阿拉伯多普西斯局部和系统伤口信号的广域实时成像

细胞外谷氨酸触发的全身钙信号对于植物防御对植物机械伤害和食草动物攻击的反应至关重要。本文描述了一种使用 阿拉伯多普西斯塔利亚纳 植物表达钙和谷氨酸敏感荧光生物传感器来可视化这两种因素的空间和时间动力学的方法。

该协议允许全厂范围内通过监测钙和可塑性谷氨酸的动态来实时成像植物系统的活动，以应对伤害。这种全厂实时成像方法提供了一个强大的工具，用于了解植物中快速和远距离信号的动态，结合了高空间时间分辨率和易用性。该协议提供了潜力，提供一个新的见解的空间和时间特征的系统钙信号在生物和非生物应激反应在其他植物物种。

证明这个程序的将是来自我实验室的博士后研究员大村大谷。首先打开配备 1 倍目标镜头和 sCMOS 摄像头的电动荧光立体显微镜。配置设备设置，以以 470 纳米为中心的激发光进行辐照，使用传输 450 至 490 纳米之间的光线的滤光片进行选择。

使用传输 510 至 560 纳米的滤光片获取发射灯。从包含植物的盘子中取出盖子，放在客观的透镜下。检查工厂的荧光信号。

然后在黑暗中等待大约30分钟，直到植物适应新的环境条件。调整焦点和放大倍数，查看整个工厂的视野。然后设置采集参数，使用显微镜成像软件检测荧光信号。

将录制时间设置为 11 分钟。在开始实验之前，图像为五分钟，以适应从显微镜照射到蓝光照射的植物，然后开始记录。在伤害或谷氨酸应用之前，确定至少 10 帧的平均基线荧光记录。

对于伤口诱导的细胞酸钙离子和孢子质谷氨酸浓度变化的实时成像，用剪刀切割叶L1的皮毛或中间区域。要实时成像谷氨酸触发细胞钙的变化，用剪刀从叶子 L1 尖端切开约一毫米。至少20分钟后，将10微升100毫升谷氨酸涂抹在叶子的切口表面。

对于荧光强度分析，定义在要分析荧光强度的地方感兴趣的区域。为钙波的速度计算定义两个投资回报率。在成像软件中，点击时间测量、定义和圆圈。

通过单击注释和测量、长度和简单线来测量两个区域之间的距离。通过单击测量，然后将原始数据导出到电子表格软件，以在每个时间点将荧光信号转换为数字，从而测量每个投资回报率中的原始花粉值。通过计算记录数据中前 10 帧的平均 F，然后将文本手稿中描述的 F 数据正常化，确定基线荧光值（即为 F 0）。

对于钙速波分析，将高于预刺激值的重要信号上升点定义为表示检测每个投资回报率中钙的增加。计算两个投资回报率之间的钙增加时差和它们之间的距离，以确定任何钙波的速度。此处显示了细胞酸钙离子和可塑性谷氨酸浓度的伤口触发变化的传播。

在表达GCaMP-3的植物中切割叶子的颗粒导致钙含量显著增加。它是在当地诱导的，然后蔓延到整个血管。信号在几分钟内迅速传到邻近的树叶上。

在切开一片叶子和植物表达基本的辣椒酶I胶水嗅探器时，观察到切口周围有快速的可塑性谷氨酸增加。在几分钟内，信号也通过血管传播。对于谷氨酸应用触发的钙信号传播的实时成像，在表达 CCaMP-3 的植物中，叶的边缘被切断。

这导致局部细胞酸钙离子浓度增加，但信号在几分钟内消失。大约10分钟后，谷氨酸被涂在切口表面，导致细胞酸钙浓度迅速局部增加，然后将此信号传播到散叶。为了测量系统叶中伤痕引起的固体钙浓度内的变化，在两个感兴趣的区域测量了GCaMP-3信号强度的时间过程变化。

还测量了针对机械损伤的可塑性谷氨酸浓度变化。谷氨酸签名在受伤后约100秒出现单峰。这项实验应在温度和湿度控制条件下进行，因为这种环境条件的变化会使实验升高。

该协议提供了一个潜在的，通过使用变异体，实验室信号系统的缺陷和假定元素，提供对远距离信号背后的分子机制的见解。