Name: 神经元发育过程中的 ROS 活细胞成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 了解利用roGFP2-Orp1生物传感器在斑马鱼神经元和幼体中进行过氧化氢活细胞成像的方法。该技术可实时检测发育过程中的活性氧动态变化，为研究神经生物学和发育生物学提供可靠平台。

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本工作得到了美国国立卫生研究院（资助号 R01NS117701）、美国国家科学基金会（资助号 1146944-IOS）、印第安纳州创伤性脊髓与脑损伤研究基金（资助号 20000289）、普渡大学研究基金会（资助号 209911）以及普渡大学研究与合作伙伴关系执行副校长办公室（资助号 210362）的支持。我们感谢 Cory J. Weaver 博士和 Haley Roeder 建立了斑马鱼视网膜神经节细胞（RGC）培养方案。我们 additionally 感谢 Haley Roeder 提供了图 4 的数据。我们感谢 Leah Biasi 和 Kenny Nguyen 在 RGC 培养方面的帮助。我们感谢 Gentry Lee 对文本的编辑。我们感谢 Tobias Dick 博士提供 roGFP2-Orp1，感谢 Qing Deng 博士提供含有 roGFP2-Orp1 的 pCS2+ 载体。图 2&#160;使用 Biorender.com 制作。

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<li>Breus, O., Dickmeis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+thiol+redox-sensors+in+the+zebrafish+model%3A+Lessons+for+embryonic+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded thiol redox-sensors in the zebrafish model: Lessons for embryonic development and regeneration.</a> Biological Chemistry. , (2020).</li>
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</ol>

作者声明不存在利益冲突。

在整个实验方案中，有几个关键步骤需要&#160;特别注意。我们认为，考虑这些要点将有助于改善实验流程。对于原代视网膜神经节细胞（RGC）培养而言，ZFCM(-) 培养基的无菌性非常重要，因为该培养基不含抗生素，在成像前或成像过程中可能发生污染。为避免污染，我们建议仅在生物安全柜内配制和使用 ZFCM(-)，并定期新鲜配制 ZFCM(-) 培养基（步骤 1.5）。此外，层粘连蛋白（laminin）储备液应保存在 -80 °C。解冻后的层粘连蛋白应始终存放于 4 °C，切勿将其置于室温下或反复冻融，否则会降低该蛋白促进神经突生长的活性。
在适当的时间解剖斑马鱼视网膜对于获得足够数量并能延伸轴突的视网膜神经节细胞（RGCs）至关重要。斑马鱼RGCs在受精后28小时（hpf）生成，并从32至36 hpf开始延伸轴突离开视网膜。因此，为确保RGCs充分分化，关键是要在28 hpf之后接种RGCs，最好在32至36 hpf之间进行。若在更早的时间点制备培养物，可能无法获得足够数量的RGCs，或所得RGCs在接种后24小时内可能无法延伸轴突。建议在成像时间超过30分钟时更换ZFCM(-)培养基，...

活性氧（ROS）信号通路调控神经系统的发育与功能1。细胞内重要的活性氧来源之一是NADPH氧化酶（NOX），这是一类跨膜蛋白，可生成超氧阴离子和过氧化氢（H2O2）2。NOX酶广泛存在于中枢神经系统（CNS）中，由NOX产生的活性氧参与神经元的发育过程3,4,5,6。研究表明，神经干细胞的维持与分化、神经元极性的建立、神经突起的生长以及突触可塑性均依赖于适当水平的活性氧7,8,9,10,11。另一方面，NOX酶过度产生活性氧则与多种神经退行性疾病相关，包括阿尔茨海默病、多发性硬化症和创伤性脑损伤12,13,14。因此，生理水平的活性氧生成对于维持神经系统健康状态至关重要。
基因编码生物传感器的开发极大地促进了细胞内活性氧（ROS）的检测。基因编码生物传感器的一个重要优势在于其能够显著提高ROS信号的时间和空间分辨率，因为这些传感器可被特异性地靶向至细胞内的不同位置。氧化还原敏感型绿色荧光蛋白（roGFP）即为一类此类ROS生物传感器。其中roGFP2-Orp1变体通过其Orp1结构域特异性地检测H2O2，Orp1是一种来源于酵母的谷胱甘肽过氧化物还原酶家族蛋白15,16。Orp1蛋白的氧化状态会传递至roGFP2，从而改变其构象（图1A）。该探针在约405 nm和480 nm处具有两个激发峰，在515 nm处有一个发射峰。当发生氧化时，激发峰附近的荧光强度发生变化：405 nm激发下的荧光增强，而480 nm激发下的荧光减弱。因此，roGFP2-Orp1是一种比率型生物传感器，H2O2水平通过两种不同波长激发下的荧光强度比值来测定（图1B）。总体而言，roGFP2-Orp1是一种多功能的ROS成像工具，可在活体（in vivo）中高效应用。
<img alt="Orp1-roGFP2 被 H2O2 氧化；荧光强度变化；氧化还原示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62165/62165fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：roGFP2-Orp1 的示意图及激发光谱。（A）在 H2O2 存在下，Orp1 与 roGFP2 之间发生氧化剂转移，导致 roGFP2 构象发生变化。（B）roGFP2-Orp1 的激发光谱在 405 nm 和 480 nm 处呈现两个激发峰，发射峰位于 515 nm。当被 H2O2 氧化后，405 nm 处的激发增强，而 480 nm 处的激发减弱，从而实现对 H2O2 存在的比率型检测。该图已根据 Bilan 和 Belousov（2017）16 以及 Morgan 等人（2011）25 修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62165/62165fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
Danio rerio（斑马鱼）模型系统在应用基因编码的生物传感器方面具有多项优势。胚胎和幼鱼的光学透明性使得无需侵入即可进行体内活体成像。目前正不断开发新的成像工具，以实现更高的分辨率和更深的组织穿透能力17。此外，已有成熟的遗传操作工具（如异位mRNA表达、Tol2转基因技术等）以及基因组编辑技术（如TALENs、CRISPR/Cas9等），有助于快速构建转基因动物模型18。由于斑马鱼胚胎在母体外发育，该系统可更方便地接触和操作胚胎。例如，单细胞期的显微注射和药物处理均可便捷实施。
此处，我们利用斑马鱼瞬时表达H2O2-特异性生物传感器 roGFP2-Orp1，方法是注射体外转录的mRNA。这些胚胎可用于两者 体外 培养神经元的成像 体内 成像（图2）。我们描述了一种从斑马鱼胚胎中分离和培养视网膜神经节细胞（RGCs）的方案，随后评估H2O2培养神经元中的水平。然后，我们介绍一种方法 体内 使用共聚焦显微镜对表达 roGFP2-Orp1 的胚胎和幼虫进行成像。该方法不仅可用于确定生理状态下的 H2O2水平，还能检测不同发育阶段或条件下的潜在变化。总体而言，该系统为检测H2O2 在活细胞和动物中研究H的作用2O2 在发育、健康与疾病中的作用
<img alt="基因编辑示意图 roGFP2-orp1 mRNA；体外/体内斑马鱼成像实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62165/62165fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图2．实验方案示意图。 简言之，收集胚胎后，将 roGFP2-Orp1 mRNA 注射至单细胞期斑马鱼胚胎的卵黄中。发育中的胚胎可用于（A）体外 和（B）体内 成像。（A）选取表达GFP的胚胎，在34小时（hpf）时解剖获取视网膜以收集视网膜神经节细胞（RGC）。分离得到的RGC接种于经PDL/层粘连蛋白包被的盖玻片上，培养基为ZFCM (+) 培养基。接种后6–24小时，当RGC轴突延伸时，可进行生长锥成像。可通过不同处理条件检测H2O2水平的潜在变化。本实验中，我们检测了RGC生长锥内的H2O2水平（红色）。（B）选取表达GFP的胚胎进行体内成像。在目标发育阶段，将胚胎麻醉后置于35 mm玻璃底培养皿中，进行共聚焦成像。本图中，胚胎腹侧朝下放置，以便视网膜成像。示意图展示了斑马鱼视网膜的发育过程。RGC形成节细胞层（GCL），即视网膜最内层。RGC的轴突发育为视神经，穿过中线形成视交叉，随后向背侧生长，在中脑的视顶盖区域形成突触连接。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62165/62165fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>35 毫米培养皿</td><td>Sarstedt</td><td>83-3900</td><td></td></tr><tr><td>35 毫米玻璃底培养皿</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>Sutter/Fisher Scientific</td><td>NC9029378</td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Corning</td><td>2850-22</td><td></td></tr><tr><td>一次性培养皿（100 × 15 毫米）</td><td>VWR</td><td>25384-094</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26140087</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma Aldich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>注射模具</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>TU-1</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Nikon</td><td>TE2000</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>激光扫描共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td>710</td><td></td></tr><tr><td>含酚红的 Leibovitz L-15 培养基</td><td>Gibco/Fisher Scientific</td><td>11-415-064</td><td></td></tr><tr><td>不含酚红的 Leibovitz L-15 培养基</td><td>Gibco/Fisher Scientific</td><td>21-083-027</td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Promega</td><td>V2111</td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMachine SP6 转录试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone/Fisher Scientific</td><td>SH3025601</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>酚红</td><td>Sigma Aldich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>苯硫脲（PTU）</td><td>Sigma Aldich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>气动微量注射泵</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV820</td><td></td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸（PDL）</td><td>Sigma Aldich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>QiaQUICK PCR 纯化试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠 slit2</td><td>R&amp;D Systems</td><td>5444-SL-050</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma Aldich</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Steritop 0.22 &amp;micro;m 滤器</td><td>Millipore</td><td>S2GPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>TE 缓冲液</td><td>Ambion</td><td>AM9860</td><td></td></tr><tr><td>三卡因甲磺酸盐</td><td>Sigma Aldich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>垂直移液器拉制仪</td><td>David Kopf Instruments</td><td>700C</td><td></td></tr></tbody></table>

神经元发育过程中的活性氧活细胞成像

ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

活性氧（ROS）是公认的信号分子，在正常发育、稳态维持和生理功能中具有重要作用。在各类活性氧中，过氧化氢（H₂O₂）因其相对稳定的化学性质和跨膜扩散能力，成为重要的氧化还原信号传导分子。2O2）在细胞信号传导中的作用最为明确。H2O2 在多个物种的发育过程中均牵涉其中。例如，H2O2 在受精后的最初几天内，已在斑马鱼胚胎中检测到。此外，耗竭一种重要的细胞H2O2 来源，NADPH 氧化酶（NOX），会损害神经系统发育，例如视网膜神经节细胞（RGCs）的分化、轴突生长和导向，两者均 在&#160;体内 和 体外. 本文介绍一种用于成像细胞内H2O2 使用基因编码的H在培养的斑马鱼神经元及发育过程中的完整幼体中检测水平2O2特异性生物传感器roGFP2-Orp1。该探针可在斑马鱼幼鱼中瞬时或稳定表达。此外，其比率型信号输出可降低因基因表达差异或体积效应导致的假象检测概率。首先，我们展示如何分离并培养瞬时表达roGFP2-Orp1的斑马鱼胚胎来源的视网膜神经节细胞（RGCs）。随后，利用完整幼鱼监测H2O2 组织水平的检测。该传感器已通过添加 H 进行验证2O2此外，该方法还可用于测量 H2O2 通过构建在特定组织中表达生物传感器的转基因动物，检测特定细胞类型和组织中的信号水平。由于斑马鱼便于进行遗传和发育操作，本文展示的方法可作为研究H功能的实验流程2O2 在脊椎动物神经元及一般胚胎发育过程中。

培养的斑马鱼RGCs在1天内延伸出轴突。一幅代表性的405/480比率图像显示了H2O2-生物传感器如图所示 图 4A细胞体、轴突和生长锥在单个神经元中清晰可见。这些神经元可在不同时间点接受不同处理，以监测 H2O2 变化。我们先前发现，添加 100 µM H2O2 向培养基中添加物质会提高比值，表明该系统能够检测到实时变化（图4)24.
<img alt="过氧化氢对细胞的影响，荧光显微镜图像与柱状图分析，H2O2 水平。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62165/62165fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data...

本方案描述了在培养的斑马鱼神经元和幼体中使用基因编码的过氧化氢（H2O2）生物传感器，以评估H2O2在神经系统发育过程中生理信号传导的作用。该方法可应用于不同类型的细胞，并可通过实验处理进行改良，以研究活性氧（ROS）在一般发育过程中的作用。

活性氧（ROS）是公认的信号分子，在正常发育、稳态维持和生理过程中具有重要作用。其中……

本方案描述了在培养的斑马鱼神经元和幼体中使用过氧化氢生物传感器的方法。该方案将帮助研究人员解析活性氧在正常生理和病理生理过程中的作用。该技术的主要优势在于能够实时检测活体动物和培养细胞中的过氧化氢。该方法可应用于其他动物，例如啮齿类动物模型系统。准备盖玻片时，使用经酸清洗并保存在100%乙醇中的盖玻片。用镊子从储存容器中取出一张盖玻片，并用火焰灼烧以去除残留的乙醇。将盖玻片以倾斜角度置于35毫米培养皿内，完全空气干燥。制备多聚-L-赖氨酸（Poly-D-Lysine，PDL）工作液。将PDL滴加至每张盖玻片中央，避免溶液扩散至边缘，于室温孵育20至30分钟。确保PDL不干燥。用0.5毫升无菌水清洗PDL，并让培养板完全干燥。制备层粘连蛋白工作液。将溶液加至每张盖玻片的中央，注意避免溶液扩散至边缘。将培养板置于37摄氏度的加湿培养箱中孵育2至6小时，避免层粘连蛋白溶液干燥。为了在培养板中进行胚胎解剖以获取视网膜神经节细胞（RGCs），准备并标记四个35毫米的组织培养皿，并各加入4毫升70%乙醇。E2 培养基一。E2 培养基二。以及解剖当天的 E2 培养基三。将培养皿置于冰箱中。当斑马鱼胚胎发育至受精后34小时时，从培养箱中取出涂有层粘连蛋白的培养皿，并用0.5毫升1×PBS将盖玻片洗涤三次。最后一次洗涤后，向每块培养皿中加入四毫升 ZFCM+ 培养基。避免培养皿干燥。取出预先准备并冷藏的培养皿，使其恢复至室温。在四到六个 PCR 管中各加入 15 微升 ZFCM+ 培养基。从培养箱中取出斑马鱼胚胎，将其浸入含有 70% 乙醇的 35 毫米组织培养皿中 5–10 秒以进行消毒。使用移液器将胚胎转移至另一含有无菌 E2 培养基的培养皿中，以洗去多余的乙醇。然后，将胚胎转移至第二个E2培养基培养皿中，用尖头镊子去除其卵膜。最后，将胚胎转移至第三个E2培养基培养皿中进行解剖。使用一对精细镊子，用其中一把镊子将胚胎固定在卵黄前方并调整其位置。用另一把镊子移除卵黄囊后部的尾部。用镊子夹住颈部，取下头部，使脑和眼暴露于E2培养基中。用精细镊子的尖端轻轻滚动眼睛，同时用第二把镊子固定住颅部组织，将眼睛从头部剥离。将四个眼组织转移至一个预先准备好的含有ZFCM+的离心管中，使用p20移液器轻轻上下吹打约45次以解离细胞。将含有解离细胞的ZFCM+转移至盖玻片中央。将培养物置于22摄氏度的 bench top（实验台面）上，放置在聚苯乙烯泡沫架上以吸收震动，进行培养。成像当天，在显微镜下检查细胞，以确认视网膜神经节细胞（RGC）轴突的生长情况。进行活细胞成像时，将盖玻片从培养皿转移至活细胞成像腔室。使用配备微分干涉差（DIC）物镜、OG-590 长通红色滤光片和电子倍增CCD（EMCCD）相机的倒置显微镜。成像前，将ZFCM+培养基更换为ZFCM-。使用10倍物镜定位细胞后，采用油浸60倍物镜并附加1.5倍放大倍率进行成像。首先采集微分干涉相差（DIC）图像。然后使用适当的滤光片组合对 roGFP2-Orp1 进行成像。拍摄第一组图像后，更换为含有不同处理溶液的培养基。为避免 pH 值和渗透压变化，应每隔 30 分钟成像时更换一次培养基。进行活体成像时，将受精后22至24小时的胚胎置于含0.003%苯硫脲但不含亚甲蓝的E3培养基中。每日更换培养基并移除死亡胚胎。在所需时间点，将胚胎用1%琼脂糖固定于35毫米玻璃底培养皿中进行麻醉和装载。可根据成像感兴趣区域，将胚胎以背侧、腹侧或侧向进行定位。琼脂糖凝固后，用不含亚甲蓝但含有0.016%三卡因的E3培养基填充培养皿。设置显微镜以进行成像。使用倒置激光扫描共聚焦显微镜对固定在琼脂糖液滴底部的胚胎进行成像。激发 roGFP2-Orp1，并使用所需的发射滤光片采集相应的图像。通过胚胎的特定区域，以五微米的切片厚度采集 z 层扫描图像。成像后，用精细镊子将胚胎从琼脂糖中取出，置于培养箱中，在含苯硫脲且不含亚甲蓝的培养基中继续培养至所需发育阶段。此处展示的是过氧化氢生物传感器与体外培养的斑马鱼视网膜神经节细胞（RGC）延伸轴突的代表性图像。在单个神经元中，细胞体、轴突及生长锥均清晰可见。将过氧化氢加入培养基后，比值升高，表明该系统能够检测到实时变化。过氧化氢水平的定量结果如图B所示。为了测定整条斑马鱼胚胎中的过氧化氢水平，在单细胞阶段注射了mRNA，从而使所有组织表达roGFP2-Orp1生物传感器。图中显示了斑马鱼幼鱼头部区域在两个不同时间点的图像，重点关注视网膜中的过氧化氢水平。在受精后两天和受精后五天，测定了斑马鱼胚胎中过氧化氢的基础水平。在受精后两天，其比值显著低于受精后五天。此外，每条动物个体在视网膜过氧化氢含量的增加水平上均表现出差异。使用精细镊子去除眼睛，并用移液管轻柔解离眼球，是本实验步骤中最关键的环节。该方案可后续结合药物处理，以研究参与活性氧信号通路的相关因子。

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神经元发育过程中的 ROS 活细胞成像

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利用稀疏腺相关病毒标记遗传靶向的视网膜细胞群体进行神经元分支的延时成像

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