利用活体成像技术观察氧化损伤对果蝇卵室的影响

我们的实验室利用黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）来鉴定和表征在发育及生理稳态过程中调控线粒体功能的基因与信号通路。本文所展示的方案通过活体成像并添加过氧化氢，以观察氧化损伤对成年果蝇卵巢中亚细胞结构定位与动态行为的影响。我们经常使用成像技术研究基因突变如何改变雌性生殖细胞中线粒体的正常定位与运动。

在研究过程中，我们发现由解剖或其他细胞应激因素引入的应激对线粒体定位具有显著影响。为确定亚细胞结构定位或行为的任何变化是否由一般性应激（而非实验处理）引起，我们设计了此方案，利用过氧化氢引入对照应激。

在本视频中，我们将演示过氧化氢诱导的氧化损伤如何改变线粒体和核糖核蛋白Clu的分布。最适合此活体成像技术的培养基包含Schneider's Drosophila培养基，其中添加15%热灭活胎牛血清、0.6 X 青霉素-链霉素和200微克每微升牛胰岛素，以下简称为完全Schneider's培养基。在无菌条件下进行培养基制备，可确保其不被污染。

充分混匀内容物，并在4°C下过夜保存。胰岛素在完全Schneider培养基中不能完全溶解，您会观察到沉淀物沉降至管底。分装时务必避免转移此沉淀物，因其会干扰成像。

若将该溶液分装后于4°C保存，可使用一个月。为获得最佳的雌性生殖细胞成像效果，首先准备一个含有少量湿酵母糊的小瓶，其稠度应类似于花生酱。这可确保雌性果蝇营养充足，从而产生所有发育阶段的卵泡，便于成像观察。

为了获得最健康的果蝇，收集0至1日龄的雌蝇，并与雄蝇一同转移到含有湿酵母糊的果蝇培养管中。注意确保麻醉后的果蝇不要接触到酵母糊，以免粘附其上。饲喂果蝇3至7天，每天更换一次酵母糊。

确保酵母糊与果蝇食物接触，以免其干燥。为了诱导氧化损伤，我们将使用30%过氧化氢的储备液；为了观察线粒体，我们将使用100毫摩尔的TMRE储备液。必须新鲜配制培养基溶液，因为过氧化氢易被氧化，而TMRE会随时间降解。

解剖前立即在完全Schneider培养基中，分别新鲜配制2 µM过氧化氢、46 nM TMRE，以及含2 µM过氧化氢的46 nM TMRE混合液。进行卵巢解剖时，需准备两对精细镊子和一对电解 sharpened 钨针。解剖卵巢时，先将已预热至室温的完全Schneider培养基加入表面皿中，然后用镊子将一只果蝇放入培养基内。

使用一对精细镊子轻轻夹住果蝇的胸部。用另一对镊子夹住其后端，轻轻拉动以取出卵巢。去除多余的角质层或组织，然后将卵巢转移至含有新鲜培养基的新孔中。

卵巢仍应从周围的肌鞘中分离出来。使用 sharpened tungsten needles 轻轻分离卵管，注意去除周围的肌鞘。如果未去除肌鞘（如此处所示），卵巢将发生抽搐，导致成像过程中出现问题。

一旦将卵管完整解剖出来，若需观察内源性标记的结构，则将其转移至 MatTek 培养皿中体积为 100 微升的培养液液滴内；若需观察经 TMRE 标记的线粒体，则将卵管转移至 MatTek 培养皿中体积为 100 微升的 TMRE 培养液液滴内。卵管将沉降至液滴底部。

为了能够尽快开始组织成像，练习解剖操作非常重要。将卵管安装好后，立即将培养皿置于倒置显微镜下，采集静态图像或短时视频，以记录处理前的状态。完成此步骤后，暂停活体成像，取下盖子，小心加入100微升已配制的2微摩尔过氧化氢溶液。

避免破坏现有培养基液滴的表面或过快添加溶液，以免移位沉在底部的卵巢管。盖上培养皿盖，移动并重新对焦目标卵巢管，然后继续成像。请注意尽快恢复成像，因为实验处理具有时间敏感性。

图中所示为过氧化氢处理后拍摄的显微动态图像的静态截图。当果蝇营养充足且健康时，线粒体和雌性生殖细胞均匀分散在细胞质中。加入过氧化氢后，氧化损伤导致线粒体聚集，处理后仅10分钟即可观察到此现象。

20分钟后，损伤导致线粒体膜电位消散，因此大部分线粒体会逐渐消失。在此过程的活细胞成像视频中，可以观察到线粒体迅速聚集，最终大部分线粒体逐渐消退。

细胞质中的脉冲式闪烁，特别是在周围的滤泡细胞中，表现为添加TMRE的典型特征。如前所述，在加入过氧化氢后必须尽快进行成像。如图所示，如果间隔时间过长，线粒体膜电位将已经丧失，TMRE标记随之消散，导致数据无法解读。

在这些视频静态图像中，GFP 内源性标记的 Clu 颗粒在营养充足雌性的生殖质中数量丰富且信号强烈。加入过氧化氢后，Clu 颗粒在 10 分钟内发生弥散。这一现象在随附的视频中有所展示。

加入过氧化氢后，Clu bliss 颗粒迅速分散。我们发现该方案是确保准确成像果蝇雌性生殖细胞中线粒体和 Clu bliss 颗粒野生型定位的有效工具。该方案应适用于多种活体成像研究，也可用于固定前的组织处理。

最关键的步骤包括：分离出无肌鞘的卵巢管，轻柔地加入过氧化氢以避免移位卵巢管，以及在加入过氧化氢后迅速进行成像。我们希望您发现这是一种用于活体成像多种亚细胞结构的有用对照。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。