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方法文章

通过免疫染色与原位杂交联合检测小鼠嗅觉感觉神经元的激活 原位 杂交

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⸱

DOI：

10.3791/62150

⸱

2021年4月11日

 ,  , 
1Department of Genetics, Evolution, Microbiology and Immunology, Institute of Biology, University of Campinas, 2Graduate Program in Genetics and Molecular Biology, Institute of Biology, University of Campinas

本文内容

摘要

本方案结合 原位 通过化学刺激激活小鼠嗅觉感觉神经元后，利用原位杂交与免疫荧光联合技术鉴定其表达的嗅觉及犁鼻器受体基因。

摘要

动物依赖化学通讯来传递和感知相关的环境信息，这些信息范围从食物质量的评估到可利用的交配伙伴或威胁的探测。在小鼠中，这一功能主要由嗅觉系统及其下属的亚系统（包括主嗅觉系统和副嗅觉系统）来执行。这两个系统均具有外周器官，其内分布着表达G蛋白偶联受体的感觉神经元，这些受体能够结合到达鼻腔的化学信号分子。尽管这些受体的分子特性已被广泛阐明，但对其特异性配体的了解仍十分有限。本文所述方法结合了原位杂交技术对嗅觉或犁鼻器受体的检测，以及对磷酸化核糖体蛋白S6（pS6）——一种神经元激活标志物——的免疫检测。 原位 嗅觉或犁鼻器受体的原位杂交检测与磷酸化核糖体蛋白S6（pS6）免疫检测相结合——pS6是神经元激活的标志物。该方案旨在鉴定嗅觉器官检测到纯化或复杂化学刺激后，在单次暴露事件中被激活的神经元。重要的是，该技术可用于研究在生物学相关情境下被触发的神经元。理想情况下，该方法可用于探究嗅觉系统的分子生物学机制以及嗅觉相关行为。

引言

化学通讯是动物界中最普遍的交流形式。在哺乳动物中，化学信号的检测主要通过嗅觉实现，对寻找食物、定位潜在交配对象以及躲避潜在捕食者至关重要1,2,3。小鼠的嗅觉系统进一步划分为不同的亚系统，每个亚系统具有独特的解剖学、生理学和分子特性4。其中，主嗅觉系统（MOS）和副嗅觉系统（AOS）是目前研究最广泛且特征最清晰的两个系统。

主嗅觉系统（MOS）主要负责检测到达鼻腔的挥发性化学分子。这一功能由主嗅觉上皮（MOE）中的嗅觉感觉神经元（OSNs）实现，OSNs构成了该系统的感觉界面。每个OSN以单基因和单等位基因的方式表达数千种嗅觉受体（ORs）中的一种5。此外，ORs通常具有较宽的调谐特性6，单个气味分子可结合多种OR，从而形成气味的组合编码7。

而副嗅觉系统（AOS）主要负责信息素和克里摩那素的检测。这些配体可激活犁鼻器（VNO）中的犁鼻感觉神经元（VSNs）。位于VNO顶端区域的VSNs表达犁鼻受体1家族（V1Rs）

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方案

动物实验程序均依照坎皮纳斯大学（生物研究所机构动物护理和使用委员会——动物实验研究伦理委员会）批准的动物实验方案 #1883-1 进行，该方案遵循巴西联邦动物实验控制国家委员会（CONCEA）制定的指导方针。

1. 材料准备

  1. 在1× PBS中配制1 L的3% H2O2（v/v）。将100 mL 10× PBS和100 mL 30% H2O2加入500 mL超纯水中，再用超纯水定容至1 L。该溶液需现用现配。
  2. 准备一个加湿染色缸，内置用5× SSC溶液润湿的无尘实验室擦拭纸片。
  3. 配制杂交洗涤液：5× SSC（55 °C）、2× SSC（55 °C）、0.2× SSC（55 °C）和0.1× SSC（55 °C及室温）。将适当体积的20× SSC储备液溶于无RNase的超纯水中。每次实验开始前需新鲜配制稀释后的溶液。
  4. 配制免疫组织化学封闭液：1× PBS/1% BSA/0.1% Triton X-100。配制100 mL时，将10 mL 10× PBS、10 mL 10% BSA和3.33 mL 3% Triton X-100加入70 mL超纯水中，再用超纯水定容至100 mL。每次实验开始前需新鲜配制。
  5. 配制PTw溶液：1× PBS/0.1% Tween-20。配制100 mL时，将1 m....

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结果

本方案旨在获取显微图像，其中实验者关注的目的基因与神经元活性标志物 pS6 均实现荧光标记。所描述的方法采用酪酰胺信号放大技术（Tyramide Signal Amplification），可产生清晰且强烈的标记信号，背景几乎无干扰。pS6 免疫染色呈现为胞质荧光信号，通常充满整个神经元胞体，而 原位 嗅觉受体神经元的杂交信号表现为细胞质染色。pS6 是嗅觉神经元激活的瞬时标志物，因此在感觉器官固定前1小时内被激活的细胞中，相应的免疫染色信号会更强。只要使用适当的带通显微滤光片，pS6 与受体染色之间的荧光串扰不应出现。

通过标记区域可以评估两种染色之间的共定位，从而识别出在所研究的激活神经元群体中表达的基因。图2A、B显示了暴露于猫气味的小鼠的犁鼻器图像，其中A4分支V2R受体与pS6信号发生共定位，表明表达这些嗅觉受体的神经元被所使用的刺激激活。相反，当激活的神经元不表达待研究的嗅觉受体时，则预期不会出现信号之间的共定位（图2.......

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讨论

本方案通过结合嗅觉受体（OR）或犁鼻器受体（VR）的原位检测与神经元活动间接标志物——磷酸化核糖体蛋白S6（pS6）的免疫检测，可靠地鉴定嗅觉系统中被化学信号激活的感觉神经元。实验人员必须格外注意保持组织学完整性，并在杂交前的所有步骤中严格采用无RNase的条件操作，否则可能导致mRNA降解，影响核苷酸探针的标记效果。在解剖嗅觉器官时需格外小心，因为未固定的组织极为脆弱，容易受损。

原位杂交 本方案中的杂交包含两轮信号放大步骤，需注意荧光强度可能受杂交或信号显色相关因素的影响。例如，孵育温度和时间必须通过实验优化。标记信号弱可能源于探针浓度过低、杂交温度过高或酪胺标记时间过短；相反，背景过高可能由杂交温度过低或酪胺孵育步骤中显色过度所致。这些参数需调整至获得最佳信噪比（详见表1中的系统性故障排查讨论）。

类似地，pS6 免疫检测可能导致荧光强度较低或背景染色较高。这些问题通常源于酪胺孵育步骤时间不当、封闭不充分或内源性过氧化物酶淬灭不充分（Table 1）。.......

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披露

作者声明不存在任何竞争性利益。

致谢

感谢 GAG Pereira 和 JA Yunes 提供的资源，APF Ferreira 和 WO Bragança 提供的行政与技术支持，以及圣保罗州立大学生命科学核心设施（LaCTAD-UNICAMP）工作人员在共聚焦显微镜方面的帮助。本研究由圣保罗研究基金会（FAPESP；项目编号 2009/00473-0 和 2015/50371-0，授予 F.P.）、圣保罗州立大学研究与研究生事务处（PRP/UNICAMP；项目编号 2969/16、725/15、348/14 和 315/12，授予 F.P.）提供资助。V.M.A.C. 获 FAPESP 博士后基金（项目编号 2014/25594-3、2012/21786-0、2012/01689-0），T.S.N. 获 FAPESP 博士后基金（项目编号 2012/04026-1）及巴西高等教育人员改进协调机构（CAPES）博士后基金资助。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10x 磷酸盐缓冲液（PBS）Thermo Fisher ScientificAM9625n/a
20倍扩增稀释液（反应缓冲液来自 Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost 试剂盒Thermo Fisher ScientificB40923 或 B40922在酪胺-Alexa 488 或酪胺-Alexa 555 信号扩增的工作溶液中称为扩增缓冲液 A
20x SSC默克（Calbiochem）8310-OPn/a
30% 牛血清白蛋白（BSA）默克（Sigma-Aldrich）A9576n/a
30% 过氧化氢（H2O2)默克（Sigma-Aldrich）H1009n/a
乙酸酐默克（Sigma-Aldrich）320102n/a
琼脂糖默克（Sigma-Aldrich）A9539n/a
扩增稀释液（来自 TSA Biotin 试剂盒）Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EA工作溶液中用于酪胺-生物素信号扩增的扩增缓冲液B
抗-pS6（Ser 244/247）兔多克隆抗体Thermo Fisher Scientific货号 44-923G，RRID:AB_2533798n/a
封闭缓冲液1x（来自Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost试剂盒）Thermo Fisher ScientificB40923 或 B40922在酪胺信号放大步骤中称为封闭液B
封闭试剂（来自TSA Biotin试剂盒）Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EA在TNB缓冲液配方中称为A型封闭试剂
DAPI 核染色Thermo Fisher ScientificD1306n/a
Denhardt's 溶液（50x）默克（Sigma-Aldrich）D9905n/a
去离子甲酰胺默克（Sigma-Aldrich）F9037n/a
右旋糖酐硫酸钠溶液（50%）默克（Chemicon）S4030n/a
乙二胺四乙酸（EDTA）默克（Sigma-Aldrich）E9884n/a
Hoechst 33342 核染色Thermo Fisher ScientificH1399n/a
盐酸（HCl）默克（Sigma-Aldrich）320331n/a
嗅觉刺激n/aPapes 等（2010），Carvalho 等（2015），Nakahara 等（2016），Carvalho 等（2020）n/a
多聚甲醛默克（Sigma-Aldrich）P6148n/a
辣根过氧化物酶偶联的抗地高辛抗体（Fab 片段）默克（罗氏）11207733910; RRID:AB_514500称为辣根过氧化物酶偶联的抗DIG抗体
辣根过氧化物酶偶联的抗兔二抗（辣根过氧化物酶多聚体偶联的山羊抗兔试剂，来自 Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost 试剂盒Thermo Fisher ScientificB40922n/a
辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（来自TSA生物素试剂盒）Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAn/a
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂Thermo Fisher ScientificP36934抗荧光淬灭封片剂
无RNase超纯水Thermo Fisher Scientific10977015n/a
氯化钠（NaCl）默克（Sigma-Aldrich）S9888n/a
十二烷基硫酸钠（SDS）默克（Sigma-Aldrich）436143n/a
氢氧化钠（NaOH）默克（Sigma-Aldrich）S8045n/a
蔗糖默克（Sigma-Aldrich）S0389n/a
三乙醇胺默克（Sigma-Aldrich）T58300n/a
Triton X-100默克（Sigma-Aldrich）X100n/a
Trizma盐酸盐（Tris-Cl）默克（Sigma-Aldrich）T5941n/a
Tween-20默克（Sigma-Aldrich）822184n/a
Tyramide-Alexa 488 偶联物（来自 Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost 试剂盒）Thermo Fisher ScientificB40922n/a
Tyramide-Alexa 555 偶联物（来自 Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost 试剂盒）Thermo Fisher ScientificB40923n/a
TSA 生物素试剂盒中的酪胺-生物素偶联物Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAn/a
酵母tRNA默克（罗氏）10109495001n/a
关键商业试剂盒与实验动物
Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost 试剂盒Thermo Fisher ScientificB40922n/a
Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost 试剂盒Thermo Fisher ScientificB40923n/a
DIG RNA标记试剂盒（SP6/T7）默克（罗氏）11175025910n/a
高灵敏度RNA ScreenTape分析试剂（缓冲液、标准品和胶带）安捷伦5067-5580、5067-5581 和 5067-5579称为自动电泳系统
小鼠：C57BL/6J 近交系杰克逊实验室货号： 000664; RRID:IMSR_JAX:000664n/a
ProbeQuant G-50 Micro 柱Cytiva 生物科学28903408称为基于凝胶过滤的纯化试剂盒
QIAquick 凝胶回收试剂盒Qiagen28506称为基于微型柱的凝胶纯化试剂盒
RNeasy MinElute 纯化试剂盒Qiagen74204被称为基于微型柱的RNA纯化试剂盒
TSA Biotin试剂盒Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAn/a
寡核苷酸
5’ – AAACTTCATCCTTACAGAATGG
CAG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr692
5’ – ACTGGCTTTGGGACAGTGTGAC – 3’Integrated DNA Technologiesn/a
5’- GGTAATATCTCCATTATCCTAGTT
TCCC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr124
5’ – TTGACCCAAAACTCCTTTGTTAG
TG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – ATGGGAGCTCTAAATCAAACAA
GAG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr1509
5’ – TAGAAAACCGATACCACCTTGTC
G – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TACATCCTGACTCAGCTGGGGA
ACG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr1512
5’ – GGGCACATAGTACACAGTAACA
ATAGTC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – GAGGAAGCTCACTTTTGGTTTG
G – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr78
5’ – CAGCTTCAATGTCCTTGTCACA
G – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TGGGTTGGAGGCTTATCATACC
TG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr691
5’ – AAGAACAACACAGAGTCTTGAT
GTC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – AGAAGTAACTAACACCACTCAT
GGC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr638
5’ – TTAGTGCACCTTTCTTTGCAAC – 3’Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TAACAGCTCTTCCCATCCCCTG
TTC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr569
5’ – TAGGGTTGAGCATGGGAGGAAC
AAGC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – CACTGGATCAACTCTAGCAGCA
CTG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r1
5’ – CTGCCCTTCTTGACATCTGCTG
AG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – ATCGGATCCACTGCTTTAGCATT
TCTTACAGGACAG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r2
5’ – ATCCTCGAGTCATGCCTCTCCAT
AAGCAAGGAATTCCAC – 3'		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TAGGAAGCTATTTGCCTTGTTTC
CAC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r13
5’ – AGGAGATTTTACCAACCAGATTC
CAG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – CTCTAAGAACAGCAGTAAAATGG
ATCT – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r89
5’ – ATGGGAATGACCAACTTAGGTGC
A – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – ATCCCATGGCTGAGAACATGTGC
TTCTGGAG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r118
5’ – ATCCTCGAGTCAGTCTGCATAAG
CCAGATATGTCAC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – ATCGGATCCGCTGATTTTATTTCT
CCCAGATGCTTTTGG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r116
5’ – ATCCTCGAGTCATGGTTCTTCAT
AGCTGAGAAATACAAC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TGGGTGTCTTCTTTCTCCTCAA
GA – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r28
5’ – GGTGACCCATATTCTCTGTATAA
CTGT – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – GATGTTCATTTTCATGAGAGTCT
TCC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r41
5’ – CATTTGTGGATGACATCACAATT
TGG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TTTATGGCAAATTTCACTGATCCC
G – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r46
5’ – AGTGGGTCTTTCTTAGAAAGGAG
TG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – ACATGAACCAGAATTTGAAGCAG
GC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r69
5’ – GCCAAGAAAGCTACAGTGAAAC
C – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – AGGTGAAGAAATGGTATTCTTCC
AG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r58
ACTGTGGCCTTGAATGCAATAACT – 3’Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TTCCTAAAGAACACCCTACTGA
AGCATCG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r90
5’ – CATATTCCACAGAAGAGAAGT
TGGAC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TTGAGGTGAGAGTCAACAGT
TTAGAC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r107
5’ – CCCTTGTTGCACAAAATGAT
GATGTGA – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – ATCCCATGGAGTCAGAGTAT
CTACTACACCATGATGG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r83
5’ – ATCCTCGAGTCAATCATTAT
AGTCCAGAAAGGTGACAG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
重组DNA
pGEM-T-Easy 载体PromegaA1360推荐的PCR克隆载体
其他材料
1 mL 注射器Fisher Scientific14-829-10Fn/a
锥形管（15 mL 和 50 mL）Fisher Scientific14-432-22, 14-959-49Bn/a
考普林罐Fisher Scientific12-567-099, 07-200-81n/a
冷冻切片机Leica BiosystemsCMS 1850n/a
解剖工具和镊子RobozRS-6802, RS-8124, RS-7110, RS-5111n/a
干浴器n/an/an/a
电泳设备Fisher Scientific09-528-110Bn/a
精细尖头画笔Winsor & 牛顿10269097n/a
荧光或共聚焦显微镜Leica MicrosystemsTCS SP5IIn/a
加热板Fisher ScientificHP88850200n/a
加湿室（若在较高温度下使用，需将其密封于塑料保鲜盒内）Thermo Fisher Scientific22-045-034n/a
无尘实验室擦拭纸Kimberly-Clark34120称为无绒实验室擦拭纸
微型离心机Eppendorf5401000013n/a
小鼠笼具InnoViveM-BTM，MVX1n/a
PCR热循环仪Thermo Fisher Scientific4375786n/a
移液器 p1000、p200 和 p20 一次性吸头Fisher Scientific02-707-408, 02-707-411, 02-707-438n/a
塑料组织学包埋模具Thermo Fisher Scientific22-19n/a
Qubit 4 氟光计Thermo Fisher ScientificQ33238被称为高灵敏度荧光测定法
剃须刀片或手术刀Fisher Scientific12-640n/a
RNA 毛细管电泳仪或 BioAnalyzer安捷伦4200 TapeStation 系统或 2100 Bioanalyzer 仪器n/a
无RNase的玻璃或塑料量筒和烧杯Fisher Scientific10-462-833, 02-555-25B, 02-555-25Dn/a
体视显微镜Leica MicrosystemsM80n/a
SuperFrost Plus 显微镜载玻片Thermo Fisher Scientific12-550-15称为带正电荷的显微镜载玻片
ParafilmBemis CompanyPM999称为热塑性实验室膜
水浴锅Thermo Fisher ScientificTSCIR19n/a

参考文献

  1. Stowers, L., Holy, T. E., Meister, M., Dulac, C., Koentges, G. Loss of sex discrimination and male-male aggression in mice deficient for TRP2. Science. 295 (5559), 1493-1500 (2002).
  2. Chamero, P., et al. Identification of protein pheromones that promote aggressive behaviou....

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