来自肠道密码的穆林原结肠上皮单层的生成
February 6th, 2021
在此协议中，我们描述了如何直接从肠道密码生成穆林原发性上皮结肠单层。我们提供实验方法，在透气过滤器上生成汇流单层，在划痕伤口愈合和生化研究中产生汇流单层，以及用于免疫荧光分析的稀疏和共生单层。
我们的协议提供了一个快速、可重复和可靠的方法，在不同表面上以最小的碎屑生成直接的原肠道上皮单层。该协议的主要优点是低媒体消费和低成本维护细胞培养。它是一种快速执行功能测试和快速下游应用的方法。
该协议将为研究不同细胞类型的伤口修复、渗透屏障和跨皮迁移提供见解。此外，该模型可用于宿主-病原体相互作用、受损上皮和药物发现。首先，在 48 井板和室滑梯的每口井中添加 200 微升涂层溶液。
在37摄氏度的5%二氧化碳孵化器中预孵化两小时。涂层 0.4 微米细胞膜插入 200 微升胶原蛋白溶液。在 4 摄氏度下用膜插入将板孵化 30 分钟，然后将其转移到 37 摄氏度的 5% 二氧化碳孵化器中，为期两小时。
用70%乙醇对安乐死小鼠进行消毒，然后用剪刀和钳子将结肠从直肠解剖到粪便。用装有20个仪表喂食管的10毫升注射器用冰冷的PBS轻轻冲洗粪便。取出近结肠，轻轻地将分号结肠滑到 20 仪表喂食管上。
用 4-0 丝缝线将管末端的结肠绑起来。将结肠从内到外倒置在绑的末端，用螺纹将另一端绑起来，然后用手术剪刀将结肠切入喂食管尖端以下。使用柱塞轻轻打开倒置冒号的未绑结肠末端到 1.25 毫升重复注射器的尖端。
将倒置结肠的解开端滑动到注射器上，用螺纹将其紧密绑住。将柱塞插入注射器，使结肠充气，直到它看起来结肠结肠结石，没有明显的皱纹。将膨胀的结肠香肠放在一个15毫升的管子里，在冰上含有5毫升的细胞恢复溶液，为期20分钟。
每五分钟充气和放气一次结肠。使用 4-0 丝缝线将重复注射器尖端下方的充气结肠绑起来。将结肠香肠从重复注射器上切下来，放在含有 10 毫升 50 毫升 EDTA 的 15 毫升管中 40 分钟。
在四摄氏度下旋转管子。用五毫升摇床缓冲器替换 EDTA 溶液，在垂直位置手动摇动香肠两分钟。将摇动溶液放入新的 15 毫升管中，重复摇动步骤，直到收集总共 10 毫升的加密和摇动缓冲器。
在显微镜下计算悬架中 20 微升的墓穴数量，稀释样品，以获得每微升 5 个密码的浓度。在4摄氏度下，将加密样品在400倍G下离心10分钟。同时，从孵化器中取出48井板和膜插入物，并将其放置在生物安全柜中。
使用 P200 移液器吸气涂层溶液，将板盖稍稍偏移，直到细胞准备好镀层。离心后，将加密悬架移除摇晃缓冲，并将完整的颗粒重新用三毫升 LWRN 完整介质。在涂层前的 48 井板和室滑梯的每口井中加入 200 微升的墓穴，并在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳孵化器中孵化。
第二天，吸气媒体，增加新鲜媒体。一般来说，细胞在24至48小时内汇总。对于细胞培养膜插入，在插入器顶部添加 200 微升的加密器，在底部添加 600 微升完整的 LWRN 介质。
第二天，吸气媒体，只添加新鲜媒体到顶部室。在37摄氏度的5%二氧化碳孵化器中孵化板。每天使用上皮伏/欧米测量跨皮电阻。
在将墓穴从穆林结肠中分离出来并验证浓度后，墓穴悬架被集中到每微升5个墓穴。48井板井在到达细胞汇合处时受到划伤检测。24小时后，伤口修复观察表明，该文化是健康和可行的。
当媒体从 LWRN 更改为分化媒体时，实现了更高的级别值。此外，还观察到 ISC 标记的减少和分化标记的增加，表明分化单层成功生成。此外，在不同条件下生长的分化上皮细胞的亚型外观也通过免疫荧光表现出来。
在尝试此协议时，重要的是要确保结肠在准备期间的任何时间点不会破裂，并保持充气以在极其干净的准备中释放密码。一旦2d肠道上皮细胞单层形成，我们可以执行免疫荧光，划伤和渗透检测和其他下游应用。这将提供伤口愈合、不同细胞类型迁移以及上皮修复和损伤研究方面的知识。
概述
本协议概述了一种从小鼠肠隐窝中生成原代肠道上皮单层的可靠方法，能够进行伤口修复和通透性屏障功能的研究。主要优势包括低培养基消耗和快速实验应用。
关键研究组成部分
研究领域
- 细胞生物学
- 伤口修复机制
- 跨上皮迁移研究
背景
- 肠上皮细胞在屏障功能和营养吸收中起着至关重要的作用。
- 对这些细胞的研究有助于理解宿主-病原体相互作用。
- 原代细胞培养模型对于生理相关性是必要的。
使用的方法
- 从小鼠结肠中分离肠隐窝。
- 在膜插入物和48孔板上培养。
- 使用免疫荧光和划痕伤口测定进行功能评估。
主要结果
- 成功生成了用于各种测定的汇流单层。
- 单层展示了健康的细胞特征和分化。
- 观察到有效的伤口愈合和电阻测量。
结论
- 该研究为在研究中使用原代小鼠肠道上皮细胞建立了框架。
- 该模型可以促进药物发现和理解上皮修复过程的进展。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables rapid generation of primary murine intestinal epithelial monolayers directly from crypts, reducing reliance on immortalized cell lines and improving physiological relevance in preclinical models. The model supports functional assays critical for evaluating barrier integrity, wound healing, and host-pathogen interactions in early discovery. Its low cost, reproducibility, and compatibility with downstream applications enhance translational confidence in gastrointestinal target validation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of epithelial barrier function and repair mechanisms using physiologically relevant primary cells.
- Operational Value: Provides a rapid, low-cost system for testing compound effects on monolayer integrity and permeability.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates confluent monolayers suitable for quantitative permeability and transepithelial electrical resistance (TEER) measurements.
- Operational Value: Supports scratch wound and immunofluorescence assays to assess wound repair and cellular differentiation in high-content formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Differentiation marker shifts confirm model maturity, enabling study of epithelial subtypes and lineage commitment.
- Operational Value: Facilitates preclinical evaluation of drug candidates in a system that mimics in vivo epithelial responses to injury and repair.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a primary cell-based platform for hypothesis testing in gastrointestinal biology, bridging crypt isolation to functional phenotypic readouts.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking of targets involved in epithelial homeostasis, repair, and barrier function.
- Screening: Enables standardized, reproducible assays for compound screening using TEER and wound healing as quantitative endpoints.
- Analytics: Delivers measurable outputs including TEER values, wound closure rates, and immunofluorescence signal intensity for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical validation through differentiation-competent monolayers that model human epithelial responses.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable primary cell platform applicable across multiple projects in gastroenterology, immunology, and infectious disease.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing artifacts from transformed cell lines and enhancing target validation in native epithelial contexts.
- Operational Value: Minimizes reagent consumption and culture maintenance burden, supporting scalable use across discovery teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing early functional readouts on epithelial integrity and repair capacity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on effects in a physiologically relevant epithelial barrier model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine tissue dissection and crypt isolation techniques.
- Depends on sterile cell culture infrastructure and equipment for TEER measurement and immunofluorescence imaging.
- Necessitates standardization of crypt concentration and plating density across users and laboratories.
- Adaptation to human or other species tissues may require optimization of enzymatic and mechanical dissociation steps.
- Long-term culture stability and full differentiation maturity may be limited compared to organoid-derived models.
