小鼠葡聚糖硫酸钠诱导结肠炎模型中肠道炎症的系统性评分分析

系统评分分析是一种用于评估黏膜损伤的技术，有助于进行组织学解释，可由经过培训的研究人员操作。该方法的主要优点是免费且易于使用。它能够对从结肠炎小鼠肠道获得的组织学数据进行定量分析。

本方案提供了一种快速且可重复的方法，用于评估整个结肠的疾病严重程度，这对于比较不同遗传背景动物的疾病状况至关重要。在组织制备过程中，务必提前整理好所有试剂和材料。首先将已处死的小鼠仰卧置于解剖垫上，并使用20号1.5英寸针头固定小鼠的四肢。

使用镊子和剪刀，在腹部皮肤上做一个小切口，将皮肤拉向一侧以暴露腹膜，然后从耻骨向腹部两侧沿中线切开腹膜，打开腹腔。小心移除组织和器官，直至观察到大肠。在结肠两侧切断骨盆骨，以充分暴露从肛门至盲肠的大肠器官。

小心分离结肠组织，轻轻去除附着在结肠上的脂肪、小静脉和动脉，于肛门近端和盲肠远端附近剪切。使用经肛门插入的柔软塑料灌胃针，用 PBS 缓冲液仔细冲洗结肠，以清除粪便内容物。将结肠摆成直线，沿肠系膜动脉方向纵向切开。

从远端至近端纵向切开结肠。将一半组织用于组织学分析，另一半用于蛋白质印迹、PCR检测，或卷成第二个瑞士卷状以进行新鲜冷冻的免疫荧光显微镜检查。使用刀片修剪近端结肠的多余组织，直至整个结肠长度上的宽度大致相同。

使用柔性灌胃针将结肠对齐以暴露管腔，并将组织完全展平。如有需要，可添加更多 PBS 以保持组织在整个操作过程中的湿润。使用纸巾吸除多余的 PBS。

使用注射器和灌胃针，加入10%中性缓冲甲醛溶液灌注2至3分钟，以固定并展平组织。然后用直镊夹住远端结肠末端，将结肠从远端向近端卷成同心圆状。插入一根27号针头固定结肠中心位置，以维持其瑞士卷形状。随后将该瑞士卷组织放入组织学标本容器内的包埋盒中，使组织方向与包埋盒平行。在4°C条件下，用10%中性缓冲甲醛溶液固定组织过夜。

过夜固定后，用 PBS 洗涤组织三次。在进行石蜡包埋前，加入 70% 乙醇，并在继续操作前从瑞士卷中移除针头。组织可在室温下保存于乙醇中，直至进行石蜡包埋。

在图像处理软件中打开扫描图像后，需确认整个结肠均可见，且样本无任何缺失区域。通过点击标签成像器（label imager）激活标签成像功能和比例尺工具，以正确标识扫描切片。点击注释（annotations）打开注释工具，并通过点击新建图层（new layer）创建三个不同的图层，用于量化瑞士卷（Swiss roll）的总长度、炎症或损伤区域，以及糜烂或溃疡区域。

通过单击图层颜色为每个图层选择不同的颜色。使用画笔工具沿黏膜肌层绘制一条线，并根据需要移动指针以可视化相邻分析区域，从而测量每个图层或类别的长度。将图像放大至400微米，以便充分观察黏膜肌层。

每次停止使用画笔时，都会生成一个新的小层区域。可通过层区域标签页对其进行查看和编辑。以肌层黏膜为参考，评估总长度、炎症或损伤，以及糜烂或溃疡情况。

定义所有图层后，使用图层区域选项中的“导出网格到文本文件”按钮导出数据。打开文本文件并将数据复制到电子表格软件中。汇总每个区域的所有片段，并计算损伤和溃疡段占总长度的百分比。

计算组织学结肠炎评分并评估疾病严重程度时，需考虑三个主要特征。首先检查健康的肠黏膜，其特征为隐窝腔面的上皮细胞排列有序，固有层内免疫细胞稀少，下方为黏膜肌层。其次检查是否存在炎症或损伤，其特征为上皮隐窝变薄或部分缺失上皮细胞，以及黏膜炎症伴有中性粒细胞浸润至隐窝内。

最后，检查是否存在糜烂或溃疡，其特征是表面上皮缺失的区域，或完全缺乏上皮隐窝的区域，无论是否伴有白细胞浸润。为了说明该组织学结肠炎评分分析在黏膜损伤背景下的可靠性，将2.5% DSS给予8只C57BL6野生型小鼠饮用，持续5天，随后更换为普通饮用水，恢复5天。在DSS急性给药期间，小鼠体重保持稳定，但在开始饮用普通自来水后体重显著下降。

在给予DSS三天后出现血便和稀便，并持续至实验第8天。这些观察结果表明，DSS暴露造成的最严重损害发生在第5至第8天的恢复期。第10天对结肠长度的测量证实，实验结束时结肠长度显著缩短。

在第0、2、5、7、8和10天采集结肠组织以制备石蜡瑞士卷。组织经H&E染色后进行高分辨率扫描，用于计算组织学结肠炎评分以及损伤和溃疡所占百分比。未经处理的小鼠显示出正常的隐窝结构。

在给予DSS两天后，观察到免疫细胞的募集。第5天时，上皮细胞出现损伤，并伴有中性粒细胞穿过上皮浸润，与上皮损伤相关。从第5天至第8天，观察到伴有炎症和溃疡的上皮缺失区域。

第10天，上皮细胞开始再生并重新定植于溃疡区域，逐渐恢复结肠黏膜。在实施该方案时，重要的是制备方向正确且保存良好的瑞士卷切片，并准确识别黏膜炎症或损伤以及溃疡或糜烂。该方法可用于在其他结肠炎模型（如TMS模型或T细胞转移模型）中对结肠黏膜全长的损伤进行定量评估。