生态HIV脑感染的老鼠模型

在这里，我们提出了一个协议，建立一个新的大鼠模式，使用有幻想的艾滋病毒（EcoHIV），这是关键，以提高我们对HIV-1病毒库在大脑中的理解，并提供一个系统，以研究艾滋病毒相关的神经认知障碍和相关的合并症（即药物滥用）。

使用大鼠，该协议可用于建立使用幻想艾滋病毒的活性艾滋病毒感染的新模式。与大鼠，建立EcoHIV感染模型，用于研究药物滥用和神经认知障碍，可能有利于研究神经HIV和HIV-1相关的神经认知障碍。演示程序将是李海龙，我实验室的一名研究员。

对于将病毒包装成293个T细胞，种子每毫升DMEM的5倍10至5293T细胞，在两个明胶涂层的75平方厘米烧瓶中各补充10%FBS，并在37摄氏度下孵育细胞，直到培养物达到50%的共融度。在转染当天，在 1.5 毫升微中福管中稀释 750 微升每瓶中等试剂中的 22.5 微升转染试剂，并涡流溶液三秒钟。将20微克的奇美EcoHIV质粒DNA稀释到750微升的介质中，在第二个1.5毫升微中微流管中每瓶与彻底混合。

将稀释后的DNA与稀释的输血试剂与温和混合相结合，在室温下孵育15分钟。在孵化结束时，将每个病毒悬浮添加到 10 毫升的预热 DMEM 介质中，并将每个病毒补充溶液添加到 293 个 T 细胞的一个烧瓶中。经过两天的细胞培养后，将烧瓶中的超自然分子集中到一个50毫升的圆锥管中进行离心，并将澄清的超自然分子转移到一个新的50毫升管中。

在澄清的超自然剂中加入八毫升 Lenti-X 浓缩器，并与温和的反转混合。在摄氏四度下进行两天的孵化后，将混合物离心，小心地去除超母体，然后用100毫升PBS的100微升轻轻补充颗粒，并使用P24 ELISA试剂盒来滴定病毒浓度。对于 EcoHIV-EGFP 注射，在确认对踏板反射缺乏反应后，剃掉大脑区域的头发，用 70% 乙醇和氯西丁磨砂对暴露的皮肤进行两次消毒。

将大鼠固定在立体氧化装置的易发位置，并通过头皮中线的皮肤切口五到六厘米。在 0.8 毫米横向标记一个钻孔位置，在每个头骨位置标记一个直径为 0.4 毫米的孔，然后标记一个 1.2 毫米的轮盘孔。将每毫升滴定 EcoHIV Lentivirus 解决方案的第六个转导单元加载 1.04 倍 10 到 10 微升注射注射器中，并将注射器固定到立体氧化装置中。

将针头移近一个钻孔的表面，并将针头 2.5 毫升插入孔中。以每分钟 0.2 微升病毒的速度注入一微升病毒溶液。当所有的病毒都注射后，将针头留在注射区域内五分钟，然后慢慢收回针头，直到针头在老鼠头骨之外。

用 4-0 丝线缝合关闭皮肤切口，用 70% 乙醇对溶液进行消毒，然后将大鼠放在带加热垫的恢复室中，并附有监控，直到重新入职。病毒输液一到八周后，在确认对踏板反射缺乏反应后，将大鼠固定在烟罩内的超平位置，沿着胸腔中线将皮肤固定。切开隔膜以打开胸腔，并将 20 个仪表乘 25 毫米针插入左心室。

立即用剪刀打开右中庭，以每分钟 5 毫升的流速将 50 毫升预冷 100 毫升 PBS 灌注。当所有的PBS都交付后，用100毫升的冷4%副甲醛香水。当所有的固定剂都交付后，从头骨中取出大脑，用新鲜的4%副甲醛在一夜之间修复组织。

第二天早上，将样品放在40毫升的100毫升PBS中，在50毫升的管子里放置大约三天，直到大脑稳定到管子底部，然后在零下80摄氏度下将甲基丁醇中的脑组织冷冻两分钟。冷冻后，使用零下20摄氏度的低温喷涂和细画笔获得50微米厚的日冕部分。获得所有部分后，用 300 微升防褪色介质覆盖样品，并安装 22 个 50 毫升盖片。

当介质干燥时，通过共聚焦显微镜对部分进行成像。伦蒂病毒注射七天后，大鼠冠状脑切片图像显示整个脑组织中存在大量 EcoHIV-EGFP 信号，尤其是在皮层和海马凹痕陀螺内。与Iba1和EcoHIV-EGFP探头的双重标记提供了强有力的证据，证明微胶质是大脑中含有EcoHIV表达的主要细胞类型。

感染后八周，EcoHIV注射的动物对控制盐水的间隔表现出相对的麻木不仁，与盐水控制相比，间隔功能相对平坦。此外，EcoHIV注射的老鼠在树突状脊柱形态上表现出深刻的变化，短树突状脊柱相对频率增加，头部和颈部直径相对于对照动物增加就证明了这一点。立体氧化注射前条件介质的浓度和滴定对于确保整个实验的一致性和可复制结果至关重要。

EcoHIV 的这种特定区域立体毒性注射在大脑中提供了有效的 HIV 感染，并在大鼠中产生时间处理缺陷。利用大鼠的立体毒性艾滋病毒注射来扩展EcoHIV感染模式，为解决与手头神经艾滋病毒有关的新问题提供了关键机会。