带有可移动XY载物台的培养箱平台：一种用于细胞内快速光化学蛋白质氧化的新平台

该方法为当前复杂的生物学问题提供了有效的解决方案。通过细胞内FPOP实验，我们可以研究蛋白质-配体相互作用、蛋白质-蛋白质相互作用位点以及构象变化区域。该技术的优势在于采用了一种自动化的基于六孔板的IC-FPOP平台，可在激光器旁直接进行细胞培养并开展细胞内FPOP研究。

该方法可应用于制药和生物技术行业，以及主要的学术和临床研究机构，尤其适用于大学中研究蛋白质动态的生物研究人员。首先，将平台培养箱从定位台上拧下，并断开温度、气体和加湿管路。用70%乙醇喷洒培养箱，然后将其放入细胞培养操作台中。

从平台培养箱中取出六孔板，盖上六孔板原有的盖子，使用显微镜确认细胞融合度，然后将已融合细胞的六孔板放回细胞培养罩内的平台培养箱中。通过嵌入式端口将三根预先裁剪好的Tygon管插入每个孔中，将管子冲洗至孔壁，并用定制的3D打印环固定。准备用于泵吸液的集成软件程序脚本。

使用一台蠕动泵将所有六个孔中的细胞培养基完全移除。用溶剂预润另一台三通道蠕动泵的每个通道，然后分别向交替的管路中注入过氧化氢和淬灭缓冲液，直至试剂到达孵育箱端口。确认激光束已正确调整角度，并无障碍地到达孵育箱。

使用外部传感器检测激光能量。在确认光束准直后，准备用于泵注的积分软件脚本。以每分钟35毫升的流速向第一个孔中注入200毫摩尔的过氧化氢。

在计时器显示5秒时，按下激光软件上的启动按钮，以在11秒时触发激光脉冲。激光脉冲结束后，立即以每分钟35毫升的流速向第一个孔中注入125毫摩尔的淬灭溶液。手动移动定位平台，使下一个孔与激光束对齐，并对所有孔重复此过程。

在细胞培养超净台中，使用细胞刮将每个孔中的细胞转移至单独的15毫升锥形管中。以1,200 × g离心5分钟。弃去上清液，并将细胞重悬于100微升RIPA裂解缓冲液中。

将细胞转移至各个1.2毫升聚丙烯管中。用液氮迅速冷冻所有样品，随后置于-80°C冰箱中保存备用。为定位FPOP修饰位点，使用液相色谱-串联质谱分析法分析经消化的细胞裂解液，然后计算修饰程度。

为了确认激光平台上的培养箱条件足以支持细胞培养，将GCaMP2瞬时转染至HEK293T细胞中，并通过荧光成像评估两块培养板的转染效率。同时进行荧光素酶检测以定量转染效率。比较了在流动系统中标记与在平台培养箱中标记的HEK293T细胞中的FPOP修饰情况。

在被修饰的蛋白质数量以及这些蛋白质的总FPOP覆盖率方面，平台培养箱的表现均优于流动系统。在流动系统中，仅检测到两个被修饰的肽段，提供的结构信息有限。然而，在平台培养箱中，检测到五个覆盖肌动蛋白序列的被修饰肽段。

此处展示了两种系统中带有修饰脯氨酸的肌动蛋白以及未修饰肌动蛋白肽的串联质谱谱图。平台培养箱样品中的FPOP修饰残基包含12个修饰残基，流动系统中含有3个修饰残基，其中有1个共同的修饰残基。LC-MS/MS分析显示，在平台培养箱中，体内FPOP修饰的蛋白质为792种，而流动系统中修饰的蛋白质为545种。

必须将细胞保持在无菌条件下。插入所有必要的六孔板、管路和环时，务必将平台培养箱移入无菌细胞培养操作台。这可确保实验的完整性。