Name: 使用CRISPR/ CasRx在 黑腹果蝇 中无处不在和组织特异性RNA靶向 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: 学习使用CRISPR/CasRx系统在Drosophila melanogaster中进行普遍性和组织特异性RNA靶向的方法。该技术可实现高效的体内基因转录本敲低，适用于功能基因组学研究，同时需注意优化表达水平以减少毒性。

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本工作部分得到了 DARPA Safe Genes 项目资助（HR0011-17-2-0047）以及授予 O.S.A. 的 NIH 奖项（R21RAI149161A，DP2AI152071）的支持。

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<li>Ma, Y., Creanga, A., Lum, L., Beachy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+off-target+effects+in+Drosophila+RNA+interference+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prevalence of off-target effects in Drosophila RNA interference screens.</a> Nature. 443, 359-363 (2006).</li>
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<li>Buchman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+dengue+neutralization+in+mosquitoes+expressing+an+engineered+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Broad dengue neutralization in mosquitoes expressing an engineered antibody.</a> PLoS Pathogens. 16 (4), 1008103(2020).</li>
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O.S.A 是 Agragene 公司的创始人，持有该公司股权，并担任公司的科学咨询委员会成员。该安排的条款已由加州大学圣地亚哥分校根据其利益冲突政策进行审查并批准。其他所有作者声明不存在竞争利益。

通过 CasRx 系统的三种不同应用设计，本研究在果蝇中实现了&#160;体内可编程的 RNA 靶向。不同的策略可满足不同的项目需求，例如内源性与外源性基因靶向，以及普遍性与组织特异性 RNA 靶向。RNA 靶向的效果包括靶基因特异性的表型变化、靶 RNA 转录本的减少，以及与 CasRx 蛋白高表达和旁切活性相关的偶发致死表型。总体而言，这些结果表明 CasRx 系统能够在生物体水平上以可编程且高效的方式实现靶 RNA 转录本的降低。
成功定制CasRx系统的关键因素之一是gRNA的设计。具体建议如下：靶序列长度约为30个核苷酸，靶序列中poly-U序列的长度不超过4个碱基对，靶序列的GC含量在30%至70%之间，靶序列不应被预测形成稳定的RNA发夹结构，且靶序列应具有最少的预测RNA二级或三级结构5。
除了gRNA设计之外，每个实验方案中的果蝇遗传学步骤也是成功实施的关键。子代中是否出现由亲本遗传而来的特定表型，对于鉴定和量化CasRx系统在反式杂合子代中诱导的表型具有重要意义。同时，平行设置使用dCasRx果蝇的对照杂交实验，也有助于排除反式杂合子代中的非特异性表型。
值得注意的是，这些结果揭示了在果蝇中普遍表达 CasRx 和 dCasRx 蛋白所引发的毒性问题，这是 CasRx 系统的一个局限性。仅在 Ubiq 启动子驱动下普遍表达 CasRx 或 dCasRx 蛋白（不包含 gRNA）即带来显著的适合度代价，因为无法建立 Ubiq-CasRx 或 Ubiq-dCasRx 的纯合品系。相反，UASt-CasRx 和 UASt-dCasRx 果蝇可以培育为健康的纯合品系，尽管由于杂交方案的设计，它们被维持为双平衡品系，这一事实进一步支持了普遍性 CasRx 蛋白表达可诱导毒性的结论。另一项支持性证据来自涉及催化失活 dCasRx 的对照实验：在 F1 代果蝇中，同时携带 dCasRx 和 gRNA 构建体的果蝇比例始终低于 50%，而根据孟德尔遗传规律，若无 dCasRx 相关毒性，该比例应为 50%。这表明普遍表达 dCasRx 蛋白并伴随 gRNA 表达会在果蝇中引发毒性，导致遗传比例低于预期。对于转基因杂合的 UASt-dCasRx、gRNA、GAL4 果蝇，其遗传比例符合孟德尔遗传规律，再次提示毒性特异性地由 CasRx 和 dCasRx 蛋白的普遍表达所引起。CRISPR/Cas 系统中的毒性问题并非首次发现。已有研究表明，高水平的 Cas9 蛋白在包括果蝇在内的多种生物中具有毒性29,30,31,32。最近一项研究开发了一种定制的 GAL4/UAS 系统，可通过在 UAS-Cas9 构建体中 UAS 序列与 Cas9 序列之间插入不同长度的开放阅读框来调节果蝇中 Cas9 蛋白的表达量33。因此，探索通过调节 CasRx 蛋白表达水平以降低 CasRx 诱导毒性的策略具有重要意义。
除了CasRx和dCasRx蛋白普遍表达所引起的毒性外，实验结果还显示CasRx系统存在与非特异性附带脱靶效应相关的致死性，这是多种CRISPR系统的一个特征1, 2, 7, 34。在部分表达CasRx和非必需基因gRNA的双杂合或三杂合果蝇中，例如靶向Notch基因时，CasRx双杂合果蝇的存活率显著低于dCasRx双杂合果蝇。在对这些表达CasRx和gRNA的双杂合果蝇进行RNA-seq分析时，不仅观察到靶基因转录本水平的降低，也观察到非靶基因转录本的减少。这些附带效应依赖于CasRx和靶标的表达，仅在同时表达CasRx蛋白和gRNA的双杂合果蝇中出现。值得注意的是，当CasRx靶向white基因时，其转录本仅表现出有限的、无统计学显著性的下降，这与明显的色素减少表型形成对比。推测这可能是因为：1）RNA-seq样本采集时间与white基因在早期发育阶段表达高峰的时间不匹配；2）white基因在眼部的局部表达使得在仅能采集全身体组织的早期发育阶段难以获取相关组织。为降低CasRx系统的附带活性，未来研究需在个体水平上深入阐明脱靶现象的潜在机制。
有趣的是，最近一项研究35在果蝇中描述了靶向RNA的Cas13工具，似乎减轻了与CasRx表达相关的普遍毒性，可能出于以下几个原因。首先，作者对Cas13转基因进行了密码子优化，以提高其在Drosophila中的表达效率，并使用了表达强度较弱的启动子（actin 5C），相比之下，本研究使用的是泛素启动子，这可能导致Cas13表达水平较低，从而减少毒性。事实上，这一推测得到了支持：由UASt驱动的CasRx和dCasRx表达本身并不具有毒性，因为本研究以及文献35中的作者均未在UASt-CasRx果蝇中观察到明显的致死效应。此外，这些作者设计gRNA的方式与本研究不同，这可能影响了gRNA的表达并降低了在Cas13/gRNA反式杂合果蝇中系统的毒性。例如，在他们的研究中，两个gRNA由U6:3启动子驱动表达，并被tRNA序列包围，使得gRNA可在tRNA成熟过程中被加工，而无需依赖CasRx35。相反，本研究中gRNA被设计为阵列形式，每个基因最多靶向4个位点，模拟细菌中天然存在的Cas13阵列结构，这种结构需要Cas13酶本身对每个gRNA进行加工。这些不同的策略可能导致gRNA表达水平及其他因素的差异，进而对整个系统的毒性产生内在影响。最后，Huynh等人所靶向的基因与本研究不同，导致靶标与Cas/gRNA之间的相互作用及旁切活性存在差异，可能影响所观察到的致死水平。这些在毒性表现上的差异值得进一步研究，以探索整体系统优化的途径。
总体而言，本研究首次在D. melanogaster中实现了功能性的、可遗传编码且可编程的靶向RNA的Cas系统。然而，为进一步降低脱靶相关的致死性并提高CasRx在靶位点的切割效率，仍需对该系统进行进一步优化（与已有报道35中所述一致）。利用Cas酶靶向RNA是一个快速发展的研究领域，具有广泛的应用前景，从昆虫媒介控制到治疗用途均有涉及1,2,3,4,5,6,7。本实验方案为任何希望在果蝇中设计首个CasRx系统的研究者提供了一个入门工具包，同时支持系统的个性化定制和进一步优化。本文展示的实例反映了在体内应用该系统时可能遇到的一系列结果，可为其他研究者评估CasRx系统在其特定应用中的表现提供参考基准。

自成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）技术问世以来，该领域的研究重点主要集中于DNA编辑，其在医学和生物技术领域具有变革性的应用前景1。然而，由于伦理方面的考量，永久性改变DNA序列并不总是理想的选择。鉴于此，近期研究开始开发基于CRISPR的RNA靶向工具，并已证明CRISPR技术确实可在多种生物系统中用于RNA靶向2,3,4,5,6,7。在已测试的许多系统中，目前广泛使用的RNA靶向和转录本降低方法是RNA干扰（RNAi），但该方法远非完美，在体内应用时常表现出疗效差异大和脱靶活性高的问题8,9,10,11,12,13,14,15,16,17。因此，鉴于这些技术的现状，进一步探索基于CRISPR的RNA靶向工具的潜力具有重要意义。
最近一项引人注目的研究报道，核糖核酸酶CasRx（属于Cas13d家族）能够在人源细胞培养体系中高效降低基因转录水平，并具有理想的脱靶效应特征4。这一发现引发了一个问题：这种新型核糖核酸酶是否能在生物体水平上维持其对RNA靶向的高效性及低脱靶率。最近一项研究通过证明CasRx系统可用于在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中实现广泛性及组织特异性的基因转录抑制，回答了这一问题5。
为简化这一近期发表方法的使用，本实验方案详细描述了该研究中的方法，主要包括以下三个部分：1）普遍适用的体内&#160;使用双组分CasRx系统进行RNA靶向；2）使用三组分CasRx系统实现体内广泛性外源RNA靶向；3）使用三组分CasRx系统实现组织特异性体内RNA靶向。
设计了在组成型启动子控制下靶向不同目的基因的向导RNA（gRNA），并构建了表达这些含gRNA元件的果蝇品系。同时设计了在组成型启动子或可由GAL4转录因子激活的条件性上游激活序列（UASt）启动子控制下的CasRx元件，并构建了携带这些含CasRx元件的果蝇品系。还设计了催化失活的CasRx元件（dCasRx），并用作阴性对照。通过将表达gRNA的果蝇品系与组成型表达CasRx的果蝇品系杂交，可在果蝇中实现全身体细胞的RNA靶向。子代果蝇同时表达靶向特定基因转录本的gRNA元件和CasRx蛋白，从而导致靶向基因转录本在全身广泛减少。果蝇中的组织特异性RNA靶向则通过以下步骤实现：首先将表达gRNA的果蝇与表达UASt-CasRx的果蝇杂交，获得同时携带gRNA和UASt-CasRx元件的反式杂合子果蝇；再将此类果蝇与组织特异性表达GAL4的果蝇杂交，从而在果蝇中实现组织特异性的CasRx表达及RNA靶向。
CasRx 系统的可编程性使其具备定制化与优化的潜力，有助于实现在体内进行RNA靶向时的高效性与低脱靶活性。基于CRISPR的RNA靶向技术具有广泛的应用前景，包括在实验室中替代RNA干扰（RNAi）技术，以及在自然环境中助力昆虫媒介的控制。其中，当前全球尚未满足的重要需求之一，是开发高效工具以应对通过蚊子传播的RNA病毒所引发的感染。许多RNA病毒，如登革病毒、寨卡病毒和基孔肯雅病毒，均通过蚊子传播，危害人类健康并导致死亡。尽管已有多种通过基因改造使蚊群具备抗病毒能力以预防疾病传播的设想被提出，但目前尚无任何技术能够使蚊子同时对所有重要的RNA病毒产生抗性18,19,20,21,22,23。RNA靶向的Cas系统可能为实现此类技术提供起点，因其可构建一个可编程的平台，用于靶向所有通过蚊子传播的RNA病毒。

<table><tbody><tr><td>100% 葡萄汁</td><td>Welch Foods Inc.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>活性干酵母（908g）</td><td>Red Star Yeast Company, LLC</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DMC4500 彩色相机</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMC4500</td><td></td></tr><tr><td>双荧光素酶报告基因检测系统</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr><tr><td>GAL4-GMR 果蝇</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>29967</td><td></td></tr><tr><td>GAL4-y 果蝇</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>44373</td><td></td></tr><tr><td>Glomax 20/20 发光仪</td><td>Promega</td><td>E5331</td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiSeq2500 测序仪</td><td>Illumina, Inc.</td><td>HiSeq2500</td><td></td></tr><tr><td>M165FC 荧光体视显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>M165FC</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop One&lt;sup&gt;C&lt;/sup&gt; 紫外-可见分光光度计</td><td>ThermoFisher</td><td>NDONEC-W</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II RNA 文库构建试剂盒</td><td>New England Biolabs, Inc.</td><td>E7770</td><td></td></tr><tr><td>质粒 # 112686</td><td>Addgene</td><td>112686</td><td></td></tr><tr><td>质粒 # 112688</td><td>Addgene</td><td>112688</td><td></td></tr><tr><td>质粒 # 132416</td><td>Addgene</td><td>132416</td><td></td></tr><tr><td>质粒 # 132417</td><td>Addgene</td><td>132417</td><td></td></tr><tr><td>质粒 # 132419</td><td>Addgene</td><td>132419</td><td></td></tr><tr><td>质粒 # 132420</td><td>Addgene</td><td>132420</td><td></td></tr><tr><td>质粒 # 132421</td><td>Addgene</td><td>132421</td><td></td></tr><tr><td>质粒 # 132422</td><td>Addgene</td><td>132422</td><td></td></tr><tr><td>质粒 # 132425</td><td>Addgene</td><td>132425</td><td></td></tr><tr><td>质粒 # 132426</td><td>Addgene</td><td>132426</td><td></td></tr><tr><td>质粒 # 133304</td><td>Addgene</td><td>133304</td><td></td></tr><tr><td>质粒 # 164586</td><td>Addgene</td><td>164586</td><td></td></tr><tr><td>质粒 #132418</td><td>Addgene</td><td>132418</td><td></td></tr><tr><td>质粒 pJFRC81</td><td>Addgene</td><td>36432</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen RNeasy Mini 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>限制性内切酶 AscI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0558L</td><td></td></tr><tr><td>限制性内切酶 NotI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0189L</td><td></td></tr><tr><td>限制性内切酶 PacI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0547L</td><td></td></tr><tr><td>限制性内切酶 PstI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0140L</td><td></td></tr><tr><td>限制性内切酶 SwaI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0604L</td><td></td></tr><tr><td>限制性内切酶 XbaI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0145L</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer 用 RNA 6000 Pico 试剂盒</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Invitrogen</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>U6-3:4-gRNA-Fluc 果蝇</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84125</td><td></td></tr><tr><td>U6-3:4-gRNA-GFP; OpIE2-GFP 果蝇</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84986</td><td></td></tr><tr><td>U6-3:4-gRNA-N 果蝇</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84122</td><td></td></tr><tr><td>U6-3:4-gRNA-w 果蝇</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84124</td><td></td></tr><tr><td>U6-3:4-gRNA-y 果蝇</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84123</td><td></td></tr><tr><td>UASt-CasRx 果蝇</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84121</td><td></td></tr><tr><td>UASt-dCasRx 果蝇</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84120</td><td></td></tr><tr><td>Ubiq-CasRx 果蝇</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84118</td><td></td></tr><tr><td>Ubiq-dCasRx 果蝇</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84119</td><td></td></tr><tr><td>Ubiq-Firefly-T2A-eGFP-Ubiq-Renilla 果蝇</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84127</td><td></td></tr><tr><td>Zymoclean 凝胶 DNA 回收试剂盒</td><td>Zymo Research Corporation</td><td>D4007</td><td></td></tr></tbody></table>

普遍性与组织特异性rna靶向 黑腹果蝇 使用 crispr/casrx

Ubiquitous and Tissue-specific RNA Targeting in Drosophila Melanogaster using CRISPR/CasRx

CasRx 是一种靶向 RNA 的 Cas13 家族成员，作为 CRISPR/Cas 技术的新成员，在细胞和生物体水平上均表现出高效的基因转录本降低能力以及优良的脱靶效应特征，具有广阔的应用前景。最近有报道称，CRISPR/CasRx 系统可用于实现广泛性及组织特异性的基因转录本降低 黑腹果蝇．本文详细介绍了近期研究中的方法，包含三个部分：1）普遍存在的&#160;利用双组分CasRx系统进行体内内源性RNA靶向；2）利用三组分CasRx系统进行广泛性体内外源性RNA靶向；以及3）利用三组分CasRx系统进行组织特异性体内RNA靶向。所观察到的RNA靶向效应包括靶基因特异性的表型改变、靶向RNA转录本的减少，以及与CasRx蛋白高表达和旁切活性相关的偶发致死表型。总体而言，这些结果表明，CasRx系统能够在生物体水平上以可编程且高效的方式实现靶向RNA转录本的降低，证明了体内转录组靶向与改造的可行性，为未来基于CRISPR的体内RNA靶向技术奠定了基础。

使用双组分 CasRx 系统实现体内广泛存在的 RNA 靶向 
F1 同时表达Ubiq-CasRx和靶向内源及外源基因的gRNA构建体的反式杂合果蝇，相较于表达Ubiq-dCasRx和gRNA构建体的对照果蝇，表现出显著的表型差异。图2 和 图4）。具体而言，与转座杂合子 dCasRx 果蝇相比，转座杂合子 CasRx 果蝇的存活率显著降低，表明 Ubiq-CasRx 系统具有毒性（图2A 和 图 4A）。值得注意的是，两种反式杂合的 CasRx 和 dCasRx 果蝇的遗传率均低于 50%，而根据孟德尔遗传学，预期比例应为 50%。在三个靶基因中，Ubiq-CasRx/+; U6-gRNAN/+ 果蝇与 Ubiq-CasRx/+; U6-gRNAy/+ 果蝇无法存活（遗传率为 0%），且无法发育超过二龄幼虫阶段（图2A-2B存活的 Ubiq-CasRx/+; U6-gRNAw/+ 果蝇的遗传率为12.9%，表现出明显的完全外显的白眼表型（图2B）。除了与 CasRx 相关的可观察性状外，我们还能够证实 3 个靶基因的靶标基因转录本水平均显著降低： Notch, 黄色，以及 GFP (图2E-2G）。还原 白色 在 Ubiq-CasRx/+, U6-gRNA 中观察到基因转录本w/+ 果蝇与对照 Ubiq-dCasRx/+、U6-gRNA 相比w/+ 果蝇中，尽管这种减少未达到统计学显著性（图2E - 2F）。通过比较表达 CasRx 的果蝇样本与表达 dCasRx 的果蝇样本之间的差异表达转录本，发现了 CasRx 引发脱靶效应的证据（图 2E，2G）。显著差异表达的非靶标转录本数量如下： 白色，253（占转录本总数的1.4%）； Notch, 300 (1.7%); 黄色, 41 (0.23%); GFP, 5,880 (33%) (图2G). 在总共17,779种不同的转录本中，有6种非靶向转录本在全部4组样本中均表现出显著差异表达。其中鉴定出的6种转录本之一为Gadd45，该基因在果蝇中参与细胞凋亡和细胞周期阻滞，提示CasRx的酶活性可能直接引发细胞凋亡，或间接导致其他基因的异常表达，从而诱发凋亡。此外值得注意的是，Ubiq-CasRx和Ubiq-dCasRx果蝇无法建立纯合品系，推测是由于广泛性高表达带来的毒性所致。因此，实验中采用杂合子Ubiq-CasRx/CyO和Ubiq-dCasRx/CyO果蝇与纯合gRNA果蝇品系进行杂交。综上所述，双组分Ubiq-CasRx系统能够实现对内源性和外源性靶标RNA的广泛靶向，导致可观察的表型变化及转录本水平下降。这些结果还表明，CasRx介导的RNA靶向可能在体内引发毒性效应。
利用三组分 CasRx 系统实现体内广泛存在的外源 RNA 靶向 
两步杂交实验的结果表明，尽管靶基因为外源性（即 Fluc），在 F2 代三重杂合子（Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc）中同时表达三种转基因时导致 100% 致死率，而对照杂交中使用 Ubiq-dCasRx 时，F2 代三重杂合子（Ubiq-dCasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc）未观察到致死现象（图 3B-C）。更具体而言，仅当三种转基因同时存在（Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc）时才出现 100% 致死率（图 3B 和 D），而基因型为（Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/TM6）和（Ubiq-CasRx/+; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/TM6）的个体均可存活，且无明显表型，其遗传比例符合预期的孟德尔遗传规律，表明只有当靶序列（即 萤火虫荧光素酶）与 Ubiq-CasRx/+ 及 gRNAFluc&#160;共同存在时才会引发观察到的致死表型，这可能源于 Cas13 酶的附带活性2,8。此外，与 Ubiq-dCasRx 对照组（Ubiq-dCasRx/+; gRNAFluc/+ 或 Ubiq-dCasRx/+; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/+）相比，F1 代杂合子（Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/+ 或 Ubiq-CasRx/+; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/+）未表现出可区分的表型或遗传比例的显著变化（图 3B），说明催化活性酶的存在是产生致死表型所必需的。此外，所有可存活基因型果蝇中的 Fluc 和 Rluc 表达水平显示，与双荧光素酶报告基因对照相比，Ubiq-dCasRx 三重杂合子（Ubiq-dCasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc）中 Fluc 表达未显著降低，表明 dCasRx 靶向并未减少 Fluc 蛋白的表达水平（图 3D）。综上所述，在两种不同的 CasRx 介导的广泛 RNA 靶向实验中均观察到一致的致死表型，表明当 CasRx 介导的 RNA 靶向在组织中广泛表达时，可能对生物体具有毒性。
利用三组分 CasRx 系统实现组织特异性体内 RNA 靶向 
组织特异性, 体内, RNA 靶向, CasRx, 三组分系统, 基因调控, RNA 编辑, 递送系统, 动物模型, 分子治疗 
在广泛性RNA靶向实验中观察到的高水平毒性促使我们探索使用方法部分详述的三组分CasRx系统设计进行组织特异性RNA靶向。事实上，与使用Ubiq启动子相比，当采用UASt启动子降低整体CasRx表达水平时，所观察到的毒性水平有所降低，这一点体现在以下三个方面：1）UASt-CasRx和UASt-dCasRx品系可维持为纯合品系，尽管根据两步杂交方案，实际杂交实验中使用的是双平衡的UASt-CasRx和UASt-dCasRx品系；2）所有F2 dCasRx 三重杂合子的遗传率在子代中符合预期的25%孟德尔遗传率，且3）F2 CasRx 三重杂合致死表型在子代中有所减弱。在 白色 靶向实验中，预期在F代出现25%的孟德尔遗传率2 三重杂合子，仅有0.57%的成年果蝇存活（UASt-CasRx/+; gRNAw/GMR-Gal4）中均观察到严重的眼部特异性色素沉着和形态学表型（图4A 和 4B）。对于 白色靶向杂交，表达CasRx的三重杂合F2 遗传率显著低于表达dCasRx的三重杂合对照组（27.6%）图 4A）。在 Notch 靶向实验中，携带全部三种转基因的表达CasRx的三重杂合子完全致死，而dCasRx对照的遗传率为29.3%（图4A）。在 黄色 靶向实验，F2 三重杂合CasRx表达、gRNAy，以及 y-GAL4 显示几丁质色素轻微减少，表现为胸部和腹部出现小块黄色表皮，遗传率为 2.67%，远低于 dCasRx 对照组（25.2%）图4A所有dCasRx对照三重杂合子果蝇均未表现出与CasRx表达果蝇类似的明显表型，表明CasRx的催化活性是导致所观察表型的原因。CasRx三重杂合子组中较低的遗传率提示CasRx介导的RNA靶向存在两种毒性来源：其一是与CasRx高表达相关，通过限制性表达CasRx可降低其毒性；其二是与旁切活性相关。综上所述，这些结果表明CasRx系统可借助经典的Gal4/UASt系统实现组织特异性的体内RNA靶向，同时降低毒性。然而，与组成型表达策略相比，尽管毒性及偶发致死表型的严重程度有所降低，但仍可观察到一定程度的毒性，表明旁切切割活性与毒性相关。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62154/62154fig01.jpg" /> 
图1使用Cas13D系统进行RNA靶向的总体概述 （A）利用双组分 CasRx 系统在体内广泛性 RNA 靶向中进行一步遗传杂交的示意图。（B）在广泛性&#160;体内利用三组分CasRx系统进行外源RNA靶向。(C) 利用三组分CasRx系统在组织特异性体内RNA靶向中进行两步遗传杂交的示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62154/62154fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62154/62154fig02.jpg" /> 
图2：使用双组分 CasRx 系统实现广泛存在的体内 RNA 靶向（重印自5）。 （A）携带 Ubiq-CasRx（或 Ubiq-dCasRx）和 gRNA 的反式杂合果蝇的总遗传百分比。箱形图中的蓝色阴影表示表型外显率。（B）反式杂合果蝇的表型。箭头指示眼部组织坏死。标有“X”的黑白果蝇代表致死性。（C）Ubiq-CasRx（或 Ubiq-dCasRx）与 gRNAGFP-OpIE2-GFP 果蝇之间双向杂交的反式杂合子代的总遗传百分比。M，CasRx 的母系遗传；P，CasRx 的父系遗传。（D）父系杂交产生的 F1 代幼虫子代。（E）转录本的后验最大估计值，表示对数倍数变化。使用了 DESeq2 分析流程。（F）被 CasRx 或 dCasRx 靶向的每百万转录本数（TPM）。（G）CasRx 依赖性差异表达转录本占所有转录本的百分比。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62154/62154fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62154/62154fig03.jpg" /> 
图3：利用三组分 CasRx 系统实现普遍性体内外源 RNA 靶向。 （A）两步遗传杂交示意图。（B）F2 代中出现的所有基因型的总遗传比例。F2 后代中同时遗传三个转基因（Ubiq-CasRx、Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc 和 gRNAFLuc）导致 100% 致死率，显著低于 Ubiq-dCasRx 三重反式杂合子对照组（p = 0.001，t 检验）。（C）单独携带 Ubiq-CasRx/gRNAFluc 或仅携带 Ubiq-CasRx 与 Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc 均未引起严重致死效应，且 Ubiq-CasRx 与 Ubiq-dCasRx 反式杂合子之间的遗传比例无显著差异（p = 0.41 和 p = 0.51，分别为 t 检验）。（D）将 Fluc 读数归一化为 Rluc 读数后的荧光素酶比值。表达 Ubiq-CasRx、Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc 和 gRNAFLuc 的三重反式杂合果蝇表现为胚胎致死，以带“X”的果蝇表示，因此未检测荧光素酶表达。Ubiq-CasRx/+, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/TM6, Stb 反式杂合子的 Fluc/Rluc 比值显著低于其他表达 Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc 的组别（p = 1.2e-06 或更低，t 检验）。仅表达 gRNAFLuc 组的结果显著低于所有其他组别（p = 1.2e-06 或更低，t 检验）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62154/62154fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62154/62154fig04.jpg" /> 
图4：利用三组分 CasRx 系统实现组织特异性体内 RNA 靶向（重印自5）。 （A）携带三个转基因（UASt-CasRx 或 UASt-dCasRx、gRNA 和 Gal4 驱动子）的三重杂合子果蝇的总遗传比例。（B）三重杂合子果蝇的表型。白色箭头指示胸部几丁质色素减少。用“X”标记的黑白果蝇代表致死性。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62154/62154fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>构建体</td>
			<td>描述</td>
			<td>引物</td>
			<td>引物序列（5’ 至 3’）</td>
			<td>PCR 模板</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">OA-1050E</td>
			<td rowspan="2">CasRx</td>
			<td>1050E.C3</td>
			<td>TACTAATTTTCCAC 
			ATCTCTATTTTGAC 
			CCGCAGATTAATTA 
			ATGAGCCCCAAGA 
			AGAA</td>
			<td rowspan="2">pNLS-RfxCas13d-NLS-HA (pCasRx)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1050E.C4</td>
			<td>CAATTGATTTGTTA 
			TTTTAAAAACGATT 
			CATTCTAGCTAGCT 
			TAAGCGTAATCTGG 
			AACA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">OA-1050R</td>
			<td rowspan="2">dCasRx</td>
			<td>1050E.C3</td>
			<td>TACTAATTTTCCAC 
			ATCTCTATTTTGAC 
			CCGCAGATTAATTA 
			ATGAGCCCCAAGA 
			AGAA</td>
			<td rowspan="2">pNLS-dRfxCas13d-NLS-HA (pdCasRx)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1050E.C4</td>
			<td>CAATTGATTTGTTA 
			TTTTAAAAACGATT 
			CATTCTAGCTAGCT 
			TAAGCGTAATCTG 
			GAACA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">OA-1050L</td>
			<td rowspan="2">UASt 启动子</td>
			<td>1041.C9</td>
			<td>GCGGGTTCTCGA 
			CGGTCACGGCGG 
			GCATGTCGACGC 
			GGCCGCAACCAA 
			CAACACTAGTAG</td>
			<td rowspan="2">pJFRC81</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1041.C11</td>
			<td>CTGGCCTCCACC 
			TTTCTCTTCTTCT 
			TGGGGCTCATGT 
			TTAAACCCAATT 
			CCCTATTCAGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">CasRx</td>
			<td>1050L.C1</td>
			<td>AATACAAGAAGA 
			GAACTCTGAATA 
			GGGAATTGGGT 
			TTAAACATGAGC 
			CCCAAGAAGAA</td>
			<td rowspan="2">pCasRx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1050E.C4</td>
			<td>CAATTGATTTGT 
			TATTTTAAAAAC 
			GATTCATTCTA 
			GCTAGCTTAAG 
			CGTAATCTGGA 
			ACA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">OA-1050S</td>
			<td rowspan="2">UASt 启动子</td>
			<td>1041.C9</td>
			<td>GCGGGTTCTC 
			GACGGTCACG 
			GCGGGCATGT 
			CGACGCGGCC 
			GCAACCAACAA 
			CACTAGTAG</td>
			<td rowspan="2">pJFRC81</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1041.C11</td>
			<td>CTGGCCTCCA 
			CCTTTCTCTTC 
			TTCTTGGGGCT 
			CATGTTTAAAC 
			CCAATTCCCTA 
			TTCAGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">dCasRx</td>
			<td>1050L.C1</td>
			<td>AATACAAGAAG 
			AGAACTCTGAAT 
			AGGGAATTGGG 
			TTTAAACATGAG 
			CCCCAAGAAGAA</td>
			<td rowspan="2">pdCasRx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1050E.C4</td>
			<td>CAATTGATTTGT 
			TATTTTAAAAAC 
			GATTCATTCTAG 
			CTAGCTTAAGCG 
			TAATCTGGAACA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">OA-1043</td>
			<td rowspan="2">U6:3 启动子</td>
			<td>1043.C1</td>
			<td>GGGAATTGGGA 
			ATTGGGCAATAT 
			TTAAATGGCGGC 
			GCGCCGAATTCT 
			TTTTTGCTCACCT</td>
			<td rowspan="2">Addgene 质粒 #164586</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1043.C23</td>
			<td>ACACTAGTGGAT 
			CTCTAGAGGTAC 
			CGTTGCGGCCG 
			CAAAAAAGTTGT 
			AATAGCCCCTCA 
			AAACTGGACCTT 
			CCACAACTGCAG 
			CCGACGTTAAAT 
			TGAAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="6">OA-1052B</td>
			<td rowspan="2">Ubiq 启动子</td>
			<td>1052B.C1</td>
			<td>GGGAATTGGGCA 
			ATATTTAAATGGC 
			GGCTGCAGCGC 
			GCAGATCGCCGAT</td>
			<td rowspan="2">Addgene 质粒 #112686</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1052B.C2</td>
			<td>TTTCTTTATGTTT 
			TTGGCGTCTTCC 
			ATCCTAGGTCTG 
			CGGGTCAAAATA 
			GAGATG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">T2A-eGFP</td>
			<td>908A1</td>
			<td>ATAAAGGCCAAG 
			AAGGGCGGAAA 
			GATCGCCGTGG 
			AGGGCAGAGGA 
			AGTCTTCTAACAT 
			GC</td>
			<td rowspan="2">Addgene 质粒 #112686</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>908A2</td>
			<td>TTGTTATTTTAAAA 
			ACGATTCATTCTA 
			GGCGATCGCTTA 
			CTTGTACAGCTC 
			GTCCATGCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">反向 Ubiq 启动子</td>
			<td>908A3</td>
			<td>ACCGTGACCTAC 
			ATCGTCGACACTA 
			GTGGATCTCTAGA 
			CGCGCAGATCGC 
			CGATG</td>
			<td rowspan="2">Addgene 质粒 #112686</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>908A4</td>
			<td>GGATCATAAACTT 
			TCGAAGTCATGC 
			GGCCGCTCTGCG 
			GGTCAAAATAGAG 
			ATGT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：本研究中使用的分子构建体和引物列表。 该列表包含所有构建体（包括编号和描述）以及每个构建体所用的相应引物（包括编号和序列（5' 至 3'））和模板。

本文概述了在果蝇中使用靶向RNA的Cas13D酶（RfxCas13D）的详细实验方案。

普遍性与组织特异性RNA靶向 黑腹果蝇 使用 CRISPR/CasRx

CasRx 是一种靶向 RNA 的 Cas13 家族成员，作为 CRISPR/Cas 技术中高效降低基因转录本水平的新兴工具，具有广阔的应用前景。

正如我们的实验方案所示，CRISPR CasRx 技术可用于在果蝇中实现广泛性及组织特异性的基因转录本降低。本技术为所有希望在果蝇中应用基于 CRISPR 的基因转录本降低方法的研究者提供了一个入门方案，同时兼容进一步的定制与优化。若要建立一个使用双组分 CasRx 系统进行广泛性体内 RNA 靶向的实验，请从目标纯合 gRNA 品系中收集 10 只处女成年雌蝇，以及从平衡杂合的 Ubiq CasRx CurlyO 品系中收集 5 只成年雄蝇。将亲代果蝇放入含有100微克干酵母粉的小瓶中，在26摄氏度条件下培养48小时。每天观察小瓶，检查是否有新的成年子代从F1代蛹中羽化，并用二氧化碳对任何成年果蝇麻醉10秒。一旦果蝇变得无法活动，将小瓶中的果蝇倾倒在连接至二氧化碳气罐并持续通入二氧化碳的果蝇垫上，使用连接到荧光体视显微镜的彩色相机对果蝇的表型进行评分和成像。然后根据荧光信号的表达情况，统计具有不同表型的子代数量。根据孟德尔遗传规律，预期有50%的子代会表达靶向RNA。需要注意的是，Ubiq CasRx系统的毒性可能会导致表达靶向RNA的子代比例低于50%。为了建立一个利用三组分CasRx系统实现普遍性体内外源RNA靶向的实验体系，需从双荧光素酶表达品系中收集8至10只 virgin成年雌蝇，并从表现出白眼、卷翅和dsRed红色荧光的平衡杂合Ubiq CasRx Curly plus TM6, STB品系中收集4至5只成年雄蝇。将亲本杂交组合放入含有100微克干酵母粉的小瓶中，并在26°C条件下培养48小时。孵育结束后，从每支小瓶中移除所有亲本果蝇，并将小瓶重新放回26°C培养箱中至少培养14天。在14天内，如前所述，从纯合的萤火虫荧光素酶靶向gRNA品系中分三次收集8至10只雌性处女蝇。每天观察第一步杂交小瓶，检查是否有新的成年子代从蛹中羽化，使用二氧化碳麻醉，以便收集四到五只同时表达Ubiq CasRx和双荧光素酶报告基因的雄蝇（视情况而定）。将这些果蝇放入一个新小瓶中，加入来自靶向荧光素酶gRNA品系的10只处女雌蝇，并将这些第二步杂交置于26摄氏度下培养48小时。从第一步杂交小瓶中再收集五只一天龄、同时表达Ubiq CasRx和双荧光素酶报告基因的雄蝇，在26摄氏度下单独培养2至4天，随后转移至1.5毫升离心管中，于零下80摄氏度保存。孵育结束后，从第二步杂交管中的每管移除所有亲本管，并将杂交管放回26°C培养箱中继续培养至少20天。每天观察第二步杂交管，检查是否有新的成年子代从蛹中羽化，一旦发现可用的果蝇，立即用二氧化碳麻醉，记录并成像其表型，操作方法如前所述。孟德尔遗传学表明，如果所有果蝇均可存活，则应有25%的子代表达靶向RNA。为进行荧光素酶检测，请按照所示方法制备三重杂合转基因果蝇以及对照果蝇。收集出生时的雄性果蝇，并培养至3日龄。将培养三天的果蝇转移至1.5毫升离心管中，使用商业化的荧光素酶检测试剂盒中的荧光素酶裂解缓冲液对果蝇进行裂解。随后，根据标准的荧光素酶检测方案，取每个样品5 µL裂解组织液，利用发光仪分别检测果蝇体内荧光素酶和Ran荧光素酶的活性。F1代转座子杂合CasRx果蝇的存活率显著低于转座子杂合dCasRx果蝇。通过验证针对三个靶基因的Ubiq CasRx系统的毒性，发现U6 gRNA Y杂合果蝇无法存活，不能发育至二龄幼虫阶段之后。而存活的Ubq CasRx与U6 gRNA W杂合果蝇则表现出完全外显的宽眼表型。此外，还观察到三个靶基因的转录本水平显著降低。通过比较表达 CasRx 的果蝇样本与表达 dCasRx 的果蝇样本之间的差异表达转录本，也可观察到由 CasRx 引发的脱靶活性证据。在两步杂交实验中，只有当三种转基因同时存在时，才会导致 100% 的致死率。当采用三组分 CasRx 系统设计进行组织特异性 RNA 靶向时，与使用 Ubiq 启动子相比，使用 UAST 启动子降低 CasRx 整体表达水平可减轻毒性程度。使用具有正确性别的果蝇以及正确表型的果蝇正确建立遗传流程非常重要。

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