Name: 自组装血管化人体皮肤等价物的生成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-12T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 了解如何利用可及技术生成具有血管化的人体皮肤等效物，用于长期培养和组织工程研究。该方法支持疾病、衰老及个性化医学领域的生物医学应用。

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作者感谢 Jim Rheinwald 博士59 和 Ellen H. van den Bogaard 博士20 慷慨惠赠 N/TERT 细胞系。本研究由美国心脏协会（19IPLOI34760636）提供资助。

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案展示了一种简单且可重复的血管类器官（VHSE）生成及其三维分析方法。该方法仅依赖少量专业技术和设备，因此适用于各类实验室。此外，通过有限的方案调整即可替换细胞类型，使研究人员能够根据自身需求灵活优化本实验流程。
正确的胶原蛋白凝胶化是建立皮肤培养过程中具有挑战性的步骤。尤其是使用未经纯化的粗制制剂时，痕量污染物可能会影响凝胶化过程。为确保实验的一致性，用于生成 VHSE 的实验组应使用同一批次的胶原蛋白储备液进行。此外，理想的凝胶化应在 pH 7–7.4 条件下进行，而痕量污染物可能导致 pH 值偏移。在使用任何胶原蛋白储备液之前，应先配制一份无细胞的凝胶样品，达到目标浓度后，在凝胶化前测量其 pH 值。在开始真皮组分接种前完成此项胶原蛋白质量检查，可提前发现凝胶化是否正常以及胶原蛋白是否均一等问题，避免在完整实验体系建立后出现问题。可将少量胶原蛋白直接滴加到能够检测全 pH 范围的 pH 试纸上，而非直接接种于培养插件上，以确认 pH 值处于 7–7.4 范围内。凝胶化效果可通过将胶原蛋白凝胶溶液滴加到盖玻片或组织培养用塑料孔板上进行评估（推荐使用孔板，以模拟培养插件的受限侧壁环境）。经过凝胶化时间后，胶原蛋白应呈固态，即当孔板倾斜时不会流动。在相差显微镜下观察，胶原蛋白应呈现均一且透明的外观。接种过程中偶尔出现的小气泡属于正常现象，但在透明凝胶内部若出现大块不透明的无定形团块，则提示存在问题，可能源于混合不充分、pH 值不当，和/或在混合过程中未能保持胶原蛋白处于低温状态。
细胞接种量和培养基可进行调整。在上述方案中，包埋细胞的数量已针对12孔插入式培养板进行了优化，每毫升胶原中包含7.5 × 104个成纤维细胞和7.5 × 105个内皮细胞，同时在真皮结构顶部接种1.7 × 105个角质形成细胞。该血管化人皮肤等效物（VHSE）方案中的细胞密度是基于前期研究以及既往关于不同胶原浓度下三维血管网络形成48和人皮肤等效物（HSE）构建22,80,81的研究结果优化确定的。在类似系统中，已发表的内皮细胞密度为1.0 × 106个细胞/mL胶原48；成纤维细胞浓度通常介于0.4 × 105个细胞/mL胶原22,28,82至1 × 105个细胞/mL胶原8,58,83,84,85之间；角质形成细胞浓度范围则为0.5 × 105 [个细胞/cm2]80至1 × 105 [个细胞/cm2]8。可根据特定细胞类型和研究问题进一步优化细胞密度。含有收缩性细胞（如成纤维细胞）的三维培养可能发生收缩，导致细胞活力下降甚至培养失败86,87。应开展预实验以检测真皮区室的收缩情况（该现象可能由更多真皮细胞、更强收缩活性的真皮细胞、更长的浸没培养时间或更软的基质引起），并评估表皮表面覆盖程度。此外，若出现明显的真皮收缩或需要不同的角质形成细胞覆盖速率，也可对浸没培养天数及血清浓度梯度降低速率进行个性化调整。例如，若在真皮浸没培养期间或角质形成细胞形成表面单层过程中观察到收缩现象，可加快血清梯度降低过程，并尽早将VHSE提升至气液界面（ALI）培养，有助于防止进一步收缩。同样地，若角质形成细胞覆盖不理想，调整无血清条件下VHSE浸没培养的天数可能有助于提高表皮单层覆盖度，并因去除血清而减轻收缩。上述细胞密度的调整或其他建议均需根据具体的培养体系和研究目标进行优化。
在气液界面（ALI）培养期间，为建立正常的表皮分层结构，必须定期检查并维持每孔中的液体水平，以确保在整个培养过程中维持气液界面状态及各构建物的适当水合状态。应每日检查并记录培养基液面，直至气液界面水平保持稳定。表皮层应呈现水润状态，而非干燥，但构建物表面不应有培养基积聚。在气液界面阶段，构建物将逐渐呈现正常的不透明乳白/黄色。表皮层的发育可能不均匀，常见情况包括：由于胶原接种或真皮层收缩，VHSE（全层皮肤等效物）出现倾斜。在较小规格的构建物（24孔板尺寸）中，常可见中央区域表皮层较高；而在12孔板尺寸的构建物中，常可见表皮在周边形成脊状结构。构建物的收缩13可能导致这些表面形态改变，或使上述现象完全不出现。
对VHSEs进行染色和成像会引入机械操作。规划并尽量减少对每份培养物的操作至关重要。当必须进行操作时，在将VHSEs从插入膜上取下、向构建物表面添加染色液或洗涤液，以及在成像准备过程中将VHSEs从储存/成像孔中取出和放回时，均应保持轻柔的操作动作。特别需要注意的是，表皮组分的顶端层可能较为脆弱，存在从基底表皮层脱落的风险。即使在天然组织中，表皮的顶端层也较为脆弱并会发生脱屑现象4，但为了准确分析表皮结构，应尽量减少损伤或丢失。如果表皮层从构建物上剥离，可将其单独成像。通常基底表皮层仍附着在真皮层上，而部分顶端层可能发生脱离。为了观察表皮结构，使用细胞核染色有助于识别，因为细胞核密集是表皮中下层的特征。
本方案中已讨论了VHSE固定后的共聚焦成像，但也可在培养过程中通过基于直立显微镜的光学相干断层扫描（optical coherence tomography, OCT）对VHSE进行成像88,89,90,91,92,93。VHSE具有足够的稳定性，可在无需孵育或加湿的条件下持续成像至少两小时，且无明显影响。由于OCT无需标记且具有非侵入性，因此可在成熟过程中连续监测表皮厚度。其他非侵入性成像方式也可能适用。
由于激光在VHSE深层发生衰减，对真皮和表皮结构进行整体成像可能具有挑战性。可通过从两个方向对构建物进行成像来缓解这一问题：从表皮侧（图1）和从真皮侧（图2），从而实现对真皮血管结构和表皮的良好分辨率。此外，可对样本进行透明化处理，以实现对整个结构的容积成像，并将信号衰减降至最低。尽管尝试了多种透明化方法，但采用甲醇/水杨酸甲酯法所获得的结果最佳。希望优化其他透明化方法的研究人员可参考以下综述49,61,62。若进行透明化处理，建议在处理前先对样本进行完整的成像，因为该方法可能损伤荧光团和/或组织结构。此外，透明化后应尽快完成成像，因为荧光可能在数天内逐渐减弱。
为简便性和可及性起见，本方案采用了先前文献中报道的最简单的培养基混合物11,80。尽管使用简单培养基混合物具有诸多优势，但该选择的局限性也应被充分认识。其他研究团队已探讨了特定培养基组分对表皮和真皮健康的影响，并发现其他培养基添加剂94（如外源性游离脂肪酸/脂质）可增强表皮角质层并改善皮肤屏障功能。尽管我们的免疫荧光标记显示表皮具有适当的分化和分层结构，但根据具体研究目的的不同，可能仍需进一步优化培养基。此外，在评估本文所呈现的血管化皮肤等效物（VHSEs）时，尚未对表皮基底膜（BM）进行深入分析。BM的完整性是评价皮肤等效物的重要指标；多个研究团队已对培养时长及其对BM标志物的影响95，以及成纤维细胞的存在和添加生长因子对BM表达的影响进行了研究14。值得注意的是，在使用本方案时，应对BM组分进行评估和优化。
本方案描述了一种生成 VHSE 的操作流程，并展示了在气液界面（ALI）培养 8 周后的结果。VHSE 培养物在 ALI 条件下已成功维持长达 12 周，未见明显变化或活力丧失，且其存活时间可能更长。重要的是，本方案可便捷地适配于常见的细胞类型，例如以 IMR90 肺成纤维细胞替代真皮成纤维细胞即为一例。根据研究者的需求和可用资源，可对培养体系中的细胞类型和培养基配方进行调整，但差异较大的细胞类型可能需要优化培养基条件。总之，这些操作步骤旨在为皮肤生物学与疾病研究中的 VHSE 培养提供清晰、可靠的指导。为最大限度提升可及性，本方案采用常见设备、细胞系和试剂，设计为一种简洁而稳健的最小有效方法，可进一步根据具体研究需求进行定制化调整。

人体皮肤具有多种重要的生物学功能，包括作为免疫/机械屏障、调节体温、参与水分保持以及感觉功能1,2,3,4。从解剖学角度看，皮肤是人体最大的器官，由三层主要结构（表皮、真皮和皮下组织）组成，并包含复杂的基质、血管、腺体以及免疫/神经系统成分，此外还有表皮细胞。表皮本身由四层细胞构成，这些细胞不断更新，以维持皮肤的屏障功能及其他天然结构（如汗腺、皮脂腺和指甲）3。皮肤生理学在免疫功能、伤口愈合、癌症生物学等领域具有重要意义，因此研究人员广泛采用多种模型，从体外单层培养到体内动物模型均有涉及。动物模型能够用于研究皮肤生理的全部复杂性，但常用动物模型（如小鼠）与人类相比存在显著的生理差异5。这些局限性以及动物模型日益增加的成本，促使许多研究人员致力于开发更贴近人类皮肤生理的体外模型1,6。其中一种较简单的模型类型为人表皮等效物（HEE；也称为半厚度皮肤模型），其结构仅包含位于无细胞真皮基质上的人表皮角质形成细胞，但可再现体内所见的表皮分化与分层现象。在此基础上，包含真皮和表皮成分（角质形成细胞和成纤维细胞）的模型通常被称为人皮肤等效物（HSE）、全厚度皮肤模型或类器官皮肤构建物（OSC）。简而言之，这些模型通过将真皮细胞包埋于凝胶基质中，并在其表面接种表皮细胞而构建。随后通过特殊培养基和空气暴露诱导实现表皮分化与分层7。皮肤等效物通常采用自组装技术构建，所用真皮凝胶主要为I型胶原（来源于大鼠尾部或牛皮）1,8，但也有类似模型引入了其他基质成分，如纤维蛋白9,10、成纤维细胞来源基质11,12、尸体来源去表皮膜13,14,15,16、市售凝胶及其他材料1,12,13,17,18,19。目前已有商业化的人工皮肤等效物产品（如先前综述所述1,2），但这些产品主要针对治疗用途开发，难以根据特定科研问题进行定制化调整。
HSE 已被应用于伤口愈合、移植、毒理学以及皮肤疾病/发育的研究中11,12,13,16,8,20,21,22,23。尽管与二维培养相比，三维培养能更全面地模拟人体组织的功能24，但引入更多样化的细胞类型以更准确地反映体内细胞群体，可实现对复杂组织中细胞间协调作用的研究24,25,26。目前大多数 HSE 仅包含真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞27，而体内&#160;皮肤环境还包括许多其他类型的细胞。近期研究已开始纳入更多细胞群体，包括血管中的内皮细胞10,28,29,30,31,32,33,34、皮下组织中的脂肪细胞35,36、神经组分19,21、干细胞27,37,38、免疫细胞10,39,40,41,42，以及其他疾病/癌症特异性模型16, 40, 43,44,45,46,47。其中尤为重要的是血管系统；尽管部分 HSE 包含血管细胞，但总体上仍缺乏贯穿整个真皮层的完整毛细血管结构10,29、长期的体外&#160;稳定性28以及适当的血管密度。此外，HSE 模型通常通过培养后的组织学切片进行评估，这限制了对 HSE 三维结构的分析。三维分析可实现对血管密度的体积评估48,49，以及对表皮厚度和分化程度区域差异的分析。
尽管HSE是常用的类器官模型之一，但在构建这些结构时仍存在诸多技术挑战，包括合适的细胞外基质和细胞密度的确定、培养基配方、正确的气液界面操作程序以及培养后的分析方法。此外，虽然已有HEE和HSE模型的发表方案，但目前尚无整合真皮血管系统并采用三维体积成像而非组织学分析的详细实验流程。本研究提供了一种易于实施的血管化人皮肤等效物（VHSE）培养方案，主要使用商业化细胞系。该方案设计为高度可定制化，便于根据不同细胞类型和研究需求进行直接调整。出于可及性、可获取性和成本考虑，本方案优先采用简单易得的产品和制备技术，而非依赖商业化的成品。此外，本文还描述了简便的三维体积成像与定量分析方法，可用于评估VHSE的三维结构。将该操作流程转化为一种可靠且易于推广的实验方案，可使非专业研究人员也能在个体化医学、血管化组织工程、移植材料开发及药物评价等领域应用这些重要的模型。

<table><tbody><tr><td>1 N NaOH</td><td>Fisher Chemical</td><td>S318-100</td><td>（从实验室储备液稀释）</td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛</td><td>ACROS Organics</td><td>#41678-5000，批号 # B0143461</td><td>使用 PBS 中的固体多聚甲醛配制，pH 调至 6.9</td></tr><tr><td>高压灭菌的镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>#11295-00</td><td>Dumont #5 镊子</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher 生物试剂</td><td>货号 BP510-250，批号 190231</td><td>RNase、DNase、蛋白酶无污染</td></tr><tr><td>细胞系，内皮细胞：微血管内皮细胞（HMEC1）</td><td>ATCC</td><td>CRL-3243</td><td>SV40 永生化微血管内皮细胞。注意，使用了每毫升 750,000 个细胞的胶原。</td></tr><tr><td>细胞系，成纤维细胞：成人皮肤人成纤维细胞</td><td>ATCC</td><td>PCS-201-012</td><td>原代真皮细胞。注意，胶原中使用了75,000 个细胞/mL。</td></tr><tr><td>细胞系，成纤维细胞：人肺成纤维细胞（IMR90）</td><td>ATCC</td><td>CCL-186</td><td>原代胚胎细胞。注意使用了75,000 个细胞/mL 的胶原蛋白。</td></tr><tr><td>细胞系，角质形成细胞：N/TERT-1</td><td></td><td></td><td>通过hTERT表达实现永生化。N/TERT-1细胞系使用携带潮霉素抗性基因的逆转录病毒载体构建。该细胞系由Dickson等人于2000年建立。可使用ATCC PCS-200-010或PCS-200-011替代。注意每种构建体使用170,000个细胞；必须使用汇合度为30%的培养皿中的N/TERT1细胞——两个90 mm、汇合度为30%的组织培养皿可提供足量细胞。作者感谢Jim Rheinwald博士和Ellen H. van den Bogaard博士慷慨惠赠N/TERT细胞系。</td></tr><tr><td>离心</td><td>赛默飞世尔科技；Sorvall Legend X1R</td><td></td><td>（标准实验设备）</td></tr><tr><td>计算软件</td><td>MATLAB</td><td>MATLAB 2020a</td><td>MathWorks，马萨诸塞州纳蒂克</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Leica TCS SPEII 共聚焦显微镜</td><td></td><td>激光扫描共聚焦显微镜。可替换为其他共聚焦显微镜或去卷积显微镜。</td></tr><tr><td>盖玻片（22 × 22）</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545F</td><td>0.13-0.17 mm 1号厚度</td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯超级胶水或硅脂</td><td>胶粘剂专家</td><td>#THI0102</td><td>Glue Masters，厚型，瞬干胶，氰基丙烯酸酯；推荐使用强力胶</td></tr><tr><td>DMEM 培养基基础液</td><td>康宁；美迪特克公司</td><td>货号 10-013-CM；批号 26119007</td><td>DMEM，1×（Dulbecco 改良 Eagle 培养基），含 4.5 g/L 葡萄糖、L-谷氨酰胺 &amp;& 磷酸盐缓冲液（含丙酮酸钠）</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 50/50</td><td>康宁；美迪特克公司</td><td>货号 10-090-CV；批号 21119006</td><td>DMEM/F-12 50/50，1×（Dulbecco改良Eagle培养基/Ham's F12 50/50混合液），含L-谷氨酰胺</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Decon Labs</td><td>#V1101</td><td>（标准实验室试剂）</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Fisher Scientific</td><td>货号 # FB12999102，批号 # AE29451050</td><td>研究级胎牛血清，三重0.1 μm无菌过滤</td></tr><tr><td>精细尖头镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>#11295-00</td><td>Dumont #5 镊子</td></tr><tr><td>人表皮生长因子（EGF）</td><td>Peprotech</td><td>货号 AF-100-15-1MG，批号 0318AFC05 D0218</td><td>用 PBS 中含 0.1% BSA 的溶液配制</td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>Alpha Easar</td><td>批号 # 5002F2A</td><td>用DMSO配制</td></tr><tr><td>胰岛素（人）</td><td>Peprotech</td><td>批号 # 9352621</td><td></td></tr><tr><td>倒置光学/相差显微镜</td><td>VWR</td><td>76317-470</td><td>（标准实验设备）</td></tr><tr><td>异丙肾上腺素</td><td>Alfa Aesar</td><td>#AAJ6178806</td><td>DL-异丙肾上腺素盐酸盐，98%</td></tr><tr><td>角质形成细胞-SFM（1x）培养基基础液</td><td>Gibco；Life Technologies 公司</td><td>货号：10724-011；批号：2085518</td><td>角质形成细胞无血清培养基（1X）；无血清培养基</td></tr><tr><td>L-抗坏血酸</td><td>Fisher Chemical</td><td>货号 A61-100，批号 181977，CAS 号 50-81-7</td><td>结晶状。L-抗坏血酸也可作为盐的形式购买</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（固体）</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>货号 # BP379-100，批号 # 172183，CAS # 56-85-9</td><td>L-谷氨酰胺，白色晶体或结晶性粉末</td></tr><tr><td>MCDB 131 培养基基础</td><td>Gen Depot</td><td>CM034-050，批号 # 03062021</td><td>MCDB 131 培养基基础，不含 L-谷氨酰胺，无菌过滤</td></tr><tr><td>金属打孔器</td><td>Sona Enterprises (SE)</td><td>791LP，12孔板</td><td>空心皮革打孔器套装，高碳钢，硬度：48HRC；（多种尺寸，包括）：1/8&quot;, 5/32&quot;, 3/16&quot;, 7/32&quot;, 1/4&quot;, 9/32&quot;, 5/16&quot;, 3/4&quot;, 7/16&quot;, 1/2&quot;, 5/8:, 3/4&quot;此打孔器套装很有帮助，但使用X-acto刀片也可达到类似效果。适用于12孔Transwell VHSE的金属打孔器理想尺寸为3/8英寸。&quot; 或 1/2&quot;.</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Chemical</td><td>CAS # 67-56-1</td><td>（可选）用于透明脱水步骤。</td></tr><tr><td>水杨酸甲酯</td><td>Fisher Chemical</td><td>O3695-500；批号 # 164535；CAS # 119-36-8</td><td>（可选）。用于透明化。</td></tr><tr><td>1.7 mL 微量离心管</td><td>Genesee Scientific Corporation；Olympus Plastics</td><td>货号 # 24-282；批号 # 19467</td><td>1.7 ml 微量离心管，透明；耐煮沸，聚丙烯材质，经认证无RNase、无DNase、无DNA、无PCR抑制剂且无内毒素</td></tr><tr><td>PBS，10倍浓度，细胞培养级或经高压灭菌</td><td>APEX Bioresearch Products</td><td>货号 # 20-134，批号 # 202237</td><td>PBS缓冲液，10倍浓缩干粉包；将整包内容物加入容器中，加水至1升，配制成10倍浓缩液。</td></tr><tr><td>PBS，1× 细胞培养级，无钙，无镁</td><td>Genesee Scientific Corporation</td><td>货号 # 25-508；批号 # 07171015</td><td></td></tr><tr><td>PBS，1× 非细胞培养级</td><td>APEX Bioresearch Products</td><td>货号 # 20-134，批号 # 202237</td><td>PBS缓冲液，10倍浓缩干粉包；将整包内容物加入容器中，加水至1升，配制成10倍浓缩液。使用时加水稀释至1倍工作浓度。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco；Life Technologies 公司</td><td>货号 # 15140-122，批号 # 2199839</td><td>青霉素-链霉素双抗溶液（10,000 单位/毫升 青霉素；10,000 微克/毫升 链霉素）</td></tr><tr><td>小玻璃培养皿</td><td>康宁</td><td>PYREX 316060</td><td>（可选）。用作透明化容器</td></tr><tr><td>培养皿，100 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>用于配制PDMS。</td></tr><tr><td>聚二甲基硅氧烷（PDMS）</td><td>道康宁</td><td>GMID 02065622，批号 H04719H035</td><td>Sylgard 184 硅弹性体基础剂，Dow Corning，Midland，MI</td></tr><tr><td></td><td>道康宁</td><td>GMID 02065622，批次号 H047JC4003</td><td>DOWSIL 184 硅酮弹性体固化剂</td></tr><tr><td colspan="4">注：聚二甲基硅氧烷（PDMS）通常以套件形式出售，包含基础剂和固化剂两种组分。</td></tr><tr><td>正向置换移液器（1000 &amp;& 250 μL</td><td>Gilson</td><td>1000 μL：HM05136，M1000；250 μL：T12269L</td><td>M1000 移液器量程（100–1000 μL）；M250 移液器量程至 250 μL</td></tr><tr><td>正向置换吸头/活塞（1000 &amp;& 250 μL</td><td>Gilson</td><td>1000 uL：货号 # F148180，批号 # B01292902S；250 uL：货号 # F148114，批号 # B05549718S</td><td>无菌毛细管和活塞</td></tr><tr><td>圆头刮勺</td><td></td><td></td><td>（可选；标准实验设备）用于成像前对VHSEs进行操作</td></tr><tr><td>角质形成细胞无血清培养基（Keratinocyte-SFM）添加剂</td><td>Gibco；Life Technologies 公司</td><td>货号 # 37000-015，批号 # 2154180</td><td>含人重组表皮生长因子（EGF，货号 # 10450-013）、牛垂体提取物（货号 # 13028-014）</td></tr><tr><td>组织培养板插件，12孔板规格，3个 &amp;micro;m 孔径大小</td><td>康宁；康斯特</td><td>货号 3462 - 澄清；批号 14919057</td><td>Transwell；12 mm 直径插件，3.0 μm 孔径，经组织培养处理，聚酯膜，聚苯乙烯板&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>12 孔组织培养板</td><td>Greiner Bio-one；CellStar</td><td>货号 # 665 180；批号 # E18103QT</td><td>12孔细胞培养板；无菌，带盖；产品无菌，无可见DNA酶、RNA酶、人类DNA和热原。内容物无细胞毒性</td></tr><tr><td>组织培养板，60.8 cm² 培养面积</td><td>Genesee Scientific Corporation</td><td>货号 # 25-202；批号：191218-177B</td><td>组织培养皿；经处理，生长面积 60.8 cm^2；无菌，无DNase、无RNase、无热原；本体聚苯乙烯</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>货号 # 8698.5-16，批号 # 4708R34</td><td>润湿剂</td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶</td><td>康宁；美迪特公司</td><td>货号 # 25-053-CI</td><td>0.25% 胰蛋白酶，2.21 mM EDTA，1× 不含碳酸氢钠</td></tr><tr><td>从大鼠尾部分离的I型胶原蛋白</td><td>Pel-Freez 生物制品公司</td><td>56054-1</td><td>Sprauge-Dawley 大鼠尾可从 Pel-Freez 或其他供应商处购买冷冻品。可从大鼠尾腱中分离胶原蛋白。分离方案参考文献 [Cross et al., 2010; Rajan et al., 2007; Bornstein, 1958]。或者，也可从包括 Corning（目录号：354249）在内的供应商处购买高浓度大鼠尾胶原蛋白。</td></tr><tr><td>真空室，台式</td><td>Bel-Art</td><td>F42010-0000</td><td>（标准实验设备）</td></tr><tr><td>手持式精密刀具</td><td>X-Acto</td><td>X3311</td><td>（若已购买钢制打孔器，则可不使用X-Acto刀）</td></tr></tbody></table>

自组装血管化人皮肤等效物的生成

Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents

人皮肤等效物（HSEs）是组织工程构建物，用于模拟人类皮肤的表皮和真皮组分。这些模型已被用于研究皮肤发育、伤口愈合以及移植技术。目前许多HSEs仍缺乏血管系统，并且通常依赖培养后组织学切片进行分析，从而限制了对结构的三维体积评估。本文介绍了一种利用易得材料制备带血管化人皮肤等效物（VHSE）的简便方案，并进一步描述了对这些构建物进行三维成像与定量分析的技术。简言之，VHSE在12孔培养插入式小室中构建，将真皮和表皮细胞接种于大鼠尾部I型胶原凝胶中。真皮层由分散在胶原凝胶中的成纤维细胞和内皮细胞组成；表皮层则由角质形成细胞（皮肤上皮细胞）构成，其在气-液界面处发生分化。重要的是，该方法可根据研究人员的需求进行定制，实验结果展示了使用两种不同类型成纤维细胞构建VHSE的情况：人真皮成纤维细胞（hDF）和人肺成纤维细胞（IMR90s）。VHSE在培养4周和8周时，通过共聚焦显微镜成像，并利用计算软件进行三维体积分析。本文还描述了一种优化的固定、染色、成像和透明化VHSE以实现三维观察的流程。该综合模型及其成像与分析技术可灵活适配各个实验室特定的研究需求，无论研究者是否具备HSE相关经验。

本实验方案的目的是描述利用简便且易于获取的技术，生成并进行血管化人皮肤等效物的长期培养及其体积分析。在尽可能的情况下，阐述了各步骤的设计原理，以便研究人员能够根据自身研究需求进行定制化调整。

人类皮肤等效物（HSEs）是通过组织工程技术构建的、用于模拟人类皮肤表皮和真皮组分的模型。这些模型已被用于……

本方案中提供的细节涉及人造人类皮肤模型的构建，这一过程在技术上往往具有挑战性。本方案包含了新型的人造人类皮肤模型要素，例如血管系统和三维成像技术。该技术能够简便地构建出更接近体内真实组织的皮肤模型，可用于疾病、衰老以及个体化医学的研究。该方案中最困难的部分是浸没培养与气液界面培养之间的转换。可能需要进行数次尝试，才能优化出获得稳定结果所需的时机和培养基液量。首先，向一个低温的带盖离心管中加入 516 µL 培养基，并立即使用 1000 µL 正向置换移液器加入 375 µL 冷胶原蛋白。移除空的移液枪头，换用已准备好的250微升正向置换移液器进行混匀。混匀操作应快速但轻柔，以防止产生过多气泡。保持枪头浸没在溶液中，从管子的不同位置均匀混匀，直至溶液颜色均一，通常需要约五个移液循环或10秒钟。立即在12孔培养插件的膜上分散125微升无细胞胶原蛋白。为确保覆盖均匀，倾斜培养板，并用移液枪头轻轻涂抹胶原蛋白以铺展至整个膜表面。立即将12孔板转移至37°C细胞培养孵育箱中，使其凝胶化至少20分钟。凝胶化时间结束后，将无细胞胶原的12孔板从培养箱中取出。从湿冰上取下1.7毫升带盖离心管，然后将储备胶原从冰箱中取出，并置于湿冰上，打开管盖。向冰冷的带盖离心管中加入516微升冷却的细胞悬液。使用1000微升移液器立即将375微升冷的胶原蛋白溶液直接移入盖紧的离心管内的溶液中。将移液器中的全部胶原蛋白排入管内，并丢弃正向置换移液器吸头。立即更换为250微升移液器并混匀胶原蛋白溶液。混匀后，将250微升细胞胶原蛋白溶液转移至12孔培养插件中的无细胞胶原蛋白支架上，然后将12孔板移至37°C细胞培养孵育箱中。30分钟凝胶时间结束后，轻轻倾斜培养板以评估凝胶情况，确保胶原蛋白已完全凝固。向插入物的上室和下室分别加入500微升和1000微升的混合培养基。确保胶原凝胶完全浸没在培养基中，必要时可补充更多培养基。将培养板放入细胞培养箱中过夜培养。在浸没培养的第七天，使用手动移液器收集并弃去每个构建物孔的底部和顶部腔室中的培养基。为收集滞留在可渗透膜正下方的培养基，可将移液器吸头插入膜下方，并暂时将插入物移位。向每个孔的下室加入1毫升人皮肤等效物（HSE）培养基，培养基中添加5%FPS，同时向上室加入200微升细胞悬液。将角质形成细胞直接接种到真皮结构表面，并在培养箱中静置2小时使其沉降。接种角质形成细胞2小时后，小心向上室每个构建物孔中加入300微升HSE培养基，培养基中添加5%FPS。加入培养基后，将培养物放回培养箱中。使用手动移液器，仅从上室移除废培养基，使每个培养物升至气液界面（ALI）。操作时应尽量接近表皮层，但避免接触或损伤该层。将培养板以不同角度轻微倾斜以收集培养基，然后向孔板周围的孔中加入约 2 毫升无菌水，以维持一致的湿度。数小时后检查孔板，确保角质形成细胞仍处于气液界面（ALI）状态。移除上室中的任何培养基，并记录从每个孔中移除的培养基体积。表皮层应呈现水合状态，而非干燥，但不应有培养基积聚在构建物表面。为进行免疫荧光染色，将小室倒置并放回其在培养板中的对应孔上。用一只手固定小室，同时使用尖头镊子或精密刀片切割膜约一半周长。尽可能贴近塑料外壳处进行切割。使用尖头镊子夹住切割后膜瓣的边缘，轻柔地将多孔膜从插入物以及VHSE构建物上剥离。若构建物卡在培养 chamber 侧壁，可使用尖头镊子或小刮勺将其移至孔中。将VHSE放入孔中后，弃去插入膜的任何残留部分，并在每个孔中保留培养插件外壳，以便在染色过程中使VHSE保持浸没状态。成像前两天，准备聚二甲基硅氧烷（PDMS）。将洁净的混合容器置于天平上，归零称量。加入基础剂，然后加入交联剂。剧烈搅拌溶液至少四分钟，产生细小气泡。充分混合后，将PDMS倒入90或100毫米的培养皿中。将PDMS置于真空室中脱气，直至所有气泡消失且PDMS变得透明。缓慢释放真空，取出PDMS。将培养皿放入烘箱中，在50至60摄氏度下固化过夜，并确保培养皿放置平稳，以使PDMS均匀固化。成像前一日，使用钢制打孔器或手持式精密刀具从PDMS片材上 punched 或切割出一个圆形孔洞，其大小应与VHSE构建体大致相同。在圆形孔洞周围切割出一个方形区域，以形成单个PDMS孔。取一片与PDMS孔大小相近的玻璃盖玻片，将氰基丙烯酸酯胶水滴加至PDMS底部表面，并用一次性移液枪头均匀涂抹。将玻璃居中放置，并按压到PDMS小室上，确保打孔圆圈内留出清晰的玻璃窗口。使用前让胶水过夜干燥。对表皮和真皮的表征显示，VHSE构建物中存在适合的人类皮肤免疫荧光标志物。细胞角蛋白10是一种早期分化角质形成细胞标志物，通常标记皮肤等效物中的所有颗粒层以上的上皮层。兜甲蛋白和丝聚合蛋白是角质形成细胞的晚期分化标志物，标记皮肤等效物中最表层的颗粒层以上上皮层。对VHSE进行透明化处理后，可在单一设置下实现清晰成像，无需重新调整构建物方向即可分别观察真皮层和表皮层。容积图像可生成三维重建图像，用于绘制每个结构中血管系统的分布图。将图像序列导入计算软件，并使用自定义算法进行三维重建与定量分析。通过骨架化确定每条胶原蛋白IV标记血管的明确中心，所得数据用于计算血管直径以及血管分数。通过该方案，可进行屏障分析、扫描电子显微镜观察、脂质谱分析等多种表征方法，以深入理解血管系统如何特异性影响表皮的成熟与稳定性。本方案可在血管化皮肤模型中实现与组织相关且细胞类型特异性的研究，尤其适用于衰老及个体化医学领域的研究。

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生物工程

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