Name: 生态HIV脑感染的老鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 了解如何使用EcoHIV建立大鼠HIV脑感染模型，通过立体定位注射研究HIV相关神经认知障碍。该模型利用小胶质细胞靶向和神经行为评估，为神经HIV研究提供重要工具。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为 HD043680、MH106392、DA013137 和 NS100624。

所有动物实验方案均经南卡罗来纳大学动物护理与使用委员会审查并批准（联邦保证编号：D16-00028）。六只成年雄性F344/N大鼠在受控环境中成对饲养，光照周期为12小时光照：12小时黑暗，可自由获取食物和水。所有动物的护理均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》中制定的准则。
1. 在293 FT细胞中进行病毒包装
<ol>
	<li>将293 FT细胞（5×105/mL）培养于明胶包被的75 cm2培养瓶中，使用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基11，在37 °C条件下培养至转染时细胞融合度达到50%。</li>
	<li>在1.5 mL微量离心管中，将22.5 µL转染试剂（例如Lipofectamine 3000）溶于750 µL培养基（例如Opti-MEM）中，涡旋振荡3秒。</li>
	<li>在另一1.5 mL微量离心管中，将20 µg EcoHIV质粒DNA溶于750 µL培养基中，并充分混匀。</li>
	<li>将稀释后的DNA加入已稀释的转染试剂管中，轻轻混匀。室温孵育15分钟。</li>
	<li>将上述混合物加入含有10 mL预温DMEM培养基的75 cm2培养瓶中。在37 °C条件下继续培养细胞2天。</li>
	<li>收集并合并两个培养瓶中的24 mL条件培养基（含包装好的慢病毒颗粒）。</li>
	<li>将全部24 mL条件培养基于4 °C、500 xg离心10分钟。将澄清的上清液转移至无菌的50 mL离心管中。</li>
	<li>将8 mL Lenti-X浓缩剂与24 mL澄清上清液按1:3比例混合。通过轻柔颠倒混匀。4 °C孵育两天。</li>
	<li>将混合液在4 °C、1,500 x g条件下离心45分钟。小心弃去上清液。</li>
	<li>用100 µL 100 mM PBS轻轻重悬沉淀物。</li>
	<li>使用p24 ELISA试剂盒测定病毒滴度。</li>
</ol>
2. EcoHIV-EGFP 病毒立体定位手术
<ol>
	<li>使用3%七氟烷麻醉大鼠。当大鼠对有害刺激无反应且反射消失时，进行步骤2.2。</li>
	<li>剃除脑区毛发，并用70%乙醇和含氯己定的消毒液对皮肤进行两次消毒。将大鼠俯卧位固定于立体定位仪中。</li>
	<li>沿头皮正中线做皮肤切口（5–6 cm）。</li>
	<li>在前囟外侧0.8 mm、头侧1.2 mm处标记两个钻孔位置。在颅骨相应位置各钻一个直径为0.4 mm的孔。</li>
	<li>将滴定后的EcoHIV慢病毒溶液（1.04 × 106 TU/mL）吸入10 µL注射器中。将注射器固定于立体定位仪上。</li>
	<li>将针头下降至接近钻孔表面，测量并继续下针2.5 mm深度。</li>
	<li>以0.2 µL/min的速度注入1 µL病毒溶液。保持针头在注射部位内5分钟。缓慢上提针头直至完全退出大鼠颅骨。</li>
	<li>用4-0丝线缝合皮肤。</li>
	<li>用70%乙醇对切口消毒一次。皮下注射布托啡诺（Dorolex，0.1 mg/kg体重）。</li>
	<li>将大鼠转移至带有加热垫的恢复室，直至其苏醒。</li>
</ol>
3. 脑切片的可视化
注意：在 EcoHIV 病毒注射后等待一至八周。
<ol>
	<li>用5%七氟烷麻醉大鼠。当大鼠对有害刺激无反应且反射消失时，继续进行步骤3.2。</li>
	<li>将大鼠仰卧位固定在通风橱内。</li>
	<li>沿胸骨中线切开皮肤，剪开膈肌并打开胸腔。</li>
	<li>将一支20 G × 25 mm的针头插入左心室。</li>
	<li>立即用剪刀剪开右心房。</li>
	<li>以5 mL/min的速度灌注50 mL预冷的100 mM PBS。</li>
	<li>以5 mL/min的速度灌注100 mL冰冷的4%多聚甲醛。</li>
	<li>断头取脑，切开头皮并取出脑组织。</li>
	<li>用4%多聚甲醛在4℃下后固定过夜。</li>
	<li>将脑组织转移至含有40 mL 30%蔗糖（溶于100 mM PBS）的50 mL离心管中，直至脑组织沉降至管底（约3天）。</li>
	<li>将脑组织置于甲基丁醇中，在-80 °C下快速冷冻2分钟。</li>
	<li>将脑组织固定在-20 °C冷冻切片机内的金属平台上。</li>
	<li>使用冷冻切片机切割50 µm厚的冠状切片。</li>
	<li>用细刷将脑切片转移至载玻片上。</li>
	<li>每张切片加入0.3 mL抗荧光淬灭封片剂，并加盖22 mm × 50 mm的盖玻片封片。</li>
	<li>将载玻片置于室温避光处直至干燥。</li>
	<li>根据脑区边界及神经元形态特征，使用共聚焦显微镜进行Z轴层扫成像。 
	注意：共聚焦显微镜设置如下：放大倍数60 X（A/1.4，油镜），Z轴步进间隔0.15 µm（针孔大小30 µm；后投影针孔半径167 nm），激发波长为488 nm。</li>
</ol>

<ol><li>Illenberger, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+Infection+and+Neurocognitive+Disorders+in+the+Context+of+Chronic+Drug+Abuse%3A+Evidence+for+Divergent+Findings+Dependent+upon+Prior+Drug+History%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">HIV Infection and Neurocognitive Disorders in the Context of Chronic Drug Abuse: Evidence for Divergent Findings Dependent upon Prior Drug History.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 15 (4), 715-728 (2020).</li>
<li>Joseph, S. B., Swanstrom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+HIV-1+entry+phenotypes+as+a+guide+to+changing+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">The evolution of HIV-1 entry phenotypes as a guide to changing target cells.</a> Journal of Leukocyte Biology. 103 (3), 421-431 (2018).</li>
<li>Potash, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+study+of+systemic+HIV-1+infection%2C+antiviral+immune+responses%2C+and+neuroinvasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A mouse model for study of systemic HIV-1 infection, antiviral immune responses, and neuroinvasiveness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (10), 3760-3765 (2005).</li>
<li>Albritton, L. M., Tseng, L., Scadden, D., Cunningham, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+putative+murine+ecotropic+retrovirus+receptor+gene+encodes+a+multiple+membrane-spanning+protein+and+confers+susceptibility+to+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A putative murine ecotropic retrovirus receptor gene encodes a multiple membrane-spanning protein and confers susceptibility to virus infection.</a> Cell. 57, 659-666 (1989).</li>
<li>Geraghty, P., Hadas, E., Kim, B. H., Dabo, A. J., Volsky, D. J., Foronjy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+infection+model+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">HIV infection model of chronic obstructive pulmonary disease in mice.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (4), 500-509 (2017).</li>
<li>Gu, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EcoHIV+infection+of+mice+establishes+latent+viral+reservoirs+in+T+cells+and+active+viral+reservoirs+in+macrophages+that+are+sufficient+for+induction+of+neurocognitive+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">EcoHIV infection of mice establishes latent viral reservoirs in T cells and active viral reservoirs in macrophages that are sufficient for induction of neurocognitive impairment.</a> PLoS Pathogens. 14 (6), 1007061(2018).</li>
<li>Ellenbroek, B., Youn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+in+neuroscience+research%3A+is+it+a+rat+race%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models%2C+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Rodent models in neuroscience research: is it a rat race.</a> Disease Models, Mechanisms. 9 (10), 1079-1087 (2016).</li>
<li>Feduccia, A. A., Duvauchelle, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+apparatus+and+method+for+drug+reinforcement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Novel apparatus and method for drug reinforcement.</a> Journal of Visualized Experiments. (42), e1998(2010).</li>
<li>Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+proteins+dysregulate+motivational+processes+and+dopamine+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7869(2018).</li>
<li>McGaughy, J., Sarter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+vigilance+in+rats%3A+task+validation+and+effects+of+age%2C+amphetamine%2C+and+benzodiazepine+receptor+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Behavioral vigilance in rats: task validation and effects of age, amphetamine, and benzodiazepine receptor ligands.</a> Psychopharmacology. 117 (3), Berl. 340-357 (1995).</li>
<li>Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+filamentous+actin+%28F-actin%29+puncta+in+rat+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Quantification of filamentous actin (F-actin) puncta in rat cortical neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), (2016).</li>
<li>McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Timing%3A+NeuroHIV+Progression+in+the+Post-cART+Era%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era.</a> Scientific Reports. 9 (1), 827(2019).</li>
<li>McLaurin, K. A., Moran, L. M., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Power+of+Interstimulus+Interval+for+the+Assessment+of+Temporal+Processing+in+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), e58659(2019).</li>
<li>Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ballistic+Labeling+of+Pyramidal+Neurons+in+Brain+Slices+and+in+Primary+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (158), (2020).</li>
<li>Ko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+but+not+Astrocytes+Harbor+HIV+DNA+in+the+Brains+of+HIV-1-Infected+Aviremic+Individuals+on+Suppressive+Antiretroviral+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Macrophages but not Astrocytes Harbor HIV DNA in the Brains of HIV-1-Infected Aviremic Individuals on Suppressive Antiretroviral Therapy.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 110-119 (2019).</li>
<li>Sopper, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+simian+immunodeficiency+virus+infection+in+vitro+and+in+vivo+on+the+cytokine+production+of+isolated+microglia+and+peripheral+macrophages+from+rhesus+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The effect of simian immunodeficiency virus infection in vitro and in vivo on the cytokine production of isolated microglia and peripheral macrophages from rhesus monkey.</a> Virology. 220 (2), 320-329 (1996).</li>
<li>Llewellyn, G. N., Alvarez-Carbonell, D., Chateau, M., Karn, J., Cannon, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+infection+of+microglial+cells+in+a+reconstituted+humanized+mouse+model+and+identification+of+compounds+that+selectively+reverse+HIV+latency%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+NeuroVirology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 infection of microglial cells in a reconstituted humanized mouse model and identification of compounds that selectively reverse HIV latency.</a> Journal of NeuroVirology. 24 (2), 192-203 (2018).</li>
</ol>

所有作者均无利益冲突需要声明。

在本实验方案中，我们建立了一种由EcoHIV诱导的大鼠HIV感染模型。具体而言，我们描述了通过立体定位双侧注射EcoHIV至大脑皮层，可在注射后7天成功诱导大鼠脑内产生活跃的HIV感染。此外，我们证明EcoHIV感染大鼠可作为研究HIV相关神经认知功能障碍（HAND）关键特征的良好生物系统。在EcoHIV感染8周后，大鼠表现出显著的神经认知功能损害，包括时间处理能力的改变以及伏隔核（NAc）中型棘状神经元（MSNs）的突触功能障碍。鉴于动物模型在神经HIV和HAND研究中的重要性2，开发新的生物系统可能有助于推动该领域内新问题的探索。Potash等3首次报道了使用EcoHIV在小鼠中诱导活跃的HIV-1感染。具体方法为通过尾静脉注射0.1 mL EcoHIV病毒溶液3。感染6周后，可在脾细胞和淋巴细胞中检测到HIV-1病毒DNA。此外，单次EcoHIV接种即可在超过75%的小鼠中成功诱导感染。本研究采用双侧立体定位注射方法，成功实现了100%的大鼠感染（分别为n = 6或n = 4），并在注射后...

生物系统加深了我们对人类免疫缺陷病毒1型相关神经认知障碍（HAND）及其潜在神经机制的理解2。确定何种生物系统最适合特定研究，通常取决于所关注的科学问题2。可用于研究HIV-1疾病发展的宿主动物模型种类有限，这给相关研究带来了挑战。为了研究HIV-1病毒复制和致病机制，Potash等人3建立了一种可发生主动HIV-1感染的小鼠模型，该模型将HIV表面包膜糖蛋白gp120的编码区替换为嗜鼠性逆转录病毒（MLV）的gp80，从而实现了病毒在小鼠体内的有效复制4。在嵌合型HIV（EcoHIV）小鼠经尾静脉注射后，观察到许多与HIV-1血清阳性个体相似的特征（例如，淋巴细胞和巨噬细胞被感染，引发抗病毒免疫反应以及炎症反应3,5,6）。
尽管小鼠和大鼠均属于鼠科（Muridae），但两者之间存在的基本物种差异可能会影响其对特定实验问题的适用性7。因此，将EcoHIV感染模型扩展至大鼠（常用于药物滥用和神经认知障碍研究）将有助于神经HIV的研究。例如，大鼠体型较大，使得颈静脉导管植入用于药物自我给药操作更为可行8。研究人员已采用大鼠的药物自我给药技术来评估HIV-1感染下的动机行为9。此外，许多神经认知/行为学任务最初是为大鼠设计的10。本文报道了通过立体定位注射将EcoHIV注入大鼠体内，从而扩展EcoHIV感染模型，为研究与神经HIV及HIV相关神经认知障碍（HAND）相关的新问题提供了重要机会。

<table><tbody><tr><td>293FT 细胞</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌素溶液</td><td>Cellgro</td><td>30004CI</td><td>100X</td></tr><tr><td>Corning BioCoat Gelatin 75 cm&amp;sup2; 倾斜颈带通气盖细胞培养瓶</td><td>Life Technologies</td><td>354488</td><td></td></tr><tr><td>Corning DMEM 培养基（含 L-谷氨酰胺、4.5 g/L 葡萄糖和丙酮酸钠）</td><td>Life Technologies</td><td>10013CV</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>VWR</td><td>637-137</td><td></td></tr><tr><td>钻孔器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>World Precision Instruments</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 镊子</td><td>World Precision Instruments</td><td>14097</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Snap-Cap 微量离心生物纯 Safe-Lock 管</td><td>Life Technologies</td><td>22600028</td><td></td></tr><tr><td>Ethicon Vicryl Plus 抗菌性 4-0 聚乳酸-乙醇酸共聚物 910 缝线，27 英寸，FS-2</td><td>Med Vet International</td><td>VCP422H</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 注射器</td><td>Hamilton</td><td>1701</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Lipofectamine 3000 转染试剂</td><td>Life Technologies</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>虹膜镊</td><td>World Precision Instruments</td><td>15914</td><td></td></tr><tr><td>虹膜剪</td><td>World Precision Instruments</td><td>500216</td><td></td></tr><tr><td>慢病毒相关 p24 ELISA 检测试剂盒</td><td>Cell Biolabs, inc.</td><td>VPK-107-5</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-X 浓缩试剂</td><td>Takara</td><td>PT4421-2</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I 低血清培养基</td><td>Life Technologies</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 封片剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>七氟烷</td><td>Merritt Veterinary Supply</td><td>347075</td><td></td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>Kopf Instruments</td><td>Model 900</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus 载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-154%</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 剪刀</td><td>World Precision Instruments</td><td>500086</td><td></td></tr></tbody></table>

一种大鼠的ecohiv脑部感染模型

A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

已有大量研究表明，感染EcoHIV的小鼠模型在研究HIV相关神经系统并发症方面具有重要价值。建立用于药物滥用和神经认知障碍研究的感染EcoHIV的大鼠模型，将有助于神经HIV及HIV-1相关神经认知障碍（HAND）的研究。在本研究中，我们成功构建了一种利用嵌合型HIV（EcoHIV）建立的活跃HIV感染大鼠模型。首先，在培养的293 FT细胞中包装EcoHIV的慢病毒载体，持续48小时。随后，收集条件培养基并进行浓缩和滴度测定。接下来，我们将EcoHIV-EGFP通过双侧立体定位注射至F344/N大鼠的脑组织中。感染一周后，在脑组织中检测到EGFP荧光信号，表明EcoHIV可在大鼠体内成功诱导活跃的HIV感染。此外，我们还对小胶质细胞标志物Iba1进行了免疫染色，结果显示小胶质细胞是携带EcoHIV的主要细胞类型。进一步发现，感染八周后，EcoHIV大鼠在时间感知处理方面出现异常，这可能是HAND潜在的神经行为学机制之一，同时伴有突触功能障碍。综上所述，本研究将EcoHIV的HIV-1感染模型扩展至大鼠，为研究脑内HIV-1病毒储存库以及HAND及其共病（如药物滥用）提供了一个有价值的生物系统。

收集感染EcoHIV-EGFP慢病毒的293FT细胞的条件培养基，随后进行浓缩和滴度测定，并通过立体定位注射至F344/N大鼠脑内（皮层区域）。注射后7天，处死大鼠，获取从前囟5.64 mm至前囟-4.68 mm范围的冠状脑切片图像。在图1A中，可见全脑范围内存在显著的EcoHIV-EGFP信号，尤其在皮层和海马齿状回区域。此外，Iba1与EcoHIV-EGFP探针的双标染色提供了有力证据，表明小胶质细胞是脑内携带EcoHIV表达的主要细胞类型（图1B）。值得注意的是，EcoHIV-EGFP的分布模式与大鼠脑内小胶质细胞在不同脑区的相对分布浓度一致（即皮层和海马齿状回）。
在后续研究中，我们验证了EcoHIV感染大鼠在模拟HIV相关性神经认知功能障碍（HAND）关键特征方面的实用性。采用上述详细方案，对F344/N大鼠进行立体定位注射EcoHIV-EGFP或生理盐水。首先，在感染后八周，评估了时间感知处理能力——这一功能可能是HAND的一个基本维度<sup cla...

本文介绍了一种利用嵌合型HIV病毒（EcoHIV）建立新型大鼠主动HIV感染模型的实验方案，该模型对于深入理解HIV-1在脑组织中的病毒储存库，以及研究HIV相关性神经认知功能障碍及其共病（如药物滥用）具有重要意义。

一种大鼠的EcoHIV脑部感染模型

已有大量研究表明，EcoHIV感染小鼠模型在研究HIV相关神经系统并发症方面具有重要意义。

利用大鼠，本方案可用于建立基于嵌合型HIV的新型主动HIV感染模型。通过大鼠建立EcoHIV感染模型，将有助于药物滥用与神经认知功能障碍的研究，进而推动神经HIV及HIV-1相关神经认知功能障碍的研究。示范实验操作的人员为本实验室研究助理Hailong Li。为了将病毒包装到293T细胞中，将每毫升含5×10⁵个293T细胞的DMEM培养基（添加10% FBS）接种至两个经明胶包被的75平方厘米培养瓶中，每瓶接种一份，于37°C培养，直至细胞融合度达到50%。转染当天，取22.5 µL转染试剂加入750 µL培养基中，于1.5 mL微量离心管中混匀，每瓶一份，涡旋振荡3秒。另取一1.5 mL微量离心管，每瓶加入20 µg嵌合型EcoHIV质粒DNA溶于750 µL培养基中，充分混匀。将稀释后的DNA与稀释的转染试剂轻轻混合，室温孵育15分钟。孵育结束后，将每种病毒悬液加入10毫升预热的DMEM培养基中，并将每种添加病毒的溶液加入一个含有293 T细胞的培养瓶中。细胞培养两天后，将各培养瓶中的上清液收集至一个50毫升的锥形管中，离心，然后将澄清的上清液转移至新的50毫升离心管中。向澄清的上清液中加入8毫升Lenti-X浓缩剂，轻轻颠倒混匀。在4摄氏度下孵育两天后，离心混合物并小心去除上清液，然后用100微升100毫摩尔的PBS轻轻重悬沉淀，使用P24 ELISA试剂盒测定病毒浓度。对于EcoHIV-EGFP注射，在确认无足底反射反应后，剃除脑区毛发，并用70%乙醇和含氯己定的消毒液对暴露的皮肤进行两次消毒。将大鼠俯卧位固定于立体定位仪中，沿头皮正中线做一条5至6厘米长的皮肤切口。在前囟外侧0.8毫米和前囟头侧1.2毫米处各标记一个钻孔位置，并在颅骨相应位置钻出直径为0.4毫米的孔。将滴度为1.04 × 10⁶转导单位/毫升的EcoHIV慢病毒溶液装入10微升注射器中，然后将注射器固定至立体定位仪上。将针头移至一个钻孔的表面附近，并将针头插入孔内2.5毫升深度。以每分钟0.2微升病毒液的速度注入1微升病毒溶液。当全部病毒注射完毕后，将针头在注射区域停留5分钟，然后缓慢回撤针头，直至完全退出大鼠颅骨。用4-0丝线缝合皮肤切口，并用70%乙醇消毒，然后将大鼠置于带有加热垫的恢复室中，持续监测直至其恢复卧姿。病毒注射后1至8周，在确认大鼠无足底反射反应后，将其仰卧固定于通风橱内，沿胸骨中线切开皮肤。剪开膈肌以暴露胸腔，将一根20号、25毫米长的针头插入左心室。立即用剪刀打开右心房，并以每分钟5毫升的流速灌注50毫升预冷的100毫摩尔PBS。当全部PBS灌注完毕后，再灌注100毫升冰冷的4%多聚甲醛。当全部固定液灌注完成后，将脑组织从颅骨中取出，并在新鲜的4%多聚甲醛中固定过夜。第二天早晨，将样品置于含有30%蔗糖的100毫摩尔磷酸盐缓冲液（PBS）40毫升中，放入50毫升离心管内，约三天，直至脑组织沉降至管底，随后在–80摄氏度条件下用甲基丁醇对脑组织进行速冻，持续两分钟。冷冻后，使用–20摄氏度的冷冻切片机和细毛刷获取50微米厚的冠状切片。当所有切片均制备完成后，每张切片上加入300微升抗荧光淬灭封片剂，并用22 × 50毫米盖玻片封片。待培养基干燥后，采用共聚焦显微镜对切片进行成像。慢病毒注射后第7天，大鼠冠状脑切片图像显示，EcoHIV-EGFP信号在脑组织中广泛存在，尤其在皮层和海马齿状回区域明显。通过Iba1与EcoHIV-EGFP探针的双重标记，提供了有力证据，表明小胶质细胞是脑内携带EcoHIV表达的主要细胞类型。感染后八周，注射EcoHIV的动物对刺激间隔时间变化的相对敏感性降低，表现为与生理盐水对照组相比，其间隔函数相对更为平坦。此外，注射EcoHIV的大鼠在树突棘形态上表现出显著改变，具体表现为与对照组动物相比，短树突棘的相对频率增加，且树突棘头部和颈部直径增大。在立体定位注射前，对条件培养基的浓度测定和滴定至关重要，以确保不同实验之间结果的一致性和可重复性。这种特定脑区的立体定位注射EcoHIV可在大鼠脑内实现高效的HIV感染，并导致时间信息处理能力的缺陷。在大鼠中采用立体定位HIV注射以扩展EcoHIV感染模型，为当前研究神经HIV相关的新问题提供了重要机遇。

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神经科学

生态HIV脑感染的老鼠模型

新生大鼠缺氧缺血性脑损伤模型是研究人类新生儿缺氧缺血性脑病（HIE）的一种成熟模型。本文描述了新生大鼠幼崽中HIE模型的建立方法。...

新生儿缺血性缺氧性脑病的围产期缺血模型

本视频演示了将嵌合型HIV病毒注射到大鼠脑皮层的操作步骤，其中病毒RNA会整合到宿主基因组中，进行复制并扩散，从而在实验模型中建立活跃的HIV感染。...

在大鼠模型中建立活性HIV感染

早产儿脑病包含与早产所致脑损伤相关的中枢神经系统异常. 本报告描述了一种具有临床相关性的大鼠模型 在子宫内...

利用产前缺氧缺血联合羊膜内注射脂多糖建立大鼠早产儿脑病模型

本文所述方案可在成年雄性Dark...

通过脑内注射促炎性细胞因子诱导广泛性大脑皮层脱髓鞘的大鼠模型

本文介绍了一种建立免疫健全的ICR（Institute of Cancer...

一种模拟登革病毒感染所致急性病毒性脑炎的小鼠模型

该 本研究旨在通过检测大鼠大脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）后1至90天的脑梗死及感觉运动功能，建立并验证一种用于脑缺血恢复期及后遗症期研究的动物模型。...

一种用于评估大鼠急性中风后脑功能恢复的临床前模型

本文介绍了一种疏水性组织透明化方法，可实现将目标分子作为完整脑结构的一部分进行观察。该技术现已在F344/N对照组和HIV-1转基因大鼠（两性）中得到验证。...

一种用于大鼠脑组织的疏水性组织透明化方法

早产儿脑出血后脑积水（PHHP）可通过在新生大鼠中联合建立绒毛膜羊膜炎和脑室内出血模型来模拟。这种产前与产后事件的结合能够终生准确再现PHHP的临床特征，包括巨头畸形、脑室扩大和颅内压升高。...

建立早产儿脑出血后脑积水的大鼠模型

本方案描述了EcoHIV感染与Tmem119-EGFP小鼠相结合，为研究与HIV相关的神经认知障碍啮齿类动物模型中小胶质细胞的改变及病毒储存库提供了一个有价值的生物系统。...

在小胶质细胞调控的转基因小鼠中鉴定EcoHIV感染细胞

本文介绍了一种诱导独特的大鼠双相情感障碍模型的实验方案，该模型可同时表现出类似躁狂和类似抑郁的行为。...

建立双相情感障碍的大鼠模型

了解如何使用EcoHIV建立大鼠HIV脑感染模型，通过立体定位注射研究HIV相关神经认知障碍。该模型利用小胶质细胞靶向和神经行为评估，为神经HIV研究提供重要工具。

一种大鼠的EcoHIV脑部感染模型

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