Name: 来自肠道密码的穆林原结肠上皮单层的生成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: 学习从肠道隐窝生成小鼠原代结肠上皮单层细胞的方法，用于研究伤口愈合和屏障功能。该方案具有培养基消耗低、成本低廉、可重复性高的优势，适用于药物筛选和宿主-病原体相互作用研究。

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本工作得到了克罗恩病和结肠炎基金会职业发展奖（544599，授予MQ）以及美国国立卫生研究院（NIH）基金（DK055679、DK089763、DK059888，授予AN）的支持。我们感谢密歇根医学转化组织建模实验室持续提供的帮助及其试剂和方案的使用许可。

以下所述所有操作均经密歇根大学机构动物护理与使用委员会批准，并依照其制定的指南进行。
1. 隐窝分离与培养所需试剂的准备（在组织培养罩内进行）
<ol>
	<li>50 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）：取 50 mL 0.5 M 储存液加入 450 mL 不含钙（Ca2+）和镁（Mg2+）的磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制成 500 mL。本实验方案中，除非另有说明，PBS 均指不含钙和镁的 PBS。</li>
	<li>振荡缓冲液（shake buffer）：将 7.4 g 蔗糖（43.3 mM）和 5 g 山梨醇（54.9 mM）溶解于 PBS 中，配制成 500 mL。</li>
	<li>L-WRN（L-Wnt-3A、R-spondin 和 Noggin）培养基：在 780 mL 高级 Dulbecco 改良 Eagle 培养基/Ham's F-12（DMEM/F12）中加入 20% 胎牛血清（FBS）（200 mL）、1× 商业化谷氨酰胺补充剂（10 mL）、100 U/mL 青霉素和 100 g/mL 链霉素（10 mL），用 0.22 µm 滤器过滤除菌。
	<ol>
		<li>通过 ATCC 获取 L-WRN 细胞，在 T175 培养瓶中培养，并使用 Geneticin 和 Hygromycin 进行筛选。每 12 天更换并收集一次培养基。 
		注意：每批培养基均使用 TOPflash Wnt 报告基因检测法检测 Wnt 活性。本实验参照密歇根医学转化组织建模实验室的实验方案（https://www.umichttml.org/protocols）。将 TOPflash HEK 293 细胞在 T75 培养瓶中培养至融合，经胰酶消化后接种至 96 孔板。次日，向细胞中加入不同稀释度的收集培养基，在 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育过夜。第二天裂解细胞，并根据制造商说明书进行萤光素酶检测。使用重组 Wnt-3A 对检测结果进行标准化。将培养基分装为每管 25 mL 至 50 mL 锥形管中，于 -80 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基础培养基：在 448 mL 高级 DMEM/F12 中加入 2× 商业化谷氨酰胺补充剂（10 mL）、20 mM HEPES（10 mL）、100 U/mL 青霉素和 100 g/mL 链霉素（10 mL）、2 mM N-乙酰-L-半胱氨酸（2 mL）、N2 补充剂（10 mL）和 B27 补充剂（20 mL），用 0.22 µm 滤器过滤除菌。将培养基分装为每管 25 mL 至 50 mL 锥形管中，于 -80 °C 保存。</li>
	<li>LWRN 完全培养基：将 25 mL LWRN 培养基与 25 mL 基础培养基混合，加入 200 ng/mL 表皮生长因子（EGF）（20 µL）和 2× 抗生素-抗真菌溶液（1 mL）。将完全培养基于 4 °C 保存。</li>
	<li>胶原蛋白和层粘连蛋白：将 5 mg 粉末溶于 5 mL 经滤膜除菌的 100 mM 乙酸溶液中（将 60 µL 乙酸储存液加入 9.94 mL 分子生物学级水中），配制成 1 mg/mL 的储存液。于 4 °C 旋转溶解 4 小时，分装为每管 100 µL 至 0.2 mL 管中，-20 °C 冻存。层粘连蛋白购自供应商，储存浓度为 100 µg/mL。</li>
	<li>不含生长因子的完全培养基（CMGF-）：在 500 mL 高级 DMEM/F12 中加入 1× 商业化谷氨酰胺补充剂（5 mL）、10 mM HEPES（5 mL）、100 U/mL 青霉素和 100 g/mL 链霉素（5 mL）。</li>
	<li>分化培养基：向 9.2 mL CMGF- 培养基中加入 200 µL B27 补充剂、100 µL N2 补充剂、20 µL N-乙酰-L-半胱氨酸、500 µL Noggin 培养基12（由 Noggin 产生细胞制备）和 2 µL EGF，配制成 10 mL 分化培养基。</li>
</ol>
2. 培养板、腔室载玻片和细胞培养膜插件的制备
<ol>
	<li>用于接种二维单层细胞的48孔板和腔室载玻片的包被：使用由层粘连蛋白（1:40稀释，参见材料表）和胶原蛋白（1:30稀释）溶于含Ca2+和Mg2+ 的冷杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中的包被溶液。每孔加入200 µL包被溶液，并将板或腔室载玻片置于37 °C、5% CO2培养箱中预孵育至少2小时。</li>
	<li>0.4 µm细胞培养膜插件的包被：将胶原蛋白用分子级水按1:30稀释，每插件中加入200 µL。将含有膜插件的板置于4 °C冰上保持30分钟。30分钟后，将板转移至37 °C、5% CO2培养箱中孵育1.5–2小时。聚酯和聚碳酸酯膜插件可获得可比的结果。 
	注意：通过调整胶原蛋白/层粘连蛋白的体积以完全覆盖接种表面，本方案可用于任何组织培养板（可进行放大或缩小规模）。</li>
</ol>
3. 隐窝分离
注意：开始解剖前，准备好包被有胶原蛋白和/或层粘连蛋白的培养板/膜插件/腔室载玻片，并将其置于37 °C、5% CO2的培养箱中。准备干净的工作台、适用于手术的无菌外科器械，以及用于培养二维单层细胞的生物安全柜。确认其他用于二维单层细胞培养的标准设备（如加湿CO2培养箱、台式离心机（保持在4 °C）、显微镜和移液器（包括血清移液管））均已就绪。
<ol>
	<li>使用 8–12 周龄的 C57Bl/6 小鼠。采用经批准的安乐死方法处死小鼠。</li>
	<li>用 70% 乙醇（EtOH）溶液喷洒小鼠尸体，以清洁解剖区域，并用纸巾去除多余的 EtOH。 
	注意：确保隐窝分离试剂（如 PBS、50 mM EDTA、振荡缓冲液）保持低温。这些试剂可提前一天配制，在 4 °C 保存时至少 3 个月内可使用。同时，确保 LWRN 完全培养基在使用前置于维持在 37 °C 的珠浴/水浴中。</li>
	<li>使用洁净的解剖剪和镊子，从直肠至盲肠处解剖取出结肠。用镊子夹住结肠末端，使用装有 20 G 喂养管的 10 mL 注射器，以冰上预冷的 PBS 轻柔冲洗粪便（图 1A）。注意避免撕裂结肠。
	<ol>
		<li>去除近端结肠。该部分为靠近回盲交界处的结肠段。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用镊子将远端结肠轻轻滑至 20 G 喂养管上，并用 4-0 丝线在管尖末端结扎固定结肠（图 1B）。</li>
	<li>用手指捏住已结扎的一端，将结肠外翻至内侧，再用 4-0 丝线结扎另一端。使用手术剪在喂养管管尖下方剪断结肠（图 1C、D、E）。</li>
	<li>使用 1.25 mL 重复使用型注射器的推杆，轻轻将未结扎端的外翻结肠撑开并套在 1.25 mL 重复使用型注射器的尖端。将外翻结肠滑至注射器末端，并用 4-0 丝线紧密结扎（图 1F、G）。</li>
	<li>将推杆插入注射器，充气使结肠膨胀成香肠状。持续充气直至结肠呈饱满状态，无可见皱褶（图 1H）。</li>
	<li>将注射器/结肠放入含 5 mL 冰上预冷的细胞回收溶液的 15 mL 离心管中，孵育 20 分钟，每 5 分钟充气和放气一次（图 1I）。孵育期间，结肠必须保持充气状态。</li>
	<li>在重复使用型注射器管尖下方、结肠仍处于充气状态下，用 4-0 丝线结扎。将结肠香肠从重复使用型注射器上剪下，放入含 10 mL 50 mM（小肠为 2 mM）EDTA 的 15 mL 离心管中，4 °C 旋转孵育 40 分钟（图 1J、K）。</li>
	<li>倾去 EDTA 溶液，加入 5 mL 振荡缓冲液。将结肠香肠手动在垂直位置剧烈振荡 2 分钟。</li>
	<li>将振荡后的液体倒入新的 15 mL 离心管中，并重复振荡步骤，共收集 10 mL 含隐窝的振荡缓冲液。</li>
	<li>取 20 µL 隐窝悬液置于培养皿中，在显微镜下计数隐窝数量。计算隐窝浓度（隐窝/µL）。根据浓度调整样品稀释度，使铺板时达到每 µL 含 5 个隐窝（1000 隐窝/cm2）。</li>
	<li>将含有分离隐窝的离心管在台式离心机中以 400 × g 在 4 °C 离心 10 分钟。</li>
	<li>同时，从培养箱中取出 48 孔板/插件/腔室载玻片，放入生物安全柜中。使用 P200 移液器吸除包被溶液，并将板盖略微偏移，待细胞准备好后立即进行铺板。</li>
</ol>
4. 培养二维单层细胞
注意：有关如何从三维结肠类器官生成肠道上皮单层的详细方案，请参阅 Estes 和 Kovbasnjuk 实验室的方案（7,11）。
<ol>
	<li>使用10 mL刻度吸管移除振荡缓冲液。确保沉淀完整，并用P1000移除残留液体。将沉淀重悬于3 mL LWRN完全培养基中，用P1000反复吹打混匀。将200 µL隐窝结构加入预先包被的48孔板/腔室载玻片的每个孔中，在37 °C、5% CO2培养箱中孵育。</li>
	<li>次日使用P200吸除培养基，并加入新鲜培养基。细胞在24–48小时内达到融合状态。</li>
	<li>对于细胞培养膜插件，在插件上层加入200 µL隐窝悬液（5个隐窝/µL），下层加入600 µL完全L-WRN培养基。次日使用P200吸除培养基，仅向上层腔室加入新鲜培养基。将培养板置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育。每天使用上皮细胞电压/电阻测量仪（EVOM）测定跨上皮电阻（TEER）。 
	注意：若培养物的TEER值超过300 Ω·cm2，表明细胞已融合。融合通常在3–4天内完成。每2天更换一次培养基。</li>
</ol>

<ol><li>Quiros, M., Nusrat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+wound-associated+cells+and+mediators+in+orchestrating+gastrointestinal+mucosal+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Contribution of wound-associated cells and mediators in orchestrating gastrointestinal mucosal wound repair.</a> Annual Reviews in Physiology. 81, 189-209 (2019).</li>
<li>Blutt, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+organoids+to+study+regenerative+responses+to+intestinal+damage%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Use of organoids to study regenerative responses to intestinal damage.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 317 (6), 845-852 (2019).</li>
<li>Zhang, M., Liu, Y., Chen, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+3D+human+gastrointestinal+organoids%3A+principle+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Generation of 3D human gastrointestinal organoids: principle and applications.</a> Cell Regeneration. 9 (1), 6(2020).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+enteroids%2Fcolonoids+and+intestinal+organoids+functionally+recapitulate+normal+intestinal+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3759-3766 (2016).</li>
<li>Kozuka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+human+and+mouse+intestinal+epithelial+cell+monolayer+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a human and mouse intestinal epithelial cell monolayer platform.</a> Stem Cell Reports. 9 (6), 1976-1990 (2017).</li>
<li>In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+colonoid+monolayers+to+study+interactions+between+pathogens%2C+commensals%2C+and+host+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), e59357(2019).</li>
<li>Cardenas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-+and+three-dimensional+bioengineered+human+intestinal+tissue+models+for+cryptosporidium%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Two- and three-dimensional bioengineered human intestinal tissue models for cryptosporidium.</a> Methods in Molecular Biology. 2052, 373-402 (2020).</li>
<li>Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+primary+mouse+intestinal+epithelial+cell+monolayer+culture+system+to+evaluate+factors+that+modulate+IgA+transcytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis.</a> Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).</li>
<li>VanDussen, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+enhanced+human+gastrointestinal+epithelial+culture+system+to+facilitate+patient-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays.</a> Gut. 64 (6), 911-920 (2015).</li>
<li>Zou, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+intestinal+enteroids%3A+New+models+to+study+gastrointestinal+virus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Human intestinal enteroids: New models to study gastrointestinal virus infections.</a> Methods in Molecular Biology. 1576, 229-247 (2019).</li>
<li>Heijmans, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+stress+causes+rapid+loss+of+intestinal+epithelial+stemness+through+activation+of+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response.</a> Cell Reports. 3 (4), 1128-1139 (2013).</li>
<li>Nik, A. M., Carlsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+intact+intestinal+epithelium+from+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Separation of intact intestinal epithelium from mesenchyme.</a> Biotechniques. 55 (1), 42-44 (2013).</li>
</ol>

作者不存在任何利益冲突。

本方案提供了一种快速、可重复且可靠的直接生成原代2D肠上皮细胞（IEC）单层的方法。与先前发表的结肠上皮单层培养方案相比，本方案的一个主要区别在于，我们不将结肠切成小块以释放隐窝。相反，我们改进了一种通过化学和机械力相结合的方法，将肠上皮与间质组织分离13，从而获得极为纯净的隐窝制备物（图2），为研究者提供了理想的原代培养材料。我们的分离方法也可用于生成3D肠类器官和结肠类器官。每次实验时都必须进行隐窝计数，以标准化接种的隐窝数量。诸如结肠“香肠”张力、分离速度以及操作者经验等因素均可能影响所分离隐窝的数量。方案中建议的隐窝接种浓度仅作为起始参考值，每位操作者均需根据自身操作相关变量对其进行优化。我们已在8至20周龄的雄性和雌性野生型（WT）小鼠中应用此技术，未观察到细胞存活率存在显著差异；理论上，来自较年轻小鼠的隐窝具有更高的存活几率。隐窝接种时需过量加入，因为仅有少数隐窝能够附着于表面并存活。理想状态是接种后一天达到约50%的融合度，既保证有足够的隐窝生长，又避免过多死亡隐窝产生细胞毒性作用。接种24小时后必须小心移除LWRN培养基，以清除死亡的隐窝和碎片，此步骤需谨慎操作，防止已贴壁并开始以单层形式生长的细胞被剥离。
在初次去除LWRN培养基后，操作者需根据实验条件决定是否需要保持接近干细胞状态的原代IEC单层细胞，此时应添加新鲜的LWRN培养基；若希望诱导单层细胞分化，则更换为分化培养基。本实验方案中最关键的因素是在分离过程中确保结肠组织的完整性。如果发生破裂，可将肠段缩短以去除受损区域。在将肠段放入EDTA溶液前，务必确保两端结扎尽可能紧密。若EDTA孵育后肠段出现塌陷，仍可继续实验流程，对最终隐窝产量影响较小或无明显影响。若无重复使用注射器，也可使用普通移液器吸头连接常规注射器完成充气与放气操作。此外，若无细胞回收溶液，充气与放气步骤也可在EDTA溶液（小肠使用2 mM，结肠使用50 mM）中进行，但不推荐此替代方法。若无需达到完全汇合状态，隐窝可在仅包被胶原蛋白的培养板中生长，甚至可在未包被的培养板中生长。仅在别无选择的情况下使用未包被的培养板，但细胞生长状态将不如在胶原蛋白包被板中健康。就培养状态与稳定性而言，接种于普通塑料培养板中的单层细胞可维持健康状态4至5天，而接种于Transwell小室中的单层细胞可维持长达8天。
该方法的主要局限之一在于培养结肠上皮单层细胞所需的细胞培养基。LWRN细胞可从ATCC获得，但制备LWRN条件培养基过程繁琐，且需要使用荧光分光光度计来测定Wnt活性。分化培养基需要在使用前新鲜添加多种试剂，使得该过程较为费时。此外，这些试剂大多价格昂贵，且容易在快速操作中被浪费。如果一个实验室希望在没有既往肠道原代细胞培养经验的情况下建立该技术，强烈建议寻找具有相关经验的合作方或院校，并派遣其成员接受培训。
由于需要使用基底膜基质培养基以及大量条件培养基来培养类器官，三维培养的维持成本可能较高；但其优势在于所需实验小鼠数量较少，且所获得的结构可多次传代。肠类器官（来源于小肠）相对容易分离和维持，而结肠类器官则更为脆弱，生长速度较慢，传代能力也更有限。由三维结肠类器官生成单层细胞需要消耗大量三维结构，使得此类实验耗时且成本高昂。相比之下，直接制备结肠上皮单层细胞快速简便，能够迅速获得实验结果。一次结肠组织制备可于接种后2至3天内形成75 cm2的融合单层（仅需10至15 mL条件培养基，更换一次）；而要达到相同面积需使用144孔三维结肠类器官，相当于消耗近6 mL Matrigel及超过250 mL条件培养基。上皮结肠单层细胞具有培养基消耗少、细胞培养维护成本低、可进行功能检测&#160;以及下游处理快速等显著优势。
该方案是研究肠上皮细胞生物学的重要工具，适用于细胞黏附、极性和分化等领域。其优势在于能够利用基因修饰小鼠（如基因敲除、过表达、报告基因小鼠）建立原代细胞培养。原代肠上皮单层细胞在transwell培养时可方便地接触其顶膜和基底膜表面，从而便于研究通透性、屏障功能以及不同类型细胞的跨上皮迁移。最后，该模型在宿主-病原体相互作用、上皮损伤与修复以及药物发现等多个研究领域均具有重要应用价值。

肠上皮细胞（IEC）排列在肠道内壁，形成一种选择性通透的屏障，允许营养物质和水分被吸收，同时阻止微生物和毒素进入体内1。肠黏膜由管腔侧的突起结构（称为绒毛，仅存在于小肠）和凹陷结构（称为隐窝）组成。绒毛以及结肠隐窝的表面覆盖着已分化的上皮细胞，而隐窝底部则含有干细胞，这些干细胞使肠上皮能够快速更新，其更新周期为3至7天。肠干细胞（ISC）不仅对维持肠道稳态至关重要，也在受损上皮的适当修复过程中发挥重要作用2。
肠道上皮生物学的研究因缺乏原代细胞培养而受到限制&#160;转化细胞系&#160;唯一可用的工具。肠道上皮模型细胞系无法准确模拟正常肠道上皮的生理特性。源自肠干细胞（ISC）的三维培养技术的建立，为肠道黏膜生物学研究者提供了能够模拟体内肠道黏膜环境的体外模型。3隐窝可轻松从鼠类样本中分离，嵌入基底膜基质培养基（例如 Matrigel）中，并在含有 Wnt3a、R-spondin 和 Noggin 的条件培养基中培养，从而形成称为肠类器官（小肠）或结肠类器官（大肠）的三维结构4类肠体和类结肠体是具有极性的球形结构，其顶端区域朝向内部腔隙，而基底外侧区域则直接与细胞外基质接触。类肠体和类结肠体包含所有主要的已分化肠道上皮细胞亚型，如肠细胞/结肠细胞、潘氏细胞、肠内分泌细胞和杯状细胞，且这些细胞的相对比例与它们来源的肠道节段中的比例大致相同。5尽管类器官（3D肠类器官和结肠类器官）在肠道发育与生理学研究中取得了重大进展，但这些模型仍存在某些局限性，例如难以接近上皮细胞的顶面（管腔）以及无法灵活扩大或缩小培养规模以实现对目标分子的高通量筛选。为克服这些限制，已开发出从3D肠类器官/结肠类器官获得原代2D肠上皮细胞（IEC）培养物的技术方案。2D肠类器官/结肠类器官以细胞单层形式生长，类似于传统的细胞系，非常适合用于研究肠道损伤修复、宿主-病原体相互作用以及再生医学等领域。已有多个发表的研究报道了如何从3D结构或直接从肠隐窝分离制备2D单层细胞培养物（参见6,7,8,9,10,11但这些方法通常费时费力且难以重复。本方案概述了一种快速、简单且可重复的方法，可直接从新分离的小鼠肠隐窝获得单层细胞。
本文详细介绍了在尽量减少碎片产生的前提下进行隐窝提取的流程，包括细胞外基质的选择，以及该技术所适用的不同表面和应用场景。该实验方法针对结肠隐窝进行了优化，但在应用于小肠时也可获得类似结果。

<table><tbody><tr><td>高级DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌溶液</td><td>康宁</td><td>30-004CI</td><td></td></tr><tr><td>B27添加剂（50倍浓缩液）</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>细胞回收溶液</td><td>康宁</td><td>354253</td><td></td></tr><tr><td>人胎盘胶原蛋白（IV型）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>D-山梨醇</td><td>Sigma</td><td>85529-250G</td><td></td></tr><tr><td>D-蔗糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;含钙磷酸盐缓冲液&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; （DPBS）</td><td>康宁</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>上皮细胞伏特/欧姆计</td><td>World Precision Instruments</td><td>0-10K&amp;Omega; 使用 STX2（EVOM2）</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Lonza</td><td>51201</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>康宁</td><td>35-016-CV</td><td></td></tr><tr><td>萤光素酶检测</td><td>Biotium</td><td>30085-2</td><td></td></tr><tr><td>遗传霉素</td><td>Gibco</td><td>10131-035</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX（100倍浓缩液）</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>康宁</td><td>25060CI</td><td></td></tr><tr><td>人重组EGF</td><td>R&amp;amp;D 系统</td><td>236-EG</td><td>储存浓度：500&amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>人重组 Wnt-3A</td><td>R&amp;amp;D系统</td><td>W3a-H-005</td><td></td></tr><tr><td>潮霉素B</td><td>Invitrogen</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>LWRN 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3276</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学级水</td><td>康宁</td><td>46-000-CV</td><td></td></tr><tr><td>N2 补充剂（100 倍浓缩）</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-乙酰-L-半胱氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td>储存浓度：500 mM</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>条件培养基</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek 培养皿腔室系统</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7182-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>康宁</td><td>30002CI</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液，Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;2+ &lt;/sup&gt;游离（PBS）</td><td>康宁</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>塑料20G喂养管</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-810-46</td><td></td></tr><tr><td>rh-laminin-521</td><td>Gibco</td><td>A29248</td><td>储备浓度：100&amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Roboz 外科用 4-0 黑色编织丝线 100 码</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9452680</td><td></td></tr><tr><td>TOPflash HEK293 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3249</td><td></td></tr><tr><td>Transwell 可渗透支持膜（0.4&amp;micro;m)</td><td>康宁</td><td>3470</td><td></td></tr></tbody></table>

从小鼠肠道隐窝生成原代结肠上皮单层细胞

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

肠上皮由单层细胞构成，作为肠道腔与机体内部之间的屏障。该屏障连续性的破坏可能导致炎症性肠病等炎性紊乱。在肠上皮生物学研究中，一个局限在于缺乏原代细胞培养模型，这迫使研究人员使用源自癌瘤的模式细胞系。三维（3D）类肠体的出现为上皮生物学研究者提供了强大的工具，可用于建立原代细胞培养，然而这些结构嵌于细胞外基质中，且缺乏分化肠上皮细胞所具有的成熟特性。已有多种构建肠上皮单层的方法被发表，但大多数方法均基于已建立的三维类肠体，使过程繁琐且成本高昂。本文中，我们描述了一种直接从小鼠肠隐窝生成原代结肠上皮单层的方案。我们还详细说明了可与此模型结合使用的实验方法，例如在可渗透滤膜上生成汇合培养物、用于划痕损伤修复研究的汇合单层，以及用于免疫荧光分析的稀疏和汇合单层。

为了说明原代结肠上皮单层培养的可靠性，本文展示了隐窝分离的总结以及根据该方案获得的代表性图像。使用者必须注意，分离得到的隐窝需在无菌条件下进行培养，因此正确地解剖和清洗结肠是首要步骤。图1展示了隐窝分离过程中的关键步骤。分离后的隐窝（图2A）现在进行计数并浓缩（图2B），以获得5个隐窝/µL的浓度。在完成隐窝浓缩制备后，细胞将被接种至所需的培养格式中（培养皿、膜插件或腔室载玻片），并根据实验需求加入相应的培养基进行孵育。图3显示了在48孔板中培养24小时和48小时后的培养进展。细胞持续孵育直至达到所需的汇合度。为了展示该方法可能的应用，我们让48孔板中的细胞生长至完全汇合，随后进行划痕损伤实验。图4展示了在二维结肠类器官单层中 freshly 制备的划痕（图4A）以及同一划痕在24小时后的修复情况（图4B）。显然，该培养体系仍然健康且具有活性，并表现出明显的伤口修复能力。为了生成分化型单层细胞，需将培养基从LWRN更换为分化培养基。通过检测较高的跨上皮电阻值（TEER）（图5A）、肠干细胞标志物的减少（富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5（Lgr5）和Achaete-scute样2（Ascl2）），以及分化标志物的增加（丙氨酰氨基肽酶（Anpep）、黏蛋白2（Muc2）、溶菌酶1（Lyz1）、蔗糖-异麦芽糖酶（Sis）和嗜铬粒蛋白A（Chga））（图5B、C）（通过PCR检测），可证实细胞已实现分化。此外，CDX2和KRT20等其他标志物也可纳入此检测面板。除了mRNA表达水平外，在分化条件下培养的二维结肠类器官中，分化上皮细胞亚型的出现也通过免疫荧光染色得到证实（Muc2和Chga；图5D）。
<img alt="实验室实验中的组织灌注装置，展示逐步的注射器方法和组织处理。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62156/62156fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：健康单层细胞制备的样本处理。 样本制备对于生成健康的单层细胞至关重要。本图展示了分离过程中的关键步骤，以便读者理解。从小鼠体内切除结肠时，需确保无毛发残留。小心清除粪便，注意不要穿孔结肠；这一点极为重要，因为结肠必须能够保持空气并实现充气与放气。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62156/62156fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜图像显示细胞浓度处理过程：初始制备与浓缩后对比。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62156/62156fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：隐窝分离计数与浓度调整。（A）结肠香肠振荡后获得的结肠隐窝。图像显示20 µL液滴的一个视野。（B）隐窝浓缩处理，以获得5个隐窝/µL的浓度。比例尺：1 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62156/62156fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞生长比较、显微镜图像、铺板后24小时和48小时、细胞增殖分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62156/62156fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：原代肠上皮细胞单层生长情况。（A）铺板24小时并清除细胞碎片后的二维肠上皮细胞单层。（B）铺板48小时后融合的二维肠上皮细胞单层。比例尺：10 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62156/62156fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞迁移过程；伤口愈合实验；显微镜图像；虚线表示划痕边界。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62156/62156fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：使用小鼠原代肠上皮细胞进行的划痕伤口愈合实验。 图像显示在结肠上皮单层细胞上制造划痕后伤口愈合的情况。比例尺：5 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62156/62156fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="TEER实验结果；图表显示干细胞和分化标志物；荧光图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62156/62156fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
图5：结肠上皮单层细胞的分化。 （A）分化培养基可形成紧密的上皮屏障，TEER检测结果证实了这一点。分化培养基导致（B）干细胞标志物的mRNA表达下降，以及（C）分化标志物的上调。（D）通过直接二维结肠类器官的免疫荧光染色，也可检测到Muc2和嗜铬粒蛋白A等特化分化上皮细胞的标志物。比例尺：5 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62156/62156fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

在本实验方案中，我们描述了如何直接从肠隐窝分离并培养小鼠原代结肠上皮单层细胞。我们提供了在可渗透滤膜上生成汇合单层细胞的实验方法，用于划痕伤口愈合及生物化学研究的汇合单层细胞培养方法，以及用于免疫荧光分析的稀疏和汇合单层细胞培养方法。

肠上皮由单层细胞构成，作为肠道腔与机体内部之间的屏障。该屏障的破坏会……

本方案提供了一种快速、可重复且可靠的方法，可在不同表面上生成直接的原代肠上皮单层细胞，且碎片最少。该方案的主要优势在于培养基消耗量低，细胞培养的维护成本低。该方法可快速进行功能检测及后续应用。本方案将有助于研究伤口修复、通透性屏障以及不同类型细胞的跨上皮迁移。此外，该模型还可用于宿主-病原体相互作用、受损上皮以及药物发现的研究。首先，向48孔板和腔室载玻片的每个孔中加入200 µL包被液。将两者在37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中预孵育两小时。用200微升胶原蛋白溶液包被0.4微米细胞膜插入物。将含膜插入物的培养板在4摄氏度孵育30分钟，然后转移至37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中孵育两小时。用70%乙醇对已安乐死的小鼠进行消毒，然后借助剪刀和镊子从直肠到盲肠处解剖出结肠。使用装有20号喂养管的10毫升注射器，以冰冻的PBS轻柔冲洗粪便。去除近端结肠，并将远端结肠轻柔地套入20号喂养管上。用4-0丝线在导管末端结扎结肠。将结扎端的结肠翻转至内侧，另一端也用丝线结扎，然后用手术剪在喂养管尖端下方剪断结肠。用1.25毫升重复使用注射器的推杆轻轻将翻转后未结扎端的结肠套在注射器尖端上。将翻转的结肠未打结的一端套在注射器上，并用线绳紧紧扎牢。将活塞插入注射器，充气使结肠膨胀至外观饱满、无可见皱褶。将膨胀后的结肠样结构置于含有5毫升细胞回收溶液的15毫升离心管中，冰上孵育20分钟。每5分钟对结肠进行一次充气和放气。使用4-0丝线在重复注射器尖端下方结扎已充气的结肠。将结肠肠段从重复注射器上剪下，放入含有10毫升50毫摩尔EDTA的15毫升离心管中，孵育40分钟。将试管在4°C条件下旋转。用5毫升振荡缓冲液替换EDTA溶液，将肠段在垂直位置手动振荡2分钟。将振荡液倾入新的15毫升离心管中，并重复振荡步骤，直至总共收集到10毫升隐窝和振荡缓冲液。在显微镜下计数20微升悬浮液中的隐窝数量，并将样品稀释至每微升含5个隐窝。将隐窝样品在4°C条件下以400 × g离心10分钟。在此期间，从培养箱中取出48孔板和膜插件，并将其放入生物安全柜中。使用P200移液器吸除包被液，并将培养板盖子略微偏移，静置直至细胞准备接种。将隐窝悬液离心后，去除振荡缓冲液，并将完整沉淀重悬于3 mL LWRN完全培养基中。向每孔预包被的48孔板及腔室载玻片中加入200 µL隐窝悬液，并将两者置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育。第二天，吸除培养基并加入新鲜培养基。通常情况下，细胞在24至48小时内达到融合状态。对于细胞培养膜插件，在插件顶部加入200 µL隐窝结构，在底部加入600 µL完全LWRN培养基。第二天，吸除培养基，仅向顶室加入新鲜培养基。将培养板置于37°C、5%二氧化碳培养箱中孵育。使用上皮细胞伏特/欧姆计每天测量跨上皮电阻。从鼠结肠中分离隐窝并验证浓度后，将隐窝悬液浓缩至每微升含5个隐窝。当细胞达到汇合时，对48孔板的孔进行划痕伤口实验。24小时后观察到伤口修复，表明培养物健康且具有活性。当培养基从 LWRN 更换为分化培养基时，获得了更高层次的细胞分化水平。同时观察到肠上皮干细胞标志物减少，而分化标志物增加，表明已成功生成分化的单层细胞。此外，通过免疫荧光显示，在不同培养条件下生长的分化上皮细胞亚型均出现。在进行该实验方案时，重要的是确保结肠在制备过程中的任何阶段均未发生破裂，并保持充气状态，以获得极为洁净的隐窝释放效果。一旦形成二维肠道上皮细胞单层，即可进行免疫荧光、划痕损伤和通透性检测以及其他后续应用。这将有助于深入了解伤口愈合、不同类型细胞的迁移，以及上皮修复与损伤研究。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

来自肠道密码的穆林原结肠上皮单层的生成

来源：In, J. G.,等. 利用人类结肠类器官单层培养研究病原体、共生菌与宿主肠上皮之间的相互作用. J. Vis. Exp.

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从小鼠肠道隐窝生成原代结肠上皮单层细胞

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