完整组织染色、可视化及味蕾分析：菌状乳头、轮廓乳头与腭部味蕾

这种整体组织解剖与分析流程提供了一种新方法，用于分析单个味觉神经分支的完整形态、转导细胞类型的数量以及细胞之间的物理关系。通过采集整个舌上皮组织，我们能够测量整个味蕾内细胞的绝对数量以及神经支配的体积。该方法比基于组织切片取样对细胞结构进行估算更为准确，可降低技术变异带来的影响。

这也是首个能够对味蕾细胞与其神经支配关系进行详细分析的方法。该方法可促进对味蕾内部潜在神经环路的研究，以及对破坏正常味觉功能的疾病过程和化疗手段的研究。在大多数情况下，尚不清楚具体是哪种结构或关系受到了破坏，因此保持所有这些因素的完整性，使得在单个样本制备中即可完成全部分析。

最常见的错误是为了避免损伤上皮而没有充分贴近上皮下表面进行分离。在将组织放入组织包埋模中冷冻之前，必须尽可能去除更多的下方组织。同时，必须确保上皮平整地贴附在组织包埋模的底部。

首先将舌组织在0.1摩尔磷酸盐缓冲液中解冻并冲洗。然后取含有菌状乳头的舌前部的一半，置于解剖显微镜下的载玻片上。使用钝头镊子和解剖剪去除肌肉组织，并在舌上皮呈弯曲状时保持组织展开，通过使粗解剖剪的刀片与上皮平行，确保组织呈平坦方向。

弃去舌腹侧无角化的上皮组织，因其不含味蕾。然后使用精细解剖剪进一步贴近角化上皮的下方进行解剖。用钝头镊子将一块上皮组织放入组织模具中，并确保其平铺无褶皱。

然后在组织上添加一滴最佳切割温度化合物（OCT）。将组织模具置于解剖显微镜下预冷的金属底座上，继续用镊子轻轻敲击组织，直至 OCT 完全冻结，确保组织尽可能平整地冻结。一旦 OCT 完全冻结，迅速添加额外的 OCT，并将模具放入盛有冷却的2-甲基丁烷的烧杯中，直至完全冻结。

将OCT模具安装在冷冻切片机上，切成20微米厚的切片。收集每一片切片，并在光学显微镜下观察，以评估其与上皮基底的接近程度。当组织从上皮下表面削除后，将上皮解冻，并在摇床上用0.1摩尔磷酸缓冲液冲洗两次。

在软腭与硬腭交界处前方切断硬腭，然后将软腭与其下方组织分离，确保切除所有残留的骨碎片，并去除多余的肌肉和结缔组织。用钝头镊子夹住腭部组织，用刀片轻轻刮除残留的腺体和疏松结缔组织。通过使用DsRed和角蛋白8抗体对舌上皮进行染色，可标记Phox2b-Cre TdTomato小鼠中的完整味蕾及所有味蕾的神经支配。

味蕾体积的测量结果显示，在菌状乳头或轮廓乳头测量区域中，味蕾体积与神经支配体积之间均无相关性。在 TrkB CreER TdTomato 小鼠中给予低剂量他莫昔芬，可引起基因重组并标记少量神经元。此处展示的是用味觉转导细胞标志物碳酸酐酶4和磷脂酶Cβ2对整体味蕾进行染色的结果。

该味蕾具有两个标记的终末分支，在重建纤维后移除味蕾显示。使用基于细胞像素的成像软件确定神经纤维与味觉转导细胞之间的最近距离，结果显示，在19个味觉转导细胞中，蓝色终末分支距离浅蓝色碳酸酐酶4阳性细胞在200纳米以内。与绿色示踪相关的终末分支以洋红色显示，距离浅蓝色和深蓝色碳酸酐酶4阳性细胞均在200纳米以内。

对菌状味蕾进行整体角蛋白8与5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）染色显示，EdU标记的细胞既存在于味蕾内部，也存在于味蕾外部。品红色和紫色的细胞核位于味蕾的角蛋白8阳性边界之外，而黄色、蓝绿色和蓝色的细胞则位于味蕾内部。

在进行该方案时，组织解剖和冷冻步骤至关重要。这些组织解剖方法可用于对多种细胞和结构进行染色，以分析味蕾内部以及味蕾外部但位于乳头内的各种关系。这是首次对味蕾内完整的味觉神经分支及其与味觉转导细胞之间关系的分析。

在单个样本中同时保存并染色多种组分，不仅拓展了分析的可能性，也提高了可进行测量的精确度。