Name: 同源原位骨肉瘤Sprague Dawley大鼠模型，截肢控制转移率 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: 了解同源原位骨肉瘤大鼠模型的建立方法，通过胫骨植入UMR106细胞并结合截肢手术控制肺转移率。该免疫健全模型可用于研究肿瘤生物学、免疫相互作用及靶向治疗策略。

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美国国立卫生研究院国家癌症研究所资助，项目编号 CA228582。石山俊目前正在接受东丽医疗有限公司的资助。

所有涉及大鼠的操作和实验均根据约翰斯·霍普金斯动物护理和使用委员会批准的方案进行。
1. SD大鼠骨肉瘤细胞系UMR-106细胞培养方案
<ol>
	<li>在DMEM培养基中培养细胞，培养基中添加10% (v/v) 胎牛血清、青霉素（10 U/mL）-链霉素（10 U/mL），于37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中培养。实验使用第2至第8代的细胞12。</li>
</ol>
2. 骨肉瘤细胞胫骨内注射方案
注意：已配种的怀孕 SD 大鼠在动物房内分娩，出生后 3 周龄时使用其仔鼠（由于 UMR 106 细胞系与 SD 大鼠同源，无需进行照射处理）。
<ol>
	<li>诱导
	<ol>
		<li>将大鼠放入中等大小的诱导室中，使用 2%-3% 异氟烷诱导麻醉。通过脚趾夹捏反射、呼吸频率和呼吸特征持续监测动物的麻醉深度。</li>
		<li>将大鼠鼻部插入鼻罩。如有必要，用胶带固定。</li>
		<li>使用电动剪毛器或脱毛剂去除右侧腿部直至腹侧和背侧下腹部的毛发。将大鼠置于仰卧位。</li>
		<li>使用 70% 乙醇和稀释的醋酸氯己定或稀释的聚维酮碘对术区进行无菌擦拭。从膝关节周围开始，以环形动作向近端和远端擦拭。重复此步骤三次。肿瘤植入手术无需使用手术巾单覆盖。</li>
		<li>在大鼠双眼内涂抹眼用润滑剂，以防止麻醉引起的角膜干燥。将大鼠置于低温加热垫上。确保大鼠维持正常体温（37 °C）和正常呼吸频率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手术
	<ol>
		<li>开启异氟烷，维持浓度约为 1.5%-2%。通过脚趾夹捏无反应判断动物是否达到足够的麻醉平面。若无反应，可将异氟烷浓度提高至 2.5%。</li>
		<li>用记号笔在无菌针头（约 22 G）距针尖 10 mm 处做标记，以指导插入深度。</li>
		<li>将针头从膝关节弯曲处胫骨平台中点插入，进入胫骨干，通过轻度钻动方式穿过干骺端进入骨干，形成通路。随后拔出针头。</li>
		<li>在注射前立即向 Hamilton 注射器中装入细胞悬液。操作时，先轻轻混匀细胞，再吸取至注射器中，因为重力作用会使细胞沉降至管底。 
		注：细胞可在吸取至 Hamilton 注射器（100 µL）前，小心混匀后置于 1.5 至 2 mL 离心管中（室温）保存。在植入过程中，细胞可在室温下保存 2-3 小时。每次植入前后均应检测管中细胞的活力。台盼蓝排斥法是评估细胞活力最简便的方法。</li>
		<li>在骨通路建立后，将连接装有细胞的 100 µL Hamilton 注射器的第二根针头（直径较小，同样在 10 mm 处做标记）插入同一孔道，确保针头插入至 10 mm 标记处，进入骨干区域。</li>
		<li>缓慢注入 20 µL 含 75,000 个骨肉瘤（OS）细胞的 PBS 悬液至骨干及骨髓腔内。 
		注：针头在骨内不应晃动，应感觉稳固。若针头容易移动，可能已在骨干处穿透骨皮质。应重新插入，确保更稳固的定位后再进行细胞注射。</li>
		<li>将 Hamilton 针头从骨中拔出。 
		注：若穿刺部位出现少量血液，可施加轻压止血。若出现清亮液体渗出，提示针头可能未插入足够深度，导致肿瘤细胞悬液从孔道反流。应在记录中注明，但通常肿瘤植入仍可成功。随着操作经验积累，每只大鼠的肿瘤植入过程应可在 5 分钟内完成。随着熟练度提高，骨内细胞植入将变得更加容易。若不慎将细胞注射至骨周肌肉组织，可能无法形成肺转移所需的肿瘤微环境。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>恢复
	<ol>
		<li>确保大鼠体温正常。将大鼠放入笼中，并在笼下放置加热垫以助恢复。</li>
		<li>待大鼠完全清醒、可自主活动且呼吸良好后，皮下注射布托啡诺（1.0-1.2 mg/kg）。 
		注：如需获取布托啡诺，请咨询所在机构，了解通过兽医人员审批订购的相关流程。</li>
		<li>将大鼠转移回清洁笼具，并每周每天监测一次。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 测量与监测
<ol>
	<li>在植入后9-10天测量肿瘤大小，之后每2天测量一次，直至植入后3周，以确定肿瘤生长速率。使用电子或手动卡尺测量胫骨的最大直径。将数据存储在电子表格中，并使用公式计算肿瘤体积。以对侧（未植入的胫骨）作为基线进行测量。 
	注意：植入侧后肢的直径被用作肿瘤大小的替代指标。后肢测量时应垂直于胫骨长轴，在肢体最大直径处进行两次测量，分别为腹侧/背侧和内侧/外侧。肿瘤体积的估算公式11为：肿瘤体积（mm3）= 最大直径（mm）× 最小直径（mm）2/2。</li>
	<li>当肿瘤在最大径接近15 mm或在肿瘤植入后3周时，考虑对大鼠实施安乐截肢或化疗处理。在此年龄段，大多数大鼠对侧肢体的直径约为7-9 mm。</li>
</ol>
4. 阿霉素静脉注射给药
<ol>
	<li>用2%异氟烷麻醉大鼠。按照文献描述的方法13，使用聚维酮碘和酒精对颈静脉区域的皮肤进行三次外科清洗。</li>
	<li>在精细解剖下，暴露右侧或左侧颈静脉。将针头插入覆盖其上的肌肉，然后朝向大鼠头部方向推进，进入位于胸肌前方的颈静脉管腔，同时观察静脉位置。
	<ol>
		<li>当针头插入颈静脉后，轻轻回抽注射器以确认是否有血液进入，确保针头正确位于管腔内。有时可能误以为针头已穿过静脉，但实际上针头位于静脉下方而未进入管腔。若在钝性分离暴露颈静脉过程中发现静脉过细而不适合注射，可改用另一侧颈静脉进行注射。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在1分钟内缓慢注射阿霉素（2 mg/kg），注射体积为100–150 µL。给药过程中可在颈静脉内观察到静脉内溶液的流动。</li>
	<li>在对照组大鼠中注射等体积的生理盐水。</li>
	<li>拔出针头，并用无菌纱布对静脉施加轻柔压力止血。</li>
	<li>使用3–4个伤口夹关闭皮肤切口。注射后7–10天拆除夹子。 
	注意：大鼠通常不会试图去除金属夹，但会咬掉缝线。对于阿霉素注射而言，颈静脉注射优于尾静脉注射，因为药物若渗漏至血管外，会导致尾部坏死，可能需要截尾。</li>
</ol>
5. 后肢截肢方案
<ol>
	<li>诱导
	<ol>
		<li>将大鼠放入中等大小的诱导室中，使用 2%–4% 异氟烷诱导麻醉。持续监测大鼠的麻醉深度。 
		注意：诱导室连接至活性炭罐以清除废气，手术过程中产生的其他气体由下吸式操作台清除。</li>
		<li>将大鼠鼻部插入鼻罩。如有必要，用胶带固定。 
		注意：该操作在下吸式操作台上进行，以清除多余的挥发性气体（例如异氟烷）。</li>
		<li>使用电动剪或脱毛剂去除右侧后肢至腹侧和背侧下腹部的毛发。将大鼠置于仰卧位。</li>
		<li>使用 70% 乙醇和稀释的醋酸氯己定或稀释的聚维酮碘对术区进行无菌擦洗。从右后肢小腿中段至髋关节上方皮肤区域进行备皮。对腿部近端和远端区域进行环形擦洗。重复此步骤三次。</li>
		<li>在大鼠双眼内涂抹眼用润滑剂。确保大鼠体温正常（37 °C）且生命体征稳定。使用连接直肠温度探头监测仪的加热垫监测并调节体温。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手术
	<ol>
		<li>将异氟烷浓度调至 1.5%–3%（维持浓度）。监测麻醉深度，包括脚趾夹捏反应、呼吸频率和呼吸形态。根据需要调整异氟烷流速，以维持适当的麻醉水平。 
		注意：麻醉状态下的呼吸频率应为每分钟 50–100 次。深而稀少的呼吸提示大鼠麻醉过深。</li>
		<li>打开无菌器械包和手术巾，穿戴无菌手套。在整个操作过程中注意保持无菌状态。所需基本无菌手术器械包括：手术刀片持柄、镊子、止血钳、持针器、剪刀和伤口夹施加器。</li>
		<li>将大鼠后肢穿过无菌手术巾上的开口。通过脚趾夹捏反射确认大鼠处于适当的麻醉水平。</li>
		<li>使用手术刀片或手术剪，在膝关节（膝关节）近端稍上方做环形皮肤切口。</li>
		<li>使用纱布或钝性分离法剥离后肢皮下组织，暴露后肢腹内侧的股动脉和股静脉。</li>
		<li>在股骨中段水平使用 4-0 可吸收缝线结扎血管，并向远端切断。</li>
		<li>向远端夹闭静脉以减少肌肉分离过程中的渗漏。 
		注意：环形肌群将在股动脉结扎水平远端被切断，并从股骨剥离至髋臼股骨关节水平。</li>
		<li>使用钝性分离法，通过向外侧旋转使髋关节外展。</li>
		<li>找到股骨头并将其从髋臼中脱位。切断任何仍连接肢体与躯干的残留组织。</li>
		<li>向髋臼和坐骨神经注射约 6 mg/kg 的罗哌卡因进行浸润阻滞（splash block）。</li>
		<li>使用间断单纯缝合（4-0 可吸收缝线）关闭覆盖髋臼的肌肉组织。 
		注意：可在闭合的肌肉层多个部位额外注射 0.5% 布比卡因或利多卡因（总量 0.15–0.2 mg）进行局部浸润/浸润阻滞。</li>
		<li>使用伤口夹每间隔 5–10 mm 对合并闭合皮肤边缘。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>恢复
	<ol>
		<li>将大鼠放入清洁的恢复笼中，并在笼下放置加热垫提供热支持。 
		注意：为防止高热，加热垫不应直接接触动物，且温度不应超过 40 °C。</li>
		<li>持续监测动物直至其完全恢复且体温正常（37.5–39 °C）。 
		注意：在大鼠完全清醒、胸卧位且能在笼内自如活动前，不得无人看管。</li>
		<li>在大鼠完全清醒、可自主活动且呼吸良好后，皮下注射布托啡诺（1.0–1.2 mg/kg）。 
		注意：在麻醉状态下的大鼠中给予布托啡诺可能影响恢复。</li>
		<li>在肩胛间区皮下注射 10 mL 温热的乳酸林格液。</li>
		<li>将大鼠移回清洁笼具，并与同种动物合笼。</li>
		<li>在术后一个月内每日两次监测所有动物是否出现疼痛和痛苦的迹象，包括竖毛、弓背姿势或食欲减退，以及切口部位感染的迹象，如红斑、脓性分泌物或伤口裂开。 
		注意：截至目前，我们未在任何动物术后恢复期间观察到临床症状（如感染）。仅有一只大鼠出现带缝线的伤口裂开，之后改用伤口夹闭合伤口，未再发生问题。</li>
		<li>对于出现疼痛临床症状的动物，根据已发表剂量并在实验动物兽医指导下给予布托啡诺或美洛昔康。</li>
		<li>对于出现疼痛临床症状的动物，根据已发表剂量并在实验动物兽医指导下给予抗生素（例如头孢菌素）。 
		注意：任何表现出持续性疼痛或痛苦且镇痛药无效，或表现出感染迹象且抗生素治疗无效的动物，应实施人道安乐死。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. X射线成像
<ol>
	<li>肿瘤植入后，使用专为啮齿类动物设计的X射线设备，对胫骨和肺部进行无创成像，以检测肿瘤生长情况。</li>
	<li>按照之前的方法对大鼠进行麻醉。</li>
	<li>在25 kV条件下，以3倍放大倍数拍摄6秒的图像。</li>
	<li>使用X射线处理器处理胶片。X光片也可进行数字化扫描。</li>
</ol>
7. 尸体解剖程序
<ol>
	<li>用 CO2 处死大鼠，通过无心跳确认死亡，并立即从心脏采集 3 mL 血液以获取血清或血浆样本。</li>
	<li>打开胸腔和腹腔进行检查。</li>
	<li>分离气管并用（18 G）导管插管。为固定导管，在气管连同导管处用丝线缝合结扎。</li>
	<li>将灌注导管连接至 3 或 5 mL 注射器。灌注福尔马林或生理盐水，轻柔地使肺叶膨胀，以获得更佳的组织学标本。灌注后肺部会鼓起，有助于更清晰地观察肺转移灶。</li>
	<li>检查、解剖并称量所有选定的胸腔和腹腔器官（如肝脏、肾脏）。</li>
	<li>将器官置于福尔马林中固定以用于组织病理学检查，或在干冰、2-甲基丁烷或液氮中速冻保存。</li>
	<li>若需通过 Western blot 检测蛋白表达水平，可制备冷冻组织的裂解液。可识别大鼠组织的抗体详见文献13。</li>
</ol>
8. 免疫组织化学
<ol>
	<li>处理原发性骨肉瘤（OS）组织，进行石蜡包埋，并切片用于免疫组织化学染色。</li>
	<li>脱蜡后使用柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）进行抗原修复。用含0.3% H2O2的甲醇溶液于室温孵育30分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性。</li>
	<li>用正常血清对5 µm厚的石蜡切片进行封闭。</li>
	<li>加入抗CD68和CD3一抗（见表格），4 °C孵育过夜。</li>
	<li>用PBS缓冲液清洗切片，随后使用HRP聚合物检测试剂盒进行孵育。 
	注意：免疫染色以二氨基联苯胺（DAB）作为显色底物显色。</li>
</ol>
9. 蛋白质印迹法
<ol>
	<li>使用 200–300 µL 裂解缓冲液裂解 UMR-106 细胞，用于进行标准凝胶电泳和蛋白质印迹分析14。</li>
	<li>使用 4% 至 12% Bis-Tris 凝胶。</li>
	<li>用抗 ErbB2、抗 ErbB4、抗 EGFR、抗 ERK、β-actin 或抗小鼠 β2-AR 一抗（见表格）以及辣根过氧化物酶标记的二抗进行孵育。</li>
	<li>加入化学发光底物，将膜暴露于 X 射线胶片。 
	注意：β-actin 水平用作上样对照。</li>
</ol>

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</ol>

无须声明披露信息。

植入OS胫骨假体的大鼠在植入后3周即可形成可测量的肿瘤。若在植入后3周对患肢进行截肢，肺转移的发生率将显著降低。骨肉瘤（OS）兼具溶骨性和成骨性特征。未进行截肢的大鼠在植入后7周内通过放射学检查或尸检可观察到多个大小不一的肺转移灶。EGFR、ErbB2和ErbB4在大鼠UMR106骨肉瘤细胞中均有表达，这与人类骨肉瘤相似16,17,18。通过免疫组织化学方法可轻松检测到骨肉瘤组织中的CD3 T细胞和巨噬细胞。对于向骨肉瘤患者使用的化疗药物阿霉素的给药，颈静脉注射优于尾静脉注射。本文所述方法为完整的髋股骨截肢术。该手术方式是一种改进，可作为替代传统肿瘤切除手术（股骨截骨术）的选择，后者在切除肿瘤时保留骨残端8。该研究建议完全切除患肢，以降低术后疼痛和并发症的发生风险。
本方案中有若干关键步骤。首先，需要注意肿瘤细胞的传代次数，并在研究中使用较低传代次数...

骨肉瘤（OS）是儿童、青少年和年轻成人中最常见的原发性骨肿瘤。在20世纪80年代，多药联合化疗被证实相比单独手术可提高总体生存率，这是目前OS治疗领域最近的重大进展1。OS通常发生在快速骨生长期间，多见于股骨、胫骨和肱骨等长管状骨。其影像学特征表现为溶骨性、成骨性或混合性改变，并伴有明显的骨膜反应2。化疗联合手术切除可改善患者预后，使5年生存率达到65%2，3。然而，伴有转移性疾病的高级别OS患者的生存率仅为20%。OS具有局部侵袭性，主要转移至肺部或其他骨骼，且在男性中更为常见。这些年轻患者最迫切的需求是开发一种能够预防并清除远处转移灶活性的新型疗法。
骨肉瘤的临床前模型已有综述4,5,6,7，但目前采用原位骨肉瘤截肢方式构建的免疫健全模型仍较少。2000年，一项重要模型被建立，该模型使用BALB/c小鼠构建原位同基因骨肉瘤并实施截肢手术8。与该小鼠模型相比，大鼠模型基于遗传背景异质化且体型大10倍的动物，具有一些优势。UMR106大鼠模型源自经32P诱导Sprague Dawley（SD）大鼠产生的骨肉瘤，并由此建立细胞系9。2001年，首次报道将UMR106-01细胞植入无胸腺小鼠胫骨，可快速、稳定地形成原发肿瘤，其影像学和组织学特征与人类骨肉瘤相似。肿瘤可发生肺转移，且该过程依赖于将UMR106细胞植入骨微环境中的原位位置10。2009年，Yu等11在较大的雄性SD大鼠中建立了可重复的原位股骨骨肉瘤大鼠模型，使用UMR106细胞进行建模。在未行截肢的大鼠中，肿瘤成功植入率和肺转移率与本研究中所呈现的数据相似。本研究进一步在年轻大鼠模型中加入了截肢操作，提示原发肿瘤切除时机在模拟骨肉瘤（尤其是与转移进展相关）过程中至关重要。通过这一优化，截肢操作结合活体成像技术使该模型更适用于骨肉瘤新药评估的临床前研究。

<table><tbody><tr><td>AKT</td><td>Cell Signaling TECHNOLOGY</td><td>4685S</td><td></td></tr><tr><td>可吸收缝合线</td><td>Ethicon</td><td>J214H</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-肌动蛋白</td><td>SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY</td><td>sc-47778</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;2-肾上腺素能受体抗体</td><td>SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY</td><td>sc-569</td><td>已被 &amp;beta;2-AR (E-3): sc-271322 替代</td></tr><tr><td>Bis&amp;ndash;Tris 凝胶</td><td>Thermo Fisher</td><td>NP0321PK2</td><td></td></tr><tr><td>缓释型布托啡诺实验室制剂</td><td>ZooPharm</td><td>IZ-70000-201908</td><td></td></tr><tr><td>CD3 抗体</td><td>Dako</td><td>#A0452</td><td></td></tr><tr><td>CD68 抗体</td><td>eBioscience</td><td>#14-0688-82</td><td></td></tr><tr><td>化学发光底物</td><td>cytiva</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>CL-Xposure 胶片</td><td>Thermo Fisher</td><td>34089</td><td></td></tr><tr><td>完整麻醉系统</td><td>EVETEQUIP</td><td>922120</td><td></td></tr><tr><td>二氨基联苯胺</td><td>VECTOR LABORATORIES</td><td>SK-4100</td><td></td></tr><tr><td>多柔比星</td><td>Actavis</td><td>NDC 45963-733-60</td><td></td></tr><tr><td>EGFR 抗体</td><td>SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY</td><td>sc-03</td><td>已被 EGFR (A-10): sc-373746 替代</td></tr><tr><td>ERBB2 抗体</td><td>SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY</td><td>sc-284</td><td>已被 Neu (3B5): sc-33684 替代</td></tr><tr><td>ERBB4 抗体</td><td>SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY</td><td>sc-283</td><td>已被 ErbB4 (C-7): sc-8050 替代</td></tr><tr><td>ERK 抗体</td><td>SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY</td><td>sc-514302</td><td></td></tr><tr><td>眼用润滑剂</td><td>PHARMADERM</td><td>NDC 0462-0211-38</td><td></td></tr><tr><td>汉密尔顿微量注射器 (100 &amp;micro;L)</td><td>Hamilton</td><td>Model 1710 SN SYR</td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的二抗</td><td>cytiva</td><td>NA934</td><td></td></tr><tr><td>HRP 聚合物检测试剂盒</td><td>VECTOR LABORATORIES</td><td>MP-7401</td><td></td></tr><tr><td>HRP 聚合物检测试剂盒</td><td>VECTOR LABORATORIES</td><td>MP-7402</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>BUTLER SCHEIN</td><td>NDC 11695-6776-2</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷蒸发器</td><td>EVETEQUIP</td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>UMR-106 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1661</td><td></td></tr><tr><td>X 射线成像仪</td><td>Faxitron</td><td>UltraFocus</td><td></td></tr><tr><td>X 射线胶片处理器</td><td>Hope X-Ray Peoducts Inc</td><td>MicroMax X-ray Processor</td><td>Hope 品牌处理器已不再于美国市场供应</td></tr><tr><td>伤口夹</td><td>BECTON DICKINSON</td><td>427631</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于控制转移率的同系正位骨肉瘤sprague dawley大鼠截肢模型

A Syngeneic Orthotopic Osteosarcoma Sprague Dawley Rat Model with Amputation to Control Metastasis Rate

骨肉瘤（OS）治疗的最新进展出现在20世纪80年代，当时多药联合化疗相比单独手术被证明可提高总体生存率。为解决这一问题，本研究旨在优化一种在大鼠中尚不广为人知的骨肉瘤模型，通过全面的组织学、影像学、生物学、移植及截肢外科方法，延长动物生存期。我们采用免疫功能健全、远交系的Sprague-Dawley（SD）大鼠，植入源自SD大鼠的UMR106骨肉瘤细胞系，并在3周龄的雄性和雌性大鼠胫骨原位接种肿瘤，以模拟儿童骨肉瘤。研究发现，大鼠可稳定形成原发性肿瘤及肺转移性肿瘤，且在接种后3周进行肢体截肢可显著降低肺转移的发生率，并防止意外死亡。组织学分析显示，大鼠的原发性和转移性骨肉瘤与人类骨肉瘤非常相似。通过免疫组织化学方法，研究显示大鼠骨肉瘤组织中浸润有巨噬细胞和T细胞。对骨肉瘤细胞的蛋白质表达谱分析表明，这些肿瘤表达ErbB家族激酶。由于这些激酶在大多数人类骨肉瘤中也高度表达，因此该大鼠模型可用于测试靶向ErbB信号通路的抑制剂治疗效果。

这些骨肉瘤研究采用免疫健全的SD远交系大鼠，提供具有完整免疫系统的动物模型。我们使用了来自ATCC的UMR106细胞系，该细胞系源自最初从SD大鼠骨肉瘤组织中分离的细胞。将这些细胞植入SD大鼠体内，从而建立骨肉瘤的同源性模型。将UMR106细胞植入3周龄雄性和雌性SD大鼠的胫骨中，模拟儿童骨肉瘤模型。此外，将UMR106细胞原位植入胫骨干骺端/骨干区域，可形成相关的肿瘤微环境。
植入肿瘤细胞时，必须以正确的角度（与骨干平行）将针头准确插入胫骨平台(图1)，并将针尖深入骨中央腔约10 mm。采用该方法，95%（52/55）的大鼠在膝关节远端的胫骨中形成肿瘤。具备胫骨注射经验后，肿瘤形成率达到100%。在一组未进行截肢的大鼠中，雄性大鼠植入后3周的平均肿瘤体积为504 mm3，5周时为1195 mm3；雌性大鼠在植入后3周的平均肿瘤体积为285 mm3，5周时为495 mm3。
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本文描述了一种同基因型原位移植后行截肢手术的小鼠骨肉瘤伴自发性肺转移模型，可用于转移生物学的临床前研究及新型治疗药物的开发。

一种用于控制转移率的同系正位骨肉瘤Sprague Dawley大鼠截肢模型

骨肉瘤（OS）治疗的最新重大进展出现在20世纪80年代，当时多药联合化疗被证实可提高总体生存率……

将成骨肉瘤细胞植入胫骨微环境中可促进肺转移。该模型还可用于研究肺转移的机制或需要完整免疫系统的新型癌症治疗方法。一旦肿瘤建立，为了在长期生存研究中控制转移速率，必须进行截肢手术。我们采用颈静脉注射以实现静脉给药过程的可视化。颈静脉注射适用于多种需要精确给药的疾病模型。我们已利用该方法递送纳米颗粒和放射性标记配体，用于活体成像。我们建议新用户在尝试实验前，先在5至10只已实施安乐死的大鼠身上练习断肢操作，以掌握无出血条件下断肢的机械步骤。确认阴茎退缩反射消失后，将麻醉后的大鼠仰卧位固定于带有鼻罩的低热加热垫上。去除右侧后肢的毛发，范围延伸至腹侧和背侧下腹部。使用纱布或喷雾器，以70%乙醇和适当稀释的消毒剂对术区进行消毒，并在动物眼睛上涂抹眼膏。采用类似钻孔的动作，在胫骨平台中点处将一根在距针尖10毫米处做有标记的22号针头插入胫骨骨干10毫米深，使针头穿过干骺端进入骨干。拔出针头后，轻轻混匀目标肿瘤细胞悬液以获得均匀的细胞悬液，并将20微升磷酸盐缓冲液（PBS）中含7.5 × 10⁴个细胞的悬液装入汉密尔顿注射器中。用记号标记Hamilton注射器，使细胞位于针尖前10毫米处，并将针头插入由22号针头所打孔洞中至10毫米标记处。然后轻柔地将全部细胞体积注入骨髓腔，并将大鼠置于带有加热垫的笼中，持续监测直至完全恢复卧位。对于静脉注射阿霉素，在确认麻醉成功后，仔细解剖以暴露右侧或左侧颈静脉，并将针头插入其上方的肌肉组织中。将针头朝向头部方向插入颈静脉管腔，该静脉位于胸大肌前方，超声下可见。抽取少量血液进入针尖，以确认针头位置准确。针头就位后，于一分钟内缓慢注射每公斤体重2毫克的阿霉素溶液100至150微升。给药过程中应能观察到溶液在静脉内流动。当所有溶液输注完毕后，使用无菌纱布对静脉施加轻柔压力，并用三到四个伤口夹闭合切口。确认动物已镇静后，去除右后肢的毛发，范围延伸至腹侧和背侧下腹部，将大鼠仰卧位放置于加热垫上。按照示范方法，从右后肢小腿中部至髋关节上方区域进行皮肤消毒，并在动物眼睛上涂抹眼膏。使用无菌手套和器械，将腿部穿过无菌手术单的开口，于膝关节近端做一周围皮肤切口。剥离后肢皮肤，暴露后肢腹内侧的股动脉和股静脉，使用4-0可吸收缝线在股骨中段水平结扎血管，并远端离断。远端夹闭静脉以减少肌肉解剖过程中的渗漏，采用钝性分离技术，通过向外侧外旋牵拉使髋关节脱位。找到股骨头并将其从髋臼中分离，清除所有残留组织，同时保持腿部与身体相连。使用约每公斤6毫克的罗哌卡因对髋臼和坐骨神经进行局部浸润阻滞，然后用4-0可吸收缝线间断缝合髋臼上方的肌肉组织。随后使用间距为5至10毫米的伤口夹闭合皮肤边缘。用于肿瘤监测的X射线成像可确认骨肿瘤的侵袭情况，适用于近期截除或福尔马林固定的肢体。X射线成像还可评估肺部的影像学形态，无论是否存在转移灶，从而快速简便地判断是否需要实施安乐死，以避免不必要的自然死亡。在大鼠骨肉瘤模型中，截肢标本的组织病理学检查可进一步证实溶骨性及成骨性肿瘤的形态特征。请注意，此例中皮质骨缺失，相邻的骨组织已被新生的编织骨替代或加固，且编织骨的方向与原有皮质骨骨干垂直。肿瘤内还可辨认出不成熟的类骨质岛。在这些图像中，可观察到具有代表性的肺转移灶的显微形态，部分转移灶内可见矿化的骨组织及肿瘤血管栓子。对原发性骨肉瘤肿瘤进行免疫染色可揭示免疫细胞群体对肿瘤的浸润情况，例如 CD68 阳性巨噬细胞或 CD3 阳性 T 细胞。通过蛋白质印迹法（Western blotting）检测肿瘤细胞蛋白裂解液，可用于确定蛋白激酶、蛋白激酶受体以及其他与这些信号通路相互作用的蛋白的表达水平。在进行胫骨植入时，一旦完成第一个胫骨孔的制备，应继续用非优势手以相同角度固定腿部，以确保皮肤切口与骨孔对齐，从而更便于插入 Hamilton 针头。进行颈静脉注射时，将针头插入肌肉，但不要过度倾斜针头，以免错过静脉。对于截肢操作，应先在已实施安乐死的大鼠上练习离断技术。

a-syngeneic-orthotopic-osteosarcoma-sprague-dawley-rat-model-with

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

同源原位骨肉瘤Sprague Dawley大鼠模型，截肢控制转移率

为了研究 体内 肿瘤生长与肿瘤微环境，我们采用免疫功能健全动物中的同源性、原位卵巢癌小鼠模型。我们将小鼠肿瘤细胞系（MOV1）转导表达Katushka荧光蛋白（MOV1）KAT）在此我们展示其在卵巢中的原位移植 体内 成像...

用于免疫健全小鼠的浆液性卵巢癌原位模型 体内 肿瘤成像与肿瘤免疫应答的监测

介绍了一种通过将II-45间皮瘤细胞植入免疫功能正常大鼠的胸膜腔来建立胸膜恶性间皮瘤原位大鼠模型的方法。同时还描述了一种流式细胞术方法，可用于从25...

II-45同系大鼠间皮瘤模型中的原位移植及外周免疫细胞监测

本文描述了一种原位乳腺癌原发肿瘤模型，以及通过手术切除原发肿瘤以延长小鼠生存期从而产生自发性转移的方法。肿瘤的生长和进展通过荧光素酶成像进行监测和定量。...

一种自发性乳腺癌转移的原位小鼠模型

直接注射癌源性细胞外囊泡（EVs）可导致骨髓重编程，从而促进肿瘤进展；然而，介导这一效应的具体细胞类型尚不明确。本文中，我们描述了一种逐步操作的实验方案，用于研究EV介导的肿瘤-间充质干细胞（MSC）相互作用。...

一种用于定义肿瘤细胞与间充质干细胞间由细胞外囊泡介导通讯的骨肉瘤小鼠临床前模型

在本方案中，我们描述了一种用于测试（新）辅助治疗的软组织肉瘤不完全手术切除的小鼠模型。...

一种用于测试（新）辅助治疗的软组织肉瘤不完全切除小鼠模型

本方案旨在训练一种机器学习算法，在乳腺癌骨转移的大鼠模型中，利用磁共振成像（MRI）和正电子发射断层扫描/计算机断层扫描（PET/CT）获得的多种成像参数组合，以检测早期转移性疾病，并预测其后续进展为大转移灶的情况。...

用于实验大鼠模型中骨转移早期检测的机器学习算法

骨转移模型的转移发生并不均匀，且发生率并非100%。直接骨内注射肿瘤细胞可能导致肺栓塞。我们提出一种通过将实体瘤移植物植入骨骼来模拟原发性骨肿瘤和骨转移的技术，该方法可实现可重复的移植物植入与肿瘤生长。...

利用实体瘤移植物骨内植入建立原发性骨肿瘤与骨转移模型

本实验方案描述了通过胫骨内注射骨肉瘤细胞，建立携带原位骨肉瘤及肺转移病灶的小鼠模型。...

胫骨内骨肉瘤细胞注射法建立原位骨肉瘤及肺转移小鼠模型

本方案描述了利用人骨肉瘤组织建立患者来源的异种移植（PDX）小鼠模型的方法。...

建立人骨肉瘤组织来源的患者异种移植小鼠模型

本实验方案概述了通过卵巢切除术建立大鼠骨-肌肉减少症模型的操作步骤。...

通过卵巢切除术建立骨-肌肉减少症大鼠模型

了解同源原位骨肉瘤大鼠模型的建立方法，通过胫骨植入UMR106细胞并结合截肢手术控制肺转移率。该免疫健全模型可用于研究肿瘤生物学、免疫相互作用及靶向治疗策略。

一种用于控制转移率的同系正位骨肉瘤Sprague Dawley大鼠截肢模型

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