一种基于板的测定法，用于测量急性脑切片中内源性单胺释放

该方法引入了一种使用急性脑切片检测内源性单胺释放的简单技术。该装置使用含有组织支架的48孔板进行单胺释放。释放的单胺通过HPLC结合电化学检测进行分析。此外，该技术还为药物发现提供了一种筛选方法。

该技术是对检查单胺释放的常用方法的改编，允许在多种药理条件下同时测量内源性释放而不是预加载放射性标记的单胺。该技术的主要优点是它具有相当的成本效益，可以一次检查多种药理条件，并且我们可以研究内源性单胺释放，并能够区分囊泡和转运蛋白介导的释放。从成年大鼠收获后制备250~350克雄性大鼠的脑切片，立即放置脑部和冰冷的含氧解剖缓冲液，并从每个感兴趣区域获取300微米的冠状脑切片。

为了进一步解剖脑切片，小心地将组织移动到载玻片上，并使用大鼠脑图谱根据其深色条纹结构识别背纹状体，并根据其与皮层的接近程度及其独特的螺旋结构来识别海马体。将左右半球分开，以用作控制切片和实验切片。背纹状体可以进一步解剖成两毫米的冲头。

然后使用带有改性尖端的塑料转移移液器将样品转移到浸入含氧冰冷解剖缓冲液中的小容器中，并带有氧气气泡。为了诱导单胺释放，将组织样品转移到定制的48孔外排室的每个孔中，每孔含有0.5至1毫升的外排缓冲液，并持续温和地冒泡，并允许样品在37摄氏度下恢复30至50分钟。在平衡期结束时，将带有脑组织的组织支架移动到含有500微升含氧外排缓冲液的孔中，有或没有药理剂，在孔的边缘敲击保持器以防止孔之间缓冲液的最小转移，在37摄氏度下孵育20分钟。

在孵育结束时，将支架移动到一组含有500微升外排缓冲液的新孔中，无论是否具有感兴趣的药物，并将板返回细胞培养箱再放置20分钟。在第二次孵育期间，将溶液从第一次孵育的孔转移到含有50微升一种正常高氯酸或磷酸的微量离心管中，并标记第一号管"在第二次孵育结束时，将组织支架移动到带有冰板上的空孔中，并将第二次孵育的上清液转移到含有50微升正常高氯或磷酸的新微量离心管中冰上的酸。标记这些管二号"当所有上清液都转移后，向每个组织孔中加入一毫升冰冷解剖缓冲液，并使用小镊子将每个组织样品转移到新的微量离心管中。

从样品管中取出缓冲液并将组织储存在零下80摄氏度，然后将收集的培养溶液转移到微量离心机过滤管中进行离心，并将滤液放在冰上直至HPLC分析。将ECD的电位和流速设置为制造商关于检测单胺的建议。将每个样品（包括神经递质标准品）的上样和适当的等分试样放入HPLC中，用于自动进样和检测，并允许仪器完成分析。

然后使用HPLC分析软件，使用由每种单胺组成的标准曲线获取和分析色谱数据，以根据制造商的指南获得曲线下的面积。经过六小时的功能分析后，组织样品仍然存活，而用1%Triton X-100孵育的样品显示出MTT转化显着降低。用苯丙胺急性20分钟治疗海马和前额叶皮层脑切片可诱导每种单胺的细胞外水平显着增加。

当用氟西汀（一种选择性5-羟色胺再摄取抑制剂）预处理样品时，苯丙胺诱导海马体内和前额叶皮层内细胞外5-羟色胺的增加不会发生，而细胞外多巴胺和去甲肾上腺素的产生不受影响。此外，用苯丙胺急性20分钟治疗背纹状体打孔可诱导细胞外多巴胺水平表达增加35倍，而用可卡因（一种单胺转运蛋白阻滞剂）进行背纹状体穿刺治疗可显着抑制苯丙胺诱导的细胞外多巴胺。与未经处理的对照条件相比，增加细胞外氯化钾的浓度以唤起膜去极化足以诱导单胺的胞吐释放，并且氟西汀和可卡因处理均不阻断这种深度极化诱导的增加。

必须有干净的切割截面，精确定位冲头，并在整个实验过程中保持一致的氧合。实验后可以使用脑切片进行进一步的生化处理和分析，例如蛋白质印迹和组织学。