通过等密度梯度纯化对U937细胞进行细胞组分分离

本方案具有重要意义，因为它提供了一种将四种细胞区室——细胞质、细胞核、线粒体和细胞膜——相互分离的方法。不仅如此，该方法还是一种可扩展、可重复且结果可靠的实验流程。该技术的主要优势在于能够在极少使用去垢剂的情况下实现四种细胞区室的分离，从而获得更高可重复性和更可靠的细胞组分分离效果。

进行胞质蛋白分离时，将U937细胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，于37°C及5%二氧化碳条件下培养，最终获得总计6 × 10⁸个细胞。离心培养物后，将细胞沉淀用室温PBS重悬，终浓度为4 × 10⁶个细胞/毫升，轻轻吹打以充分分散细胞团块。再次离心后，将沉淀用预冷的裂解缓冲液A重悬，终浓度为2 × 10⁷个细胞/毫升。

取7.5毫升细胞加入预冷的锥形管中置于冰上，用于后续核蛋白提取；其余细胞通过离心形成沉淀。将沉淀重悬于细胞质分离缓冲液中，终浓度为每毫升2×10⁷个细胞，轻轻吹打以分散细胞团块，然后在4°C下以翻转旋转方式孵育20分钟。孵育结束后，离心细胞悬液，并将上清液转移至洁净的离心管中。

离心上清液以沉淀细胞碎片。离心后，将上清液转移至新的离心管中，并重复离心步骤，直至观察不到沉淀物。当样品中无可见碎片时，将含有胞质组分的上清液于4°C保存，可保存长达一个月。

然后将储存的细胞沉淀重悬于裂解缓冲液A中，调整终浓度为每毫升4×10⁶个细胞。进行细胞匀浆时，离心细胞悬液并弃去上清液，以去除过量的皂苷和收缩期污染物。将沉淀物重悬于预冷的细胞匀浆缓冲液中，终浓度为每毫升4×10⁶个细胞，在冰上孵育30分钟。

同时，对于基于珠子的机械裂解，将30克预清洗的3.2毫米不锈钢珠加入盛有15毫升裂解缓冲液B的50毫升带裙边管中，置于冰上预冷。孵育结束后，将带裙边管中的缓冲液替换为细胞悬液，并以速度8匀浆5分钟。裂解完成后，将匀浆液转移至洁净的离心管中。

离心匀浆液，然后将上清液转移至新管中。为去除样品中残留的任何碎片，按所示方法将匀浆液离心三次，每次离心后均将上清液转移至新管。最后一次离心后，为分离粗线粒体组分，将上清液转移至新管进行离心。

离心后，将上清液转移至新管中，并将含有粗线粒体组分的沉淀置于冰上。为分离膜组分，对收集的上清液进行离心，弃去上清液后将含有粗膜组分的沉淀置于冰上。进行等密度梯度纯化时，将粗线粒体组分和膜组分沉淀重悬于 200 微升裂解缓冲液 B 和 1.8 毫升碘克沙醇中。

为每个样本制备不连续碘克沙醇梯度时，首先在每个八毫升开口薄壁超速离心管底部加入一毫升15%碘克沙醇。接着，依次在每根离心管中将一毫升20%碘克沙醇、一毫升25%碘克沙醇、一毫升30%碘克沙醇和一毫升35%碘克沙醇叠加于15%碘克沙醇层下方。然后，在第一个梯度的最底层下方加入两毫升粗线粒体沉淀悬浮液，在第二个梯度的最底层下方加入两毫升粗膜沉淀悬浮液。

在每个梯度顶部小心地铺加1毫升10%碘克沙醇，并根据需要滴加10%碘克沙醇，使各离心管之间的重量差控制在10微克以内，随后通过密度梯度离心纯化线粒体和膜组分。分离结束后，用针头刺穿薄壁管侧面，收集各样品中可见的条带。对于核蛋白的分离，将悬浮于裂解缓冲液A中的7.5毫升细胞等分试样离心，并将沉淀物用移液器吹打并涡旋重悬于800微升冰浴细胞溶解缓冲液中。

将悬液置于冰上孵育30分钟，以破坏质膜和细胞器膜，同时保护核蛋白。孵育结束后，离心细胞悬液，并用800微升预冷的核裂解缓冲液轻轻吹打重悬沉淀，缓冲液中需添加1单位/微升的苯并核酸酶（Benzonase）。将混合物置于4°C的翻转旋转仪上孵育，以破坏核膜。

30分钟后，以20%的功率对混合物进行三次超声处理，每次5秒，脉冲之间间隔5秒，以剪切核酸。最后一次超声处理后，离心匀浆液，并收集上清液作为核组分，注意不要扰动沉淀。经密度梯度纯化后，各组分的Western blot结果显示，线粒体组分定位于25%和30%的碘克沙醇层，而膜组分定位于10%和15%的碘克沙醇层。

西方墨点分析还证实，每个分离样品均纯净，不含来自细胞其他部分的蛋白质污染。此外，对各样品条带强度进行的密度测定分析证实了数据的可重复性和统计学意义。若细胞组分分离操作不当，则可能导致细胞组分间的交叉污染。

例如，胞质组分中组蛋白 H3 浓度过高，可能是由于胞质组分澄清不充分所致。等密度梯度离心纯化步骤失败可能导致膜组分受到污染。在进行 Western 印迹分析之前，进行蛋白质定量检测可能非常有用，以确认各组分中确实含有蛋白质，从而根据蛋白质含量进行凝胶上样，并验证实验操作是否正确执行。

胞质组分中不得含有沉淀物。在此步骤之后，可进行蛋白质印迹（Western blots）或酶联免疫吸附测定（ELISAs），以分析在特定条件下不同蛋白质的亚细胞定位。该技术使我们能够在高血糖条件下分析不同细胞死亡因子的转运情况。

因此，这有助于我们阐明高血糖条件下细胞死亡方式从凋亡向坏死转变的机制。