器</td><td>STAR</td><td>----</td><td>用于PCB&lt;br/&gt; 数量：1</td></tr><tr><td>3针螺钉连接器</td><td>STAR</td><td>----</td><td>用于PCB&lt;br/&gt; 数量：1</td></tr><tr><td>香蕉插孔测试导线</td><td>JIALUN</td><td>----</td><td>P1041 - 4 mm - 15 A&lt;br/&gt; 数量：7</td></tr><tr><td>子弹式连接器转香蕉插头充电导线</td><td>JIALUN</td><td>----</td><td>4 mm公对公/母对母适配器 - 15 A&lt;br/&gt; 数量：1</td></tr><tr><td>外壳</td><td>----</td><td>----</td><td>ABS&lt;br/&gt; 数量：1</td></tr><tr><td>电极</td><td>----</td><td>----</td><td>不锈钢&amp;ndash;钢&lt;br/&gt; 数量：2</td></tr><tr><td>电极支架</td><td>----</td><td>----</td><td>聚四氟乙烯（Teflon）&lt;br/&gt; 数量：2</td></tr><tr><td>印刷电路板</td><td></td><td></td><td>数量：1</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;磁刺激器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>铜线</td><td>Greenshine</td><td>----</td><td>AWG &amp;ndash; 18&lt;br/&gt; 数量：1</td></tr><tr><td>交流电源插头</td><td>----</td><td>----</td><td>120 V AC &amp;ndash; 60 Hz&lt;br/&gt; 数量：1</td></tr><tr><td>香蕉母插孔测试导线</td><td>JIALUN</td><td>----</td><td>1套双注塑 - 4 mm &amp;ndash; 15 A&lt;br/&gt; 数量：2</td></tr><tr><td>香蕉公插孔测试导线</td><td>JIALUN</td><td>----</td><td>1套双注塑 - 4 mm 15 A&lt;br/&gt; 数量：1</td></tr><tr><td>细胞培养板支架</td><td>----</td><td>----</td><td>聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）&lt;br/&gt; 数量：1</td></tr><tr><td>保险丝</td><td>Bussmann</td><td>2A</td><td>----&lt;br/&gt; 数量：1</td></tr><tr><td>变压器</td><td>----</td><td>----</td><td>1A &amp;ndash; 6 V AC&lt;br/&gt; 数量：1</td></tr><tr><td>管子</td><td>----</td><td>----</td><td>聚氯乙烯（PVC）&lt;br/&gt; 数量：1</td></tr><tr><td>可变变阻器</td><td>MCP</td><td>BXS150</td><td>10 &amp;Omega;&lt;br/&gt; 数量：1</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;通用设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>数字双电源&amp;nbsp;</td><td>PeakTech</td><td>DG 1022Z</td><td>2 x 0 - 30 V / 0 - 5 A 恒流 / 5 V / 3 A 固定&lt;br/&gt; 数量：1</td></tr><tr><td>数字示波器</td><td>Rigol</td><td>DS1104Z Plus</td><td>100 MHz带宽，4通道&lt;br/&gt; 数量：1</td></tr><tr><td>数字万用表</td><td>Fluke</td><td>F179</td><td>直流/交流电压（1000 V），直流/交流电流（10 A），频率100 kHz&amp;ndash; CA 10 A. 频率 100 kHz&amp;ndash; CA 10 A. 频率 100 kHz&lt;br/&gt; 数量：1</td></tr></tbody></table>

用于生物组织刺激的电场与磁场装置

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

电场（EFs）和磁场（MFs）在组织工程中被广泛用于改善细胞的动态行为，例如增殖、迁移、分化、形态以及分子合成。然而，在对细胞、组织或支架进行刺激时，需要考虑此类刺激的强度和刺激时间等变量。由于电场和磁场会因细胞反应的不同而变化，目前尚不明确如何构建能够产生适当生物物理刺激以作用于生物样本的装置。事实上，当施加生物物理刺激时，关于其计算方法和分布情况的证据仍然缺乏。本实验方案专注于设计和制造用于产生电场和磁场的装置，并建立一种计算方法，以预测生物样本内外部生物物理刺激的分布情况。电场装置由两个平行的不锈钢电极组成，分别位于生物培养物的顶部和底部。电极连接至一个振荡器，以在60 kHz频率下产生电压（50、100、150和200 Vp-p）。磁场装置由一个线圈构成，通过变压器供电，在60 Hz频率下产生电流（1 A）和电压（6 V）。使用聚甲基丙烯酸甲酯支架将生物培养物置于线圈中央。计算模拟结果揭示了电场和磁场在生物组织内部及外部的均匀分布特性。该计算模型是一种具有前景的工具，可通过调整电压、频率、组织形态、培养板类型、电极和线圈尺寸等参数，来估算实现特定细胞反应所需的电场和磁场条件。

计算模拟 
电场（EFs）和磁场（MFs）的分布如图3所示。一方面，可以观察到电容系统中电场的均匀分布（图3A）。通过绘制电场分布图，可详细观察生物样本内部电场的强度（图3B）。该模拟有助于参数化电极尺寸并指导其制造，以避免边缘效应。另一方面，可以观察到由螺线管线圈产生的磁场的均匀分布（图3C）。通过绘制磁场分布图，可详细观察线圈内部磁场的强度（图3D）。该模拟对于测量磁场保持一致的距离并设计聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）支撑结构至关重要。该支撑结构不仅确保线圈中心处磁场的均匀分布，也确保待刺激生物样本中的磁场均匀性。
电刺激器和磁刺激器产生的信号 
电刺激器产生的输出信号如<strong class="xfi...

本方案详细描述了构建用于刺激生物组织的电刺激器和磁刺激器的逐步过程。该方案包括电场和磁场的计算机模拟指南以及刺激装置的制造方法。

电场（EFs）和磁场（MFs）在组织工程中被广泛应用，以改善细胞增殖、迁移等细胞动力学行为。

生物物理刺激已被用于激发不同组织中的细胞和分子动态。一些研究评估了电场和磁场对软骨细胞、成骨细胞、成纤维细胞、组织移植物及支架等多种细胞类型的影响。尽管已开发出多种具有特定功能的刺激装置以作用于生物组织，但仍需验证那些可调节电压和频率的电学与磁学装置，以便刺激更广泛的生物样本。为验证电场分布，使用 COMSOL Multiphysics 进行了计算机模拟。此处采用轴对称构型来模拟电容系统，该系统由两个平行电极、空气、细胞培养板、培养基以及生物样品组成；在本例中，生物样品由支架材料代表。各组分的材料属性包括电导率和相对介电常数。施加的电压设定为100伏特，频率设定为60千赫兹正弦Wien电路。在所有参数输入完成后，通过模型计算以观察各表面的电场分布。为了更详细地观察电场分布情况，可以对整个系统中的电场进行分析，包括支架内部、培养基中、空气中、培养孔板内部以及电极外部区域。该电路将基于文氏电桥振荡器产生电场。这是一种RC相位超前网络电路，同时采用正反馈和负反馈。文氏电桥振荡器由一个无源网络构成，该网络是一种电抗性分压电路，其中输入电压通过R5与C2的串联组合以及R6与C3的并联组合进行分压。为了计算频率，我们使用谐振频率公式，其中 F₀ 为频率，R = R5 = R6 为电阻，C = C2 和 C3 为电容。该电路设计使得当输出信号幅度增大时，电阻分压增大；当输出电压幅度减小时，电阻分压减小。因此，放大器的电压增益会自动响应输出信号的幅度变化。然后计算了一组电阻的组合，以产生四个较高的电压。最后，在利用变压器放大信号之前，实现了一个信号整流阶段。电路仿真完成后，制作了印制电路板，从而得到了振荡器产生的最终正弦信号的波形图。电路仿真完成后，下一步是在面包板上搭建文氏桥振荡器，在此可以测试电路产生的四个输出电压及其频率。然后，我们将为里德·柯蒂斯（Reed Curtis）格式制作印刷电路板，并在板上安装振荡器以及用于调节振荡器输出电压的电阻器。最后，我们完成了该电路指示器的最终组装。测试电刺激器设备的第一步是验证电源的输出电压。为此，我们将电源调至并联模式，并测量地线与正负端子之间的输出电压，分别为12伏和12伏。确认输出电压无误后，即可将电源的每个输出端连接到电刺激器设备的电流输入端。白色电缆为接地线。黑色电缆为负电压，红色电缆为正电压。为了测试电刺激装置产生的输出信号，我们将培养板置于电极的中央位置。随后，我们将电刺激器设备产生的输出电压连接到每一块平行板上。由于我们使用的是交流电，因此将振荡器的输出电压连接到平行板的电极时无需遵循严格的顺序。为了验证输出信号，我们使用示波器，将其直接连接至各个电极。当使用示波器捕获C九信号时，我们调整了信号的幅度和周期，以完整观察波形。在此步骤中，可以验证电刺激装置产生的四个电压：50伏、100伏、150伏和200伏，频率为60千赫兹，波形为正弦波。与电场类似，采用计算模拟来验证磁场分布。使用轴对称构型来模拟由铜导线和空气组成的线圈。此处考虑了不同材料的属性，并将施加的频率设置为 60 Hertz。在输入所有参数后，通过计算模型以观察磁场分布。最后，绘制示意图以观察磁场在螺线管中心区域的均匀分布情况。采用由安培定律推导出的螺线管磁场公式来计算磁场，其中 μ₀ 为真空磁导率，N' 为铜导线的匝数。I' 为电流，h' 为其直径处被分级的线圈长度。选择这些参数的值用于估算两毫米的磁场。用于产生磁场的电路已通过计算模拟。此处，变压器直接连接到电源插座。使用可变电阻器来调节电流，并产生长度为1毫米的磁场。电路中连接了保险丝以保护电路。完成计算后，我们制作了聚甲基丙烯酸甲酯支撑结构和线圈。在完成模拟后，我们制造了一个特殊装置，以确保培养皿位于刺激装置的中心位置。随后，我们在PVC管上绕制了一个由450圈铜线构成的线圈，并将其置于培养环境的中心，以确保线圈中心区域产生均匀的磁场。接着，我们制造了一个输出为6伏特和1安培的变压器，用于为电路供电。为了测试磁刺激装置，我们测量了线圈产生的电流。该测量通过将万用表与线圈串联连接来完成。一旦确认电流约为1安培，便将变压器连接至线圈以闭合电路。随后，将示波器连接至线圈的输出端，以验证磁刺激产生的 60 赫兹正弦信号。当对细胞培养物进行电刺激时，在更换培养基的过程中保持无菌条件至关重要，因此需要将电极引入培养舱内。更换培养基后，将培养板置于电极上方。将细胞培养物放回培养箱时，先将下电极置于稳定的表面上，再将上电极放置在细胞培养物上方。然后，将电刺激装置的输出电缆连接到每个电极的端口。最后，小心地将电极放入培养箱中，以开始电刺激。在更换对磁刺激生物样本的培养基时，也需要考虑类似的无菌条件。此处使用直径35毫米的培养皿来培养细胞、组织外植体或支架。更换培养基后，需将细胞培养物放置于聚甲基丙烯酸甲酯支撑架中。此处每个培养皿上下叠放。然后，将线圈小心地放置在支架上，以覆盖细胞培养物。最后，将磁刺激装置放入培养箱中，以开始磁刺激。如您所见，该电刺激装置已用于刺激软骨细胞和成骨细胞。在此，我们评估了细胞增殖和分子合成情况。该电刺激装置还被用于刺激软骨骺炎及离体生长板组织，以评估生长板中的形态学变化。此外，将间充质干细胞接种于含尿酸和明胶的水凝胶中，并对其进行电刺激，以评估其软骨诱导分化潜能。另一方面，我们测试了磁刺激装置对软骨细胞的刺激作用，以评估细胞增殖和分子合成情况。本研究中开发的装置避免了电极与生物材料直接接触时可能产生的生物相容性问题。此外，这类设备具有优势，因为它们能够防止 pH 值的变化以及分子培养凝胶水平的降低。在刺激生物组织时，电压和频率是需要考虑的重要变量。一方面，已有证据表明，细胞动态行为（如迁移、增殖、基因表达等）取决于所施加电压的强度。另一方面，已有研究证明，低频和高频信号对细胞具有影响，尤其是对细胞膜通道的开启和关闭，可触发细胞外和细胞内的不同信号通路。总体而言，此类装置可推广应用于临床环境，以改善再生治疗，例如细胞替代植入治疗。这类治疗结合了体外与体内技术，用于组织再生。在此，电刺激和磁刺激装置可通过改善细胞、组织和支架在植入患者体内之前的细胞和分子特性，在生物材料的刺激中发挥关键作用。

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科研

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生物工程

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