神经元发育过程中的 ROS 活细胞成像

我们的协议描述了在培养斑马鱼神经元和幼虫中使用过氧化氢生物传感器。该协议将帮助研究人员剖析活性氧物种在正常生理学和病理生理学中的作用。这项技术的主要优点是实时检测活体动物和培养细胞中的过氧化氢。

这种方法可以应用于其他动物，如啮齿动物模型系统。要准备盖片，请使用储存在 100% 乙醇中的酸洗盖片。使用钳子从存储容器中取出一个盖片，并点燃它以去除残留的乙醇。

空气完全干燥盖片，将其以一个角度放置在35毫米培养盘内。准备聚-D-莱辛或PDL，或工作解决方案。将 PDL 涂抹到每个盖片的中心，避免溶液扩散到边缘，并在室温下孵化 PDL 20 至 30 分钟。

确保 PDL 不会干涸。用 0.5 毫升无菌水清洗 PDL，让盘子完全干燥。准备层压素工作解决方案。

并将其应用到每个盖片的中心，确保避免溶液扩散到边缘。在潮湿的孵化器中将板在 37 摄氏度下孵化两到六个小时，避免层压素溶液干燥。要在板视网膜结节细胞或RGC中进行胚胎解剖，准备并标记四个35毫米组织培养皿，并填充4毫升70%乙醇。

E2媒体一。E2媒体二。和 E2 媒体三，解剖当天。

把盘子放在冰箱里。当斑马鱼胚胎受精后34小时，将涂有层蛋白的培养皿从孵化器中取出。用 0.5 毫升的 1X PBS 洗盖滑三次。

最后洗完后，在每个培养皿中加入四毫升 ZFCM®介质。避免干燥盘子。取回准备好的冷藏培养皿，使其与室温平衡。

用 15 微升 ZFCM®介质填充 4 到 6 个 PCR 管。从孵化器中取出斑马鱼胚胎，将胚胎浸入含有70%乙醇的35毫米组织培养皿中，5-10秒内进行灭菌。使用移液器的转移，将胚胎转移到E2介质一盘，含有无菌E2介质，以洗去多余的乙醇。

然后，将胚胎转移到E2介质两道菜中，用锋利的钳子去除它们的胆汁。最后，将胚胎移植到E2介质三道菜进行解剖。使用一对细钳，位置和持有胚胎前蛋黄与钳子之一。

并删除尾部后部的蛋黄囊与其他钳子。用钳子抓住脖子，摘下头部，让大脑和眼睛暴露在 E2 介质中。用细钳尖，轻轻地从头部滚动眼睛，同时用第二个钳子按住颅面组织。

将四只眼睛转移到先前准备的含有 ZFCM® 的管子上下三次，用 p20 移液器约 45 次分离细胞。将 ZFCM® 与分离的细胞转移到盖片的中心。将培养物保持在22摄氏度的多苯乙烯泡沫架上，以吸收振动。

在成像当天，检查显微镜下的细胞，以验证 RGC 轴突的生长。对于活细胞成像，将盖片从培养皿转移到活细胞成像室。使用配备 DIC 目标 OG-590 长通红色滤镜和 EMCCD 摄像头的倒置显微镜。

在成像之前，用 ZFCM-后用 10X 目标定位单元替换 ZFCM®介质，使用油浸入目标以 60 倍的放大倍数获取图像。使用额外的 1.5 倍放大倍数。首先获取 DIC 图像。

然后，使用适当的滤镜集对 roGFP2-Orp1 进行映像。拍摄完第一组图像后，与包含不同治疗解决方案的媒体交换介质。应每 30 分钟更换一次成像媒体，以避免 pH 和渗透性变化。

对于体内成像，将 22 至 24 小时受精后胚胎保存在 E3 介质中，其中含有 0.003% 无甲基蓝苯乙烯硫酸酯。每天交换介质并去除死胚胎。在理想年龄，麻醉和安装胚胎在1%的糖在35毫米玻璃底培养皿。

胚胎可以按多面、通风或横向方向，具体取决于成像的兴趣区域。凝固后，用E3介质填充菜肴，不加甲基蓝，但用0.016%三卡因填充。设置显微镜进行成像。

使用倒置激光扫描共聚焦显微镜对安装在糖滴底部的胚胎进行成像。兴奋 roGFP2-Orp1，并获取与所需的排放过滤器相应的图像。通过胚胎所需的部分获得五微米部分厚度的 z 堆栈。

成像后，用细钳从Agarose中取出胚胎，并把它们保存在孵化器和甲基蓝色自由介质中，用苯乙烯硫烯直到预期年龄。此处显示了过氧化氢生物传感器和养殖斑马鱼 RGC 扩展轴突的代表性图像。细胞体、轴龙和生长锥体在单个神经元中清晰可见。

在培养介质中添加过氧化氢可增加比率值，表明该系统可以检测到实时变化。过氧化氢水平的量化显示在面板中，B.To 确定整个斑马鱼胚胎的过氧化氢水平，mRNA在一个细胞阶段被注射，导致所有组织表达roGFP2-Orp1生物传感器。斑马鱼幼虫的头部区域显示在两个不同的时间点，重点是网状腺中的过氧化氢水平。

测量了斑马鱼胚胎中受精后两天和受精后五天过氧化氢的基础水平。在施肥后的两天，比例值明显低于施肥后的五天。此外，每种动物的视网膜过氧化氢含量都有不同程度的增加。

使用细钳去除眼睛和眼睛与移液器的柔和分离是这个程序中最关键的步骤。此协议之后可以进行药物治疗，以调查 ROS 信号中涉及的因素。