Name: 真菌形态、环形和味觉味蕾的全镶嵌染色、可视化和分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: 学习全镶嵌解剖技术用于分析小鼠舌上皮中的真菌形态、环形和味觉味蕾结构。该方法可精确测量细胞数量与神经支配体积，揭示味蕾细胞与神经纤维的空间关系，为研究味觉神经回路及味觉障碍提供可靠工具。

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感谢Kavisca Kuruparanantha在轮廓乳头味蕾组织染色及成像方面的贡献，Jennifer Xu在乳头神经支配染色与成像方面的工作，Kaytee Horn在动物饲养和基因分型方面的协助，以及Liqun Ma在软腭味蕾组织染色中的工作。本项目得到了R21 DC014857和R01 DC007176（资助对象：R.F.K.）以及F31 DC017660（资助对象：L.O.）的资助。

注意：所有动物的饲养和护理均遵循美国卫生与公共服务部发布的《实验动物人道护理和使用政策》以及《美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南》中的规定。Phox2b-Cre 小鼠（MMRRC 品系 034613-UCD，NP91Gsat/Mmcd）或 TrkBCreER 小鼠（Ntrk2tm3.1(cre/ERT2)Ddg）与 tdTomato 报告基因小鼠（Ai14）进行杂交。AdvillinCreER47 与 Phox2b-flpo48 及 Ai65 小鼠进行杂交。对于 5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）注射，EdU 的配制和剂量计算参照 Perea-Martinez 等人49 的方法进行。
1. 材料准备
<ol>
	<li>溶液的配制
	<ol>
		<li>在搅拌器上，将5.244 g一水磷酸二氢钠和23.004 g磷酸氢二钠溶解于双蒸水（ddH2O）中。调节pH至7.4，并定容至1 L，得到0.2 M磷酸盐缓冲液（PB）。</li>
		<li>在通风橱中，将多聚甲醛加入双蒸水（ddH2O）中，在搅拌器上加热并持续搅拌，直至溶液温度达到90 °C。逐滴加入4 M NaOH溶液以溶解多聚甲醛，然后使用带滤纸的抽滤漏斗和陶瓷滤器进行过滤。加入等体积的0.2 M PB，并调节pH至7.4，得到含4% PFA的0.1 M PB溶液。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 组织制备
<ol>
	<li>组织采集
	<ol>
		<li>使用含10 mL无菌生理盐水和0.25 mL储存液（含5 g 2,2,2-三溴乙醇和5 mL叔戊醇）的工作溶液过量麻醉处死小鼠。用0.1 M磷酸缓冲液（PB）中含4%多聚甲醛（PFA）进行经心灌注；取出舌头和腭部。</li>
		<li>在间磨牙隆起后方进行冠状切口，分离舌后部以分离轮廓沟味蕾；用剃刀片切下味蕾；随后沿中线将舌前部纵向剖开。在0.1 M PB中加入4%多聚甲醛，4 °C条件下后固定过夜。</li>
		<li>在4 °C下用30%蔗糖溶液对组织进行过夜冷冻保护处理。 
		&#8203;注意：如果需要在此暂停实验流程，可将组织置于干冰冷却的烧杯中的异戊烷（2-methylbutane）内，用最佳切割温度（OCT）包埋剂进行速冻，并于 -80 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>菌状味蕾
	<ol>
		<li>将2-甲基丁烷置于烧杯中，并在干冰上冷却，以备步骤2.2.8使用。</li>
		<li>解冻舌组织并用0.1 M磷酸缓冲液冲洗。将包含菌状乳头的舌前部一半置于解剖显微镜下的载玻片上。</li>
		<li>使用钝头镊子和解剖剪去除肌肉组织。用钝头镊子将组织撑开，因为舌部上皮呈弯曲状，操作时应保持粗解剖剪的刀片与上皮平行，以确保组织处于平坦位置。</li>
		<li>弃去舌的腹侧非角化上皮，因其不含味蕾。</li>
		<li>使用精细解剖剪在角化上皮下层进行更贴近的解剖操作。 
		&#8203;注意：解剖时应尽量靠近上皮层，以确保残留的肌肉层厚度均匀，表面平滑，从而保证抗体均匀渗透。若残留肌肉层厚度不均，会导致冷冻切片时切面不平整，在肌肉较薄的区域可能暴露上皮，而在其他区域肌肉层较厚，从而阻碍抗体的渗透。</li>
		<li>使用平头镊子将一块上皮组织放入组织模具中（肌肉面朝下），并确保其平铺展开。待组织完全展平后，向组织上滴加一滴OCT包埋剂。 
		&#8203;注意：由于舌尖呈弯曲状，可能需要在上皮组织弯曲处做切口，以便使组织展平。</li>
		<li>将组织模具置于解剖显微镜下预冷于干冰中的金属底座上。继续用镊子轻轻敲击组织，直至OCT完全冻结，以确保组织尽可能平整地冻结。</li>
		<li>OCT冻结后，迅速添加更多OCT，并将模具置于盛有2-甲基丁烷（用干冰冷却）的烧杯中，直至完全冻结。</li>
		<li>冷冻切片 
		注意：冷冻切片机用于精细去除残留的皮下组织，这些组织可能阻碍抗体的渗透（图1).
		<ol>
			<li>将OCT模具安装到冷冻切片机上，切取20 µm厚的切片。逐片收集切片，并在光学显微镜下观察，以评估其与上皮基底的接近程度（图1E - H).</li>
			<li>将组织从上皮下表面刮取后，解冻上皮，并在摇床中用 0.1 M PB 溶液冲洗两次。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>环沟味蕾
	<ol>
		<li>使用剃刀进行冠状切面切割，将轮廓乳头与舌前部分离。在解剖显微镜下，用同一把剃刀进行两次旁矢状切面切割，去除乳头外侧的组织。用镊子将乳头置于组织包埋模中，使轮廓乳头的一侧边缘朝向包埋模底部。 
		注意：如果需要在此处暂停操作，可将组织置于干冰冷却的烧杯中的2-甲基丁烷内用OCT包埋并冷冻，随后在-80 °C保存。</li>
		<li>在冷冻切片机上将组织切成90 μm的漂浮切片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>腭部的味蕾
	<ol>
		<li>在硬腭与软腭交界处前方切断硬腭图2). 用剪刀将软腭与下方组织分离，确保切除任何残留的骨碎片。去除多余的肌肉和结缔组织。 
		注意：一旦去除，所剩的所有组织将由腺体和疏松结缔组织构成，这些组织轻微附着于腭的腹侧表面。</li>
		<li>用钝头镊子夹住腭部，用刀片轻轻刮除剩余的腺体和疏松结缔组织。 
		注意：如果需要在此暂停实验流程，可将组织置于干冰冷却的烧杯中用预冷的2-甲基丁烷快速冷冻，然后包埋于OCT中，并在-80 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 免疫组织化学染色
<ol>
	<li>用 0.1 M 磷酸缓冲液（PB）清洗组织，每次 15 分钟，共洗 3 次。将组织置于含有封闭液（3% 驴血清、0.5% 非离子型表面活性剂（参见材料表）、0.1 M PB）的 1 mL 管中，4 °C 条件下孵育过夜。</li>
	<li>去除封闭液，加入一抗（兔抗 PCLβ2）溶于抗体稀释液（0.1 M PB、0.5% 非离子型表面活性剂）中，4 °C 条件下孵育 5 天。</li>
	<li>用 0.1 M PB 洗涤，每次 15 分钟，共洗 4 次；然后加入二抗（驴抗兔 IgG 488，1:500）溶于抗体稀释液中，4 °C 条件下孵育 2 天。</li>
	<li>用 0.1 M PB 洗涤，每次 15 分钟，共洗 4 次；然后用含 5% 正常兔血清的抗体稀释液进行封闭。</li>
	<li>用 0.1 M PB 洗涤，每次 15 分钟，共洗 4 次。加入驴抗兔封闭抗体（20 µg/mL）溶于抗体稀释液中，4 °C 条件下孵育 2 天。</li>
	<li>用 0.1 M PB 洗涤，每次 15 分钟，共洗 4 次；然后加入与荧光标记物偶联的一抗 dsRed（兔源）溶于抗体稀释液中（按照制造商说明操作），4 °C 条件下孵育 5 天。</li>
	<li>用 0.1 M PB 洗涤，每次 15 分钟，共洗 4 次；然后加入一抗（山羊抗 Car4，1:500）溶于抗体稀释液中，4 °C 条件下孵育 5 天。</li>
	<li>用 0.1 M PB 洗涤，每次 15 分钟，共洗 4 次；然后加入二抗（驴抗山羊 IgG 647，1:500）溶于抗体稀释液中，4 °C 条件下孵育 2 天。</li>
	<li>用 0.1 M PB 洗涤，每次 15 分钟，共洗 4 次；然后将组织切片（上皮面朝上）封片于水性封片剂中，并覆盖盖玻片。 
	&#8203;注意：若使用来自不同物种的抗体（如仅在角蛋白-8 与 dsRed 的情况下），请在步骤 3.2 中将所有一抗加入抗体稀释液，在步骤 3.3 中将所有二抗加入抗体稀释液，然后再进行步骤 3.9。</li>
</ol>
4. 共聚焦成像与去卷积
<ol>
	<li>使用共聚焦显微镜，配备60倍物镜（数值孔径=1.40）、4 ms/像素、放大倍数为3、Kalman值为2、图像尺寸为1024 × 1024，采集共聚焦图像。沿z轴选择0.47 µm的步长。若放大倍数为3时视野过窄，无法完整捕获乳头区域的所有神经支配，则可采用2.5倍放大倍数来采集乳头神经支配图像。</li>
	<li>进行图像去卷积时，需注意部分设置将随图像自动导入；因此，请补充填写成像模式、物镜、数值孔径、浸没介质、样品介质以及图像中所采集的荧光染料等参数，然后选择3D去卷积。</li>
</ol>
5. 图像分析
<ol>
	<li>味蕾及其神经支配体积
	<ol>
		<li>将反卷积后的图像堆栈导入基于像素的图像分析软件（参见材料表），以确定味蕾体积以及味蕾内总神经支配的体积。
		<ol>
			<li>在主对象菜单中取消勾选体积。</li>
			<li>从对象菜单中选择添加新表面。选择跳过自动创建，手动编辑，然后选择轮廓。</li>
			<li>点击选择，观察出现的+形箭头，以帮助勾勒味蕾边界。移动切片器，并在每个光学切片中描绘味蕾轮廓。完成所有轮廓后，点击创建表面。</li>
			<li>观察主对象菜单中出现的味蕾体积对象。在工具下查找味蕾的体积数值。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>味蕾内部的神经支配体积
		<ol>
			<li>在味蕾对象下方选择铅笔图标，然后选择全部遮罩。</li>
			<li>在下拉菜单中选择与神经纤维标记相对应的荧光通道。勾选创建副本通道。</li>
			<li>勾选将表面外的体素设置为：，并在输入框中键入0。</li>
			<li>观察在显示调整窗口中出现的新通道，该通道是味蕾区域内所选荧光通道的未修改副本。</li>
			<li>在主对象菜单中选择创建新表面。取消勾选跳过自动创建，手动编辑。</li>
			<li>点击蓝色箭头两次，进入下一步。</li>
			<li>点击删除，然后点击绿色双箭头完成表面构建，该表面代表味蕾内神经纤维的体积。要获取体积数值，请在神经纤维对象菜单下的工具中选择体积，并从下拉菜单中选择相应选项。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>乳头的神经支配体积
		<ol>
			<li>按照第5.1节所述方法创建味蕾的体积。</li>
			<li>在味蕾对象下方选择铅笔图标，然后选择全部遮罩。</li>
			<li>在下拉菜单中选择与神经纤维标记相对应的荧光通道。勾选创建副本通道。</li>
			<li>勾选将表面内的体素设置为：，并在输入框中键入0。点击确定。</li>
			<li>通过点击添加新表面生成一个表面。选择仅分割感兴趣区域。</li>
			<li>点击蓝色箭头，增加Z值，使感兴趣区域从味蕾基部开始。</li>
			<li>点击蓝色箭头两次，进入下一步。</li>
			<li>点击删除，然后点击绿色双箭头完成表面构建，该表面代表乳头神经支配的体积。要获取体积数值，请在神经纤维对象菜单下的工具中选择体积，并从下拉菜单中选择相应选项。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>终末分支接触分析
		<ol>
			<li>图像准备
			<ol>
				<li>进入编辑菜单并选择三维裁剪。从各个方向裁剪图像，移除味蕾外部的空间。 
				注：裁剪时应尽可能贴近味蕾，但不得移除任何相关结构；任何多余的图像都会延长处理时间。</li>
				<li>从主菜单选择编辑，点击更改数据类型。在下拉菜单中选择转换为：32位浮点数。</li>
				<li>从对象菜单中选择添加新表面。点击跳过自动创建，手动编辑，选择轮廓，然后向右拖动切片位置以确定光学切片的总数。</li>
				<li>生成各向同性体素，确保体素不再是X×Y×Z分别为0.0691 × 0.0691 × 0.474的矩形，而是通过将原始矩形体素分割为具有相同荧光强度值的立方体，使体素变为0.0691 × 0.0691 × 0.0691。选择图像属性，然后将体素大小的Z值除以X或Y值（= 0.474 / 0.0691），并将该结果乘以上一步中获得的切片数（光学切片数）。</li>
				<li>返回主菜单中的编辑，选择三维重采样。</li>
				<li>用新计算出的数值替换Z值（切片数量）。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>基于荧光信号自动生成表面
			<ol>
				<li>再次点击添加新表面以添加新表面，取消选择仅分割感兴趣区域，然后点击下一步。</li>
				<li>从源通道下拉菜单中选择其中一个味觉转导&#160;细胞类型的通道。取消勾选平滑，继续下一步。</li>
				<li>在下一个显示图像中荧光强度范围的屏幕上，不要进行任何修改。再次点击底部的蓝色箭头进入下一步。</li>
				<li>点击删除，然后点击绿色双箭头完成表面构建。</li>
				<li>转到屏幕左侧的对象菜单，已完成的细胞表面将在此处显示，通常被命名为类似表面2的通用名称。双击表面名称，根据标签所代表的内容为其命名。 
				注：在此情况下，生成的表面基于PLCß2标记的&#160;细胞。</li>
				<li>如果显示的是点而非表面，请在左下角菜单中点击表面而非中心点，然后在提示时点击确定。</li>
				<li>对其他味觉转导细胞标记物和神经纤维标记物重复步骤5.3.2.1–5.3.2.5。</li>
				<li>保存（导出）当前进度。</li>
				<li>在主菜单中点击一种细胞类型的表面。从该对象的菜单中点击工具，然后点击距离变换。</li>
				<li>等待名为XTDistanceTransformation的弹出窗口出现。选择表面对象外部。注意在显示调整菜单中出现的新通道，其名称为距表面名称的距离。</li>
				<li>从对象菜单中选择神经纤维表面。点击铅笔图标，然后点击全部遮罩。</li>
				<li>从出现的下拉菜单中选择新通道距表面名称的距离。注意在显示调整窗口中出现的新通道，其名称为遮罩后的距表面名称的距离。</li>
				<li>使用主对象菜单创建一个新对象。取消选择仅分割感兴趣区域，点击蓝色箭头。选择遮罩后的距PLCß2的距离通道，并取消勾选平滑。</li>
				<li>在下一个屏幕上，检查是否存在味觉转导细胞与神经纤维之间的距离小于此软件可分辨的最小距离的区域。为此，设置0.01–0.11 µm的阈值，以检测是否有受体细胞荧光信号接近神经纤维至此距离范围内。</li>
				<li>在左侧绿色框中输入0.01以设置下限阈值，按Tab键。然后点击红色按钮并输入0.11以设置上限阈值。按Tab键，然后点击底部的蓝色箭头进入下一步。</li>
				<li>点击删除，然后点击绿色双箭头完成操作。</li>
				<li>在对象菜单中将此表面重命名为距PLCß2 0.01–0.11范围内。在对象菜单中选择距PLCß2 0.01–0.11范围内表面。</li>
				<li>点击铅笔，然后点击全部遮罩。从下拉菜单中选择红色（神经纤维）通道并点击确定。注意在显示调整窗口中出现的新通道，其名称为遮罩后的CHS2。</li>
				<li>点击通道名称；将其重命名为距PLCß2 0.01–0.11范围内。 
				注：这是一个荧光通道，表示在所创建表面内存在的红色荧光通道的副本。</li>
				<li>点击颜色选择器中间的白色区域。选择一种与结构颜色形成对比的颜色。</li>
				<li>在此阶段导出（即保存）文件。</li>
				<li>对其他味觉转导&#160;细胞标记物重复步骤5.4.2.9–5.4.2.21。</li>
				<li>在此阶段导出（即保存）文件。 
				注：若要分析一种标记细胞类型与另一种之间的接近程度，只需在步骤5.4.2.11（及后续步骤）中将神经纤维表面替换为目标对象，并相应调整后续各步骤中的对应组件即可。</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 神经元树突重建与绝对细胞数量定量
<ol>
	<li>末端分支追踪与分析
	<ol>
		<li>在基于3D矢量的图像分析软件中打开去卷积后的图像文件（参见材料表），选择追踪，点击神经元，然后点击树突。</li>
		<li>在图像序列中滚动至味蕾基部，一边滚动图像序列，一边将每根纤维追踪至末端。</li>
		<li>到达分支末端时，右键点击末端并选择终止点；在分支点处，右键点击并选择分叉节点。 
		注意：此操作可使程序识别对同一神经元的追踪——即先追踪一条分支至末端，再返回分叉点并追踪另一条分支。</li>
		<li>将数据文件保存为.DAT文件，随后可在基于3D矢量的图像分析软件中打开并进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 细胞数量定量
<ol>
	<li>只要能够在核水平上将用于标记转导细胞类型的特异性标记物固定在 z 位置，即可使用任何图像分析软件对标记的味蕾细胞进行定量分析。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

建立一种从口腔内三个味觉区域（菌状乳头、轮廓乳头和腭部）持续采集并染色完整味蕾的方法，显著改进了对味觉转导细胞的分析、新整合细胞的追踪、神经支配情况以及这些结构之间关系的研究。此外，该方法有助于定位潜在的次级神经元标志物，无论其位于标记细胞群内部或外部50。这一点尤为重要，因为味觉乳头同时还接受强烈的躯体感觉神经支配52,53，这可能导致部分味觉神经元也被标记。含有味蕾的乳头也可使用较低倍率进行成像，从而能够观察整个乳头及其味蕾的神经支配情况，并可独立分析穿透味蕾的神经纤维与周围神经纤维的分布。
皮肤中的躯体感觉神经末梢可根据其在毛囊周围的排列方式以及与其他上皮成分的关系进行区分；对味觉乳头进行类似的平行分析，可能获得相似的特征描述54,55。建立味蕾和乳头内部结构及其组成的正常基础，将为阐明外周味觉功...

味蕾是由50至100个特化的上皮细胞组成的结构，能够结合存在于口腔中的特定化学味觉刺激物。通常认为，味觉转导细胞可分为不同类型1,2,3,4,5,6,7,8,9，最初分类依据为电子显微镜下的形态特征，之后这些类型被与分子标记物相关联。II型细胞表达磷脂酶C-β2（PLCβ2）2和瞬时受体电位阳离子通道M亚家族成员51，包括负责转导甜味、苦味和鲜味的细胞1,10。III型细胞表达碳酸酐酶4（Car4）11和突触小泡相关蛋白258，主要响应酸味刺激11。介导咸味的细胞尚未被明确界定12,13,14，但可能涉及I型、II型&#160;和III型细胞15,16,17,18,19。由于味觉转导细胞在整个成年期持续更新，并由基底祖细胞不断替代，因此味蕾所处的微环境复杂且动态变化3,20,21。这些味觉转导细胞与来自膝状神经节和岩神经节的假单极神经纤维相连接，将味觉信息传递至脑干。这些神经元以往主要根据其所传递的味觉信息类型进行分类22,23，因为关于其形态学特征的信息直到最近才逐渐明确24。II型细胞通过钙稳态调节蛋白1离子通道与神经纤维通信25，而III型细胞则通过经典突触进行通信8,26。对味蕾细胞的进一步表征——包括转导细胞类型的谱系、影响其分化的因素以及连接神经树突的结构——目前仍是活跃的研究领域。
味蕾研究受到若干技术挑战的阻碍。构成舌头的异质且致密的组织显著降低了免疫组织化学中抗体的通透性27,28,29。这些障碍使得必须采用切片方案，导致味蕾被分割在不同切片中，因此测量值只能基于代表性切片进行估算，或通过多个切片的数据累加获得。以往，代表性薄切片曾被用于估算体积值和转导细胞数量30。连续厚切片则允许对所有味蕾切片进行成像，并将各切片的测量结果相加31。然而，切割较厚切片并仅选择完整味蕾的做法会使取样偏向于较小的味蕾32,33,34。来自切片味蕾的神经支配估算通常基于像素数量分析13,35，甚至在某些情况下并未进行量化36,37,38。这些测量方法完全忽略了单个神经树突的结构和数量，因为树突通常被切开且标记效果较差。最后，尽管剥离上皮层确实可使整个味蕾被染色39,40，但该方法同时会去除味蕾的神经纤维，并可能破坏细胞之间的正常关系。因此，由于染色方法本身造成的干扰，对味蕾内部结构关系的研究受到了限制。
整体结构采集消除了对代表性切片的需求，能够对体积、细胞数量和结构形态进行绝对值测量41。该方法还可提高准确性、减少偏差并降低技术变异性。最后一点尤为重要，因为味蕾在个体内部34，42以及不同区域之间43，44均表现出显著的生物学变异，而整体味蕾分析可实现对照条件与实验条件下绝对细胞数量的比较。此外，完整采集味蕾的能力使得分析不同感受细胞之间及其相关神经纤维之间的物理关系成为可能。由于味觉感受细胞之间可能存在相互通讯45，并且确实会与神经纤维进行通讯46，这些关系对于正常功能至关重要。因此，功能丧失可能并非由细胞丢失引起，而是源于细胞间关系的改变。本文提供了一种采集完整味蕾的方法，以实现绝对测量的优势，从而优化对味蕾及其神经支配的体积分析、味觉细胞的数量与形态分析，并促进对感受细胞间关系以及神经分支形态的分析。在此新型整体组织制备方法的基础上，还提供了两种后续工作流程：1）用于分析味蕾体积及总神经支配；2）用于稀疏细胞遗传标记味觉神经元（部分味觉感受细胞被标记），并进一步分析味觉神经分支的形态、味觉细胞类型的数量及其形态，并利用图像分析软件分析感受细胞之间的物理关系以及感受细胞与其神经分支之间的物理关系。上述工作流程共同为组织制备以及完整味蕾及其支配神经分支的完整形态分析提供了全新的方法。

<table><tbody><tr><td>2,2,2-三溴乙醇</td><td>ACROS Organics</td><td>AC421430100</td><td></td></tr><tr><td>2-甲基丁烷</td><td>ACROS</td><td>126470025</td><td></td></tr><tr><td>AffiniPure Fab 片段驴抗兔 IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-007-003</td><td>15.5&amp;mu;L/mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&amp;reg; 647 AffiniPure 驴抗大鼠 IgG</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>712-605-150</td><td>(1:500)</td></tr><tr><td>AutoQuant X3 软件</td><td>&amp;nbsp;Media Cybernetics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>钝头镊子</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>FST 91100-12</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT&amp;trade; Plus EdU 细胞增殖检测试剂盒</td><td>Molecular Probes</td><td>C10637</td><td>遵循试剂盒说明书&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Marienfeld</td><td>107242</td><td></td></tr><tr><td>细胞角蛋白-8</td><td>发育研究杂交瘤库 (DSHB), (RRID: AB_531826)&amp;nbsp;</td><td>Troma1 上清液</td><td>(1:50，4&amp;deg;C 保存)</td></tr><tr><td>解剖剪刀（粗齿）</td><td>Roboz</td><td>RS-5619</td><td></td></tr><tr><td>解剖剪刀（细齿）</td><td>Moria</td><td>MC19B</td><td></td></tr><tr><td>驴抗兔 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488 标记</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A21206</td><td>(1:500)</td></tr><tr><td>驴抗兔，Alexa Fluor&amp;reg; 555 标记</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A31572</td><td>(1:500)</td></tr><tr><td>DyLight&amp;trade; 405 AffiniPure Fab 片段牛抗山羊 IgG</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>805-477-008</td><td>(1:500)</td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Fisher Scientific (Superfrost Plus 显微载玻片)</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗 Car4</td><td>R&amp;D Systems&amp;nbsp;</td><td>AF2414</td><td>(1:500)</td></tr><tr><td>Imaris&amp;nbsp;</td><td>Bitplane&amp;nbsp;</td><td>基于像素的图像分析软件</td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida 360 + Explorer</td><td>MBF Biosciences</td><td>基于三维矢量的图像分析软件</td><td></td></tr><tr><td>正常驴血清</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>正常兔血清&amp;nbsp;</td><td>Equitech-Bio, Inc</td><td>SR30</td><td></td></tr><tr><td>Olympus FV1000</td><td></td><td>(多氩离子激光器，波长为 458、488、515，以及额外的 HeNe 激光器，发射波长为 543 和 633)</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>EMD</td><td>PX0055-3</td><td>0.1M 磷酸盐缓冲液中 4%</td></tr><tr><td>兔抗 dsRed</td><td>Living Colors DsRed 多克隆抗体；Clontech Clontech Laboratories, Inc. (632496)</td><td>632496</td><td>(1:500)</td></tr><tr><td>兔抗 PLC&amp;beta;2&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Cat# sc-206</td><td>(1:500)</td></tr><tr><td>无水磷酸氢二钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP330-500</td><td></td></tr><tr><td>叔戊醇</td><td>Aldrich Chemical Company</td><td>8.06193</td><td></td></tr><tr><td>组织包埋模具</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70180</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek&amp;reg;&amp;nbsp;O.C.T. 包埋剂</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>BIO-RAD</td><td>#161-0407</td><td></td></tr><tr><td>Zenon&amp;trade; Alexa Fluor&amp;trade; 555 兔 IgG 标记试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Z25305</td><td>遵循试剂盒说明书&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

完整组织染色、可视化及味蕾分析：菌状乳头、轮廓乳头与腭部味蕾

Whole-Mount Staining, Visualization, and Analysis of Fungiform, Circumvallate, and Palate Taste Buds

味蕾是由一系列特化的味觉转导细胞组成的结构，专门用于检测口腔内特定类别的化学刺激。这些转导细胞与神经纤维相连接，将信息传递至大脑。由于味觉转导细胞在整个成年期持续死亡并被更新，味蕾所处的微环境既复杂又动态，因此需要对其中的细胞类型、空间定位以及细胞间的物理关系进行细致分析。然而，舌组织的高度异质性和致密性严重限制了抗体的渗透，使得此类分析受到制约。这些技术障碍迫使研究者采用切片方法，导致味蕾被分割在不同切片中，从而使测量结果仅为近似值，且细胞间的空间关系丢失。为克服上述挑战，本文所述方法包括从三个味觉区域——菌状乳头、轮廓乳头和腭部——完整采集、成像并分析整个味蕾及单个终末树突结构。完整采集味蕾可减少偏差和技术变异性，可用于精确报告多种特征的绝对数值，包括味蕾体积、味蕾总支配神经量、转导细胞数量以及单个终末树突的形态学特征。为展示该方法的优势，本文利用通用的味蕾标记物及全味觉纤维标记物，比较了菌状乳头与轮廓乳头中味蕾及其神经支配的体积差异。此外，还提供了一种稀疏细胞遗传标记技术的工作流程，用于标记部分味觉神经元（同时标记特定亚群的味觉转导细胞）。该工作流程借助图像分析软件，分析单个味觉神经树突的结构、细胞类型的数量以及细胞之间的物理关系。上述方法共同构成了一种全新的组织制备与分析策略，可用于研究完整的味蕾结构及其支配神经树突的全部形态特征。

用抗dsRed和角蛋白-8（一种通用味蕾标记物）抗体对舌上皮进行染色，可在Phox2b-Cre:tdTomato小鼠中标记完整的味蕾及所有味蕾的神经支配50,51 (图 3A）。从味蕾的孔部到基部进行成像，可获得最高分辨率的 x-y 平面图像（图 3A，B）。使用基于像素的成像程序中的轮廓功能，勾画出每个切片中味蕾的周边轮廓。图3B），然后生成一个表面（图3C) 代表味蕾体积。仅在所创建的表面内对与味蕾标记相关的荧光进行掩蔽（或复制），从而生成一个新通道，该通道仅包含此荧光信号，并消除了可能遮蔽味蕾的乳头染色。图3D）。味蕾内的神经纤维荧光被遮蔽（图3...

本文介绍了对轮廓乳头、叶状乳头和腭部味蕾进行组织制备、染色及分析的方法，这些方法能够稳定地获得完整且结构完好的全器官味蕾（包括支配味蕾的神经纤维），并维持味蕾内部各结构之间以及味蕾与周围乳头组织之间的空间关系。

味蕾是由味觉转导细胞组成的结构，专门用于检测口腔中特定类别的化学刺激。这些转导细胞……

这种整体组织解剖与分析流程提供了一种新方法，用于分析单个味觉神经分支的完整形态、转导细胞类型的数量以及细胞之间的物理关系。通过采集整个舌上皮组织，我们能够测量整个味蕾内细胞的绝对数量以及神经支配的体积。该方法比基于组织切片取样对细胞结构进行估算更为准确，可降低技术变异带来的影响。这也是首个能够对味蕾细胞与其神经支配关系进行详细分析的方法。该方法可促进对味蕾内部潜在神经环路的研究，以及对破坏正常味觉功能的疾病过程和化疗手段的研究。在大多数情况下，尚不清楚具体是哪种结构或关系受到了破坏，因此保持所有这些因素的完整性，使得在单个样本制备中即可完成全部分析。最常见的错误是为了避免损伤上皮而没有充分贴近上皮下表面进行分离。在将组织放入组织包埋模中冷冻之前，必须尽可能去除更多的下方组织。同时，必须确保上皮平整地贴附在组织包埋模的底部。 首先将舌组织在0.1摩尔磷酸盐缓冲液中解冻并冲洗。然后取含有菌状乳头的舌前部的一半，置于解剖显微镜下的载玻片上。使用钝头镊子和解剖剪去除肌肉组织，并在舌上皮呈弯曲状时保持组织展开，通过使粗解剖剪的刀片与上皮平行，确保组织呈平坦方向。弃去舌腹侧无角化的上皮组织，因其不含味蕾。然后使用精细解剖剪进一步贴近角化上皮的下方进行解剖。用钝头镊子将一块上皮组织放入组织模具中，并确保其平铺无褶皱。然后在组织上添加一滴最佳切割温度化合物（OCT）。将组织模具置于解剖显微镜下预冷的金属底座上，继续用镊子轻轻敲击组织，直至 OCT 完全冻结，确保组织尽可能平整地冻结。一旦 OCT 完全冻结，迅速添加额外的 OCT，并将模具放入盛有冷却的2-甲基丁烷的烧杯中，直至完全冻结。将OCT模具安装在冷冻切片机上，切成20微米厚的切片。收集每一片切片，并在光学显微镜下观察，以评估其与上皮基底的接近程度。当组织从上皮下表面削除后，将上皮解冻，并在摇床上用0.1摩尔磷酸缓冲液冲洗两次。在软腭与硬腭交界处前方切断硬腭，然后将软腭与其下方组织分离，确保切除所有残留的骨碎片，并去除多余的肌肉和结缔组织。用钝头镊子夹住腭部组织，用刀片轻轻刮除残留的腺体和疏松结缔组织。通过使用DsRed和角蛋白8抗体对舌上皮进行染色，可标记Phox2b-Cre TdTomato小鼠中的完整味蕾及所有味蕾的神经支配。味蕾体积的测量结果显示，在菌状乳头或轮廓乳头测量区域中，味蕾体积与神经支配体积之间均无相关性。在 TrkB CreER TdTomato 小鼠中给予低剂量他莫昔芬，可引起基因重组并标记少量神经元。此处展示的是用味觉转导细胞标志物碳酸酐酶4和磷脂酶Cβ2对整体味蕾进行染色的结果。该味蕾具有两个标记的终末分支，在重建纤维后移除味蕾显示。使用基于细胞像素的成像软件确定神经纤维与味觉转导细胞之间的最近距离，结果显示，在19个味觉转导细胞中，蓝色终末分支距离浅蓝色碳酸酐酶4阳性细胞在200纳米以内。与绿色示踪相关的终末分支以洋红色显示，距离浅蓝色和深蓝色碳酸酐酶4阳性细胞均在200纳米以内。对菌状味蕾进行整体角蛋白8与5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）染色显示，EdU标记的细胞既存在于味蕾内部，也存在于味蕾外部。品红色和紫色的细胞核位于味蕾的角蛋白8阳性边界之外，而黄色、蓝绿色和蓝色的细胞则位于味蕾内部。在进行该方案时，组织解剖和冷冻步骤至关重要。这些组织解剖方法可用于对多种细胞和结构进行染色，以分析味蕾内部以及味蕾外部但位于乳头内的各种关系。这是首次对味蕾内完整的味觉神经分支及其与味觉转导细胞之间关系的分析。在单个样本中同时保存并染色多种组分，不仅拓展了分析的可能性，也提高了可进行测量的精确度。

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真菌形态、环形和味觉味蕾的全镶嵌染色、可视化和分析

近年来，由于采用动物模型，人们对味觉转导分子机制的认识取得了显著进展。然而，哺乳动物在味觉敏感性和特异性方面存在广泛差异，因此有必要开展针对人体组织的研究。本文介绍了一种活检技术，用于从人舌乳头采集存活的味觉细胞。...

采集人舌菌状（味觉）乳头的技术

我们旨在建立一种可重复的方案，用于分离和长期培养人菌状味蕾细胞。通过活检获取的人菌状乳头细胞在体外培养中成功维持了超过八代（12个月），且细胞活力未见下降。...

分离与培养人 fungiform 味蕾细胞

来源：Fowler, B. E., et al. 味觉刺激下小鼠膝状神经节神经元反应的活体钙成像。J. Vis. Exp. (2021)...

使用落射荧光显微镜对膝状神经节神经元反应进行活体成像

脂肪酸的口腔化学感受及其与饮食和高脂食物偏好的关联，可能有助于揭示与肥胖发生相关的机制，并阐明为何许多个体难以改变饮食习惯。...

测量人类口腔脂肪酸阈值、脂肪感知、对高脂食物的喜好程度及乳头密度

本文介绍了一种通过数字照片测量菌状乳头密度的实验方案。该方法在Miller &amp;#38;...

丹佛乳头计数方案：用于菌状乳头的客观分析

我们提出三种研究味觉编码的新方法. 使用一种简单的动物——蛾 烟草天蛾（Manduca...

研究味觉编码的新方法

本文介绍了一种利用共聚焦显微镜对小鼠继发性腭融合过程进行活体成像的实验方案。该方案可与多种荧光报告小鼠品系及信号通路抑制剂联合使用，以获得机制性见解。本方案亦可适用于其他发育系统的活体成像研究。...

小鼠次级腭融合的活体成像

本文介绍了如何暴露一只活体、麻醉状态下的实验小鼠的膝状神经节，并利用钙成像技术记录这些神经元群体对不同味觉刺激的反应，从而实现使用多种刺激物进行多次重复实验。该方法可用于深入比较哪些神经元对哪些味觉物质产生反应。...

小鼠膝状神经节神经元对味觉刺激反应的活体钙成像

本文介绍了一种用于味觉功能细胞成像的 µTongue（舌上微流控）装置 体内...

µTongue：一种基于微流控技术的舌部功能成像平台 在体 内

钙成像方法能够记录在向喙器施加溶液时清醒果蝇大脑中由味觉诱导的反应。以黑腹果蝇（Drosophila...

体内 钙成像技术用于研究成年 Drosophila 味觉诱导的神经反应

学习全镶嵌解剖技术用于分析小鼠舌上皮中的真菌形态、环形和味觉味蕾结构。该方法可精确测量细胞数量与神经支配体积，揭示味蕾细胞与神经纤维的空间关系，为研究味觉神经回路及味觉障碍提供可靠工具。

完整组织染色、可视化及味蕾分析：菌状乳头、轮廓乳头与腭部味蕾

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