从小鼠肠道隐窝生成原代结肠上皮单层细胞

本方案提供了一种快速、可重复且可靠的方法，可在不同表面上生成直接的原代肠上皮单层细胞，且碎片最少。该方案的主要优势在于培养基消耗量低，细胞培养的维护成本低。该方法可快速进行功能检测及后续应用。

本方案将有助于研究伤口修复、通透性屏障以及不同类型细胞的跨上皮迁移。此外，该模型还可用于宿主-病原体相互作用、受损上皮以及药物发现的研究。首先，向48孔板和腔室载玻片的每个孔中加入200 µL包被液。

将两者在37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中预孵育两小时。用200微升胶原蛋白溶液包被0.4微米细胞膜插入物。将含膜插入物的培养板在4摄氏度孵育30分钟，然后转移至37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中孵育两小时。

用70%乙醇对已安乐死的小鼠进行消毒，然后借助剪刀和镊子从直肠到盲肠处解剖出结肠。使用装有20号喂养管的10毫升注射器，以冰冻的PBS轻柔冲洗粪便。去除近端结肠，并将远端结肠轻柔地套入20号喂养管上。

用4-0丝线在导管末端结扎结肠。将结扎端的结肠翻转至内侧，另一端也用丝线结扎，然后用手术剪在喂养管尖端下方剪断结肠。用1.25毫升重复使用注射器的推杆轻轻将翻转后未结扎端的结肠套在注射器尖端上。

将翻转的结肠未打结的一端套在注射器上，并用线绳紧紧扎牢。将活塞插入注射器，充气使结肠膨胀至外观饱满、无可见皱褶。将膨胀后的结肠样结构置于含有5毫升细胞回收溶液的15毫升离心管中，冰上孵育20分钟。

每5分钟对结肠进行一次充气和放气。使用4-0丝线在重复注射器尖端下方结扎已充气的结肠。将结肠肠段从重复注射器上剪下，放入含有10毫升50毫摩尔EDTA的15毫升离心管中，孵育40分钟。

将试管在4°C条件下旋转。用5毫升振荡缓冲液替换EDTA溶液，将肠段在垂直位置手动振荡2分钟。将振荡液倾入新的15毫升离心管中，并重复振荡步骤，直至总共收集到10毫升隐窝和振荡缓冲液。

在显微镜下计数20微升悬浮液中的隐窝数量，并将样品稀释至每微升含5个隐窝。将隐窝样品在4°C条件下以400 × g离心10分钟。在此期间，从培养箱中取出48孔板和膜插件，并将其放入生物安全柜中。

使用P200移液器吸除包被液，并将培养板盖子略微偏移，静置直至细胞准备接种。将隐窝悬液离心后，去除振荡缓冲液，并将完整沉淀重悬于3 mL LWRN完全培养基中。向每孔预包被的48孔板及腔室载玻片中加入200 µL隐窝悬液，并将两者置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育。

第二天，吸除培养基并加入新鲜培养基。通常情况下，细胞在24至48小时内达到融合状态。对于细胞培养膜插件，在插件顶部加入200 µL隐窝结构，在底部加入600 µL完全LWRN培养基。

第二天，吸除培养基，仅向顶室加入新鲜培养基。将培养板置于37°C、5%二氧化碳培养箱中孵育。使用上皮细胞伏特/欧姆计每天测量跨上皮电阻。

从鼠结肠中分离隐窝并验证浓度后，将隐窝悬液浓缩至每微升含5个隐窝。当细胞达到汇合时，对48孔板的孔进行划痕伤口实验。24小时后观察到伤口修复，表明培养物健康且具有活性。

当培养基从 LWRN 更换为分化培养基时，获得了更高层次的细胞分化水平。同时观察到肠上皮干细胞标志物减少，而分化标志物增加，表明已成功生成分化的单层细胞。此外，通过免疫荧光显示，在不同培养条件下生长的分化上皮细胞亚型均出现。

在进行该实验方案时，重要的是确保结肠在制备过程中的任何阶段均未发生破裂，并保持充气状态，以获得极为洁净的隐窝释放效果。一旦形成二维肠道上皮细胞单层，即可进行免疫荧光、划痕损伤和通透性检测以及其他后续应用。这将有助于深入了解伤口愈合、不同类型细胞的迁移，以及上皮修复与损伤研究。