Name: 在活体钙成像小鼠致病性甘里昂神经元对味觉刺激的反应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: 学习在小鼠膝状神经节神经元中进行活体钙成像的技术，使用GCaMP荧光指示剂实时监测单个神经元对味觉刺激的反应。该方法可量化神经调谐特性并检测基因修饰小鼠的外周味觉错接表型。

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作者感谢 S. Humayun 在小鼠饲养方面提供的支持。本研究的部分经费由德克萨斯大学圣安东尼奥分校脑健康联盟研究生与博士后种子基金（B.E.F.）以及美国国立卫生研究院项目 NIH-SC2-GM130411（L.J.M.）提供。

动物实验方案已通过德克萨斯大学圣安东尼奥分校机构动物护理和使用委员会的审查和批准。
1. 术前准备
注意：此处未涉及设备的初始设置，因为设置方法会根据所使用的泵系统、显微镜、相机和成像软件的不同而有所差异。有关设置说明，请参考设备供应商提供的操作指南。作者所用设备的具体信息，请参见材料表。
<ol>
	<li>确保所有载体液（水）和味觉刺激物管路中有液体流过。若管路堵塞，请断开并用水冲洗。若管路弯折，请揉捏直至液体流通。确保液体能够按指令准时开始和停止流动。</li>
	<li>确认所有管路均无堵塞后，运行载体液 10 秒，然后关闭所有阀门。</li>
	<li>确保成像软件已准备就绪，并设置好所有必要参数（例如试验时长、文件名、帧率等）。使用开源图像采集软件 µManager，在标有 Exposure Time 的字段中输入 200 ms，以实现每秒 5 帧的采集速度，在 binning 选项下选择 x2，然后点击标有 Live 的按钮。当视频开始播放时，点击左侧标有 ROI 的按钮。这将生成 512x512 的视野范围。</li>
</ol>
2. 动物的麻醉与固定
注意：以下方案是一种终末性操作流程，适用于体重为 18–35 g 的雄性或雌性小鼠，推荐用于 10 至 12 周龄的动物。该方案可用于表达基因编码钙离子指示剂（GECIs）的转基因动物（例如 Snap25-GCaMP6s），或通过立体定位注射病毒载体表达 GECIs 的动物。在整个操作过程中应佩戴手套、实验服和面部口罩。
<ol>
	<li>抓起动物背部皮肤，进行腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）。在继续操作前，通过夹捏脚趾评估麻醉深度。</li>
	<li>剃除头部顶部及颈部前方手术区域的毛发。</li>
	<li>打开加热垫，将动物俯卧位放置在垫子上。</li>
	<li>在动物眼睛上涂抹眼膏，以防止眼睛干燥。</li>
	<li>在头部中线处做一个约1 cm的切口，暴露颅骨。使用无菌棉签去除结缔组织，使骨面裸露。用棉签确保颅骨表面干燥。</li>
	<li>在颅骨上涂抹兽用粘合剂，确保覆盖所有暴露的颅骨区域。等待胶水完全干燥。</li>
	<li>在培养皿盖内混合牙科水泥，并将其涂抹一层于颅骨上。步骤2.5中使用的棉签末端适合用于此操作。将头固定柱置于牙科水泥之上，并再覆盖一层牙科水泥，将头固定柱牢固夹合在颅骨上。</li>
	<li>静置直至牙科水泥完全干燥变硬。将棉签折成两半，使用其尖端轻戳牙科水泥进行测试。若牙科水泥不再凹陷，即可将动物翻转为仰卧位。</li>
</ol>
3. 气管切开术
<ol>
	<li>对手术区域进行术前消毒。消毒后，从胸骨至下巴沿中线在喉部皮肤上做一个约 2 cm 的切口。</li>
	<li>牵开皮肤和下颌下腺，确保充分暴露二腹肌。</li>
	<li>找到气管旁肌的缝合线位置，用钝性分离法将其分开，并牵开。</li>
	<li>小心地在气管顶部切开一个足够大的开口，以插入聚乙烯导管（内径 0.86 mm，外径 1.27 mm）。切口不得超过气管直径的一半。将导管插入气管，方向朝向肺部。</li>
	<li>重新调整牵开器，释放气管旁肌，并牵开下颌下腺。</li>
	<li>使用少量兽用胶水将气管旁肌在导管上方粘合在一起（见图 1A）。</li>
</ol>
4. 打开鼓室
<ol>
	<li>轻柔地分离所需的二腹肌（左侧或右侧），并分开周围的结缔组织。在肌肉的前端切断，避开血管，并向后牵拉，直至完全脱离鼓泡。</li>
	<li>将头部稍向后倾斜以抬高鼓泡。找到位于二腹肌后端附着点前方的颈动脉分支。在此血管稍后方触摸，可触及鼓泡的凸起骨性结构。</li>
	<li>在此位置观察肌肉组织中的缝线样结构（见图1B）。使用两把精细镊子沿该缝线进行钝性解剖，直至暴露出鼓泡骨面。使用牵开器以保持鼓泡区域视野清晰。</li>
	<li>寻找沿鼓泡从前向后走行的骨缝（见图1C）。使用手术探针在该骨缝中心位置刺穿一小孔，随后使用精细的显微剪在骨面上剪出一个环形开口，注意避免损伤鼓泡前方、后方及深部的血管。</li>
</ol>
5. 暴露膝状神经节
<ol>
	<li>此孔内有一凸起的骨性结构，即耳蜗。耳蜗前方有一块肌肉，为鼓膜张肌（见图1D）。使用弹簧剪剪断鼓膜张肌并将其移除。</li>
	<li>进行足趾夹捏测试。若动物有反应，应追加1/3剂量的氯胺酮/赛拉嗪混合物。</li>
	<li>准备灌注液和吸引管。使用手术探针在耳蜗隆凸处刺一小孔。立即冲洗流出的液体，并用吸引器将其吸除。从此处开始，液体会持续不断流出，需定期处理。</li>
	<li>扩大耳蜗上的孔洞。操作时需注意位于耳蜗后方及外侧边缘环绕的血管。</li>
	<li>将小鼠头部前倾。在原耳蜗下方的颞骨上找到一个孔洞（见图1E）。注意该孔前方的骨嵴，此骨嵴正位于第七脑神经上方。</li>
	<li>将手术探针插入孔中，小心抬起颞骨以暴露第七脑神经（见图1F）。观察第七脑神经暴露的范围；若膝状神经节尚未完全暴露，可将动物头部稍向后倾斜，并尝试从神经前方上抬骨组织。</li>
	<li>若神经节仍未能完全显露，可进一步从下方上抬更多骨组织。操作时务必小心，避免将探针深入骨组织下方，以免损伤膝状神经节。</li>
</ol>
<img alt="手术步骤示意图，标注步骤 A-F，重点展示组织解剖与结构暴露。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62172/62172fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：膝状神经节的手术暴露。（A）小鼠气管切开后颈部腔隙的图像。箭头指向覆盖在本图其余部分所展示手术区域上的二腹肌。（B）先前所示二腹肌下方区域的图像。箭头指示进行钝性解剖的肌层缝隙。（C）鼓泡（Tympanic Bulla）的图像。箭头指示使用手术探针击穿骨质的缝隙位置。（D）打开鼓泡后的手术区域图像。左下箭头指示耳蜗，上方箭头指向鼓膜张肌。方框线标示的区域见于（E）和（F）。（E）耳蜗被击碎并清除内容物后的手术区域图像。白色箭头指示操作步骤5.6中所述手术探针应放置的位置。（F）暴露的膝状神经节图像。箭头指示面神经主干，虚线三角形包围膝状神经节。图A-B，比例尺 = 5 mm。图C-F，比例尺 = 1 mm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62172/62172fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
6. 进行味觉物质检测面板实验
<ol>
	<li>使用吸力吸除膝状节上方的液体。可选择放置吸水尖头以帮助减少渗漏，并辅助显微镜下的操作导航。</li>
	<li>将动物置于显微镜下的吸水垫上。定位膝状神经节：有用的解剖标志包括鼓室留下的孔洞、颞骨上的孔洞以及第七脑神经。在落射荧光显微镜上使用 FITC/GFP 滤光片，检查表达 GCaMP 的单个膝状神经节神经元。使用 10x 物镜（工作距离 10 mm）即可获得足够的分辨率以追踪单个细胞的活动，但也可使用 20x 物镜（工作距离 12 mm）。</li>
	<li>将味觉刺激物输送针头稳固地放置于动物口腔内。在动物口下方放置培养皿以收集流出液体。</li>
	<li>确保相机能够观察到显微镜的视野。同步视频录制开始与味觉刺激物呈现的开始。</li>
	<li>在录制过程中，实时观察是否有细胞反应、视野漂移或液体渗漏。</li>
	<li>若发生渗漏，使用吸力清除液体直至膝状节视野清晰，然后重复操作。若发生漂移，检查头固定装置的所有部件是否已牢固拧紧。若无反应发生，检查液体是否正常流动，并确认显微镜和相机是否聚焦在正确位置，且视野中无任何遮挡物。</li>
	<li>重复上述步骤，直至获得所需数量的视频。轻柔地松开牵开器，然后在对侧重复步骤 3 至 6。</li>
	<li>在所有目标神经节均获得所需视频后，通过颈椎脱位法处死动物。</li>
</ol>

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<li>Lee, D., Kume, M., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+logic+of+sensory+coding+revealed+by+optical+tagging+of+physiologically-defined+neuronal+types%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A molecular logic of sensory coding revealed by optical tagging of physiologically-defined neuronal types.</a> bioRxiv. , 692079(2019).</li>
<li>Moeyaert, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methods+for+marking+active+neuron+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Improved methods for marking active neuron populations.</a> Nature Communication. 9 (1), 4440(2018).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本研究描述了一种逐步手术暴露膝状神经节并利用GCaMP6s直观记录其神经元活动的实验方案。该操作流程与先前报道的方法17非常相似，但存在几处显著差异。首先，使用头部固定装置可在手术过程中方便地调整头部位置。其次，在刺激递送方式上，Wu和Dvoryanchikov的方法通过食管导管输送味觉刺激物17，而本方案则使用加样针将液体直接递送至口腔内。这两种方法均可有效刺激菌状乳头和腭部味蕾，成功诱发膝状神经节神经元的反应。
关于保持清晰成像视野的注意事项：在打开耳蜗后，窝腔内会持续有液体渗出，包括直接覆盖在膝状神经节上的液体。此外，出血也可能遮蔽膝状神经节。尽管少量液体渗出可能尚不足以影响成像，但即使微量血液也可能完全遮挡神经节。这些问题可通过几种方式加以解决。首先，若渗出量较轻，可在每次实验间隙使用连接吸管并配有钝头给液针的吸液装置清除液体。另外，也可通过将吸水尖端小心地置于第七脑神经后方或侧方，将液体从视野中导出。若液体流动特别严重，可能需要在成像过程中对窝腔持续施加负压吸引。通过精确放置吸...

哺乳动物外周味觉系统的一个关键组成部分是膝状神经节。除了部分支配耳廓的躯体感觉神经元外，膝状神经节还包含支配舌前部和腭部的味觉神经元胞体。与其他外周感觉神经元类似，膝状神经节神经元为假单极神经元，其长轴突外周投射至味蕾，中枢投射则到达脑干的孤束核1。这些神经元主要由口腔内味觉刺激物激活味觉受体细胞后释放的ATP所激活2,3。ATP是味觉信号传导中必不可少的神经递质，而味觉神经节神经元表达的P2rx受体对其激活至关重要4。由于味觉受体细胞表达针对特定味觉模式（甜、苦、咸、鲜或酸）的特异性味觉受体，因此有假说认为味觉神经节神经元对味觉刺激的反应也应具有高度选择性5。
整体神经记录研究表明，鼓索神经和大岩浅神经均将代表全部五种味觉模式的味觉信号传导至膝状神经节6,7。然而，这仍留下关于神经元对特定味物质反应特异性的疑问：是否存在味觉模式特异性的神经元、多模态神经元，或两者兼有。单纤维记录可提供更多有关单个纤维活动及其化学敏感性的信息8,9,10，但该方法仅能从小数量纤维中收集数据。类似地，对单个大鼠膝状神经节神经元进行的在体电生理记录可提供有关单个神经元反应的信息11,12,13，但仍会遗漏神经元群体的整体活动，且每只动物获得的神经元记录数量相对较少。为了在不忽略单个神经元活动的前提下分析神经元群体的反应模式，需要采用新的技术手段。
钙成像技术，尤其是使用GCaMP等基因编码的钙指示剂，已实现了这一技术突破14,15,16,17,18。GCaMP以钙离子作为神经元活动的间接指标，当细胞内钙离子浓度升高时，其绿色荧光增强。新型GCaMP分子持续被开发，以提高信噪比、调节结合动力学，并适应特定实验需求19。与整体神经记录相比，GCaMP可实现单个神经元水平的分辨率；与单根纤维或单细胞记录相比，它还能同时测量多个神经元群体的反应。对膝状神经节进行的钙成像已揭示了野生型小鼠中这些神经元的调谐特性16,20，并鉴定了基因操作小鼠中周围味觉神经连接异常的表型18。
将活体钙成像技术应用于膝状神经节的主要困难之一在于，该神经节被包裹在骨性的鼓泡结构内。为了获得对膝状神经节的光学通路，需要进行精细的手术以去除多层骨组织，同时保持神经节的完整性。为此，我们编写了本操作指南，以帮助其他研究人员暴露膝状神经节，并在活体条件下对这些神经元在味觉刺激下由GCaMP介导的荧光反应进行成像。

<table><tbody><tr><td>1 把 #5 不锈钢镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>NC9792102</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 带鲁尔锁的注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-30</td><td></td></tr><tr><td>2 把 #3 不锈钢镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>M3S 11200-10</td><td></td></tr><tr><td>27 号钝头分配针</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1372532</td><td></td></tr><tr><td>3M Vetbond 组织粘合剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0398332</td><td></td></tr><tr><td>4-40 机螺螺母（六角）</td><td>Fastenere</td><td>3SNMS004C</td><td></td></tr><tr><td>4-40 内六角圆柱头螺钉</td><td>Fastenere</td><td>3SSCS04C004</td><td></td></tr><tr><td>吸水尖</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-930-668</td><td></td></tr><tr><td>乙酰磺胺酸钾</td><td>Fisher Scientific</td><td>A149025G</td><td></td></tr><tr><td>人工泪液</td><td>Akorn</td><td>59399-162-35</td><td></td></tr><tr><td>BD 过敏原托盘（带永久固定针头）</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-6D</td><td></td></tr><tr><td>钝性牵开器</td><td>FST</td><td>18200-09</td><td></td></tr><tr><td>面包板</td><td>Thor Labs</td><td>MB8</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>A95-3</td><td></td></tr><tr><td>Cohan-Vannas 弹簧剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-02</td><td></td></tr><tr><td>Contemporary Ortho-Jet 液体材料</td><td>Lang</td><td>1504</td><td></td></tr><tr><td>Contemporary Ortho-Jet 粉末材料</td><td>Lang</td><td>1520</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>Fisher</td><td>19-062-616</td><td></td></tr><tr><td>定制头部固定柱支架</td><td>eMachineShop</td><td></td><td>参见附件文件 202410.ems</td></tr><tr><td>定制金属头部固定柱</td><td>eMachineShop</td><td></td><td>参见附件文件 202406.ems</td></tr><tr><td>直流温度控制器</td><td>FHC</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>数字相机，sCMOS OrcaFlash4 显微镜安装型</td><td>Hamamatsu</td><td>C13440</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>毛发修剪器</td><td>Kent Scientific</td><td>CL7300-Kit</td><td></td></tr><tr><td>IMP</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ6195906</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Ketaved</td><td>NDC 50989-996-06</td><td></td></tr><tr><td>LED 冷光源</td><td>Leica Microsystems</td><td>KL300LED</td><td></td></tr><tr><td>鲁尔锁 1/16&quot; 管路接头</td><td>Fisher</td><td>01-000-116</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>Mini-series 光学支架柱</td><td>Thorlabs</td><td>MS2R</td><td></td></tr><tr><td>MPG</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1723230</td><td></td></tr><tr><td>MXC-2.5 可旋转探针夹具</td><td>Siskiyou</td><td>14030000E</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-947-346</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>加压空气</td><td>Airgas</td><td>AI Z300</td><td></td></tr><tr><td>奎宁</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC163720050</td><td></td></tr><tr><td>自粘标签带</td><td>Fisher Scientific</td><td>159015R</td><td></td></tr><tr><td>硅胶夹管阀管路，1/32&quot; × 1/16&quot; 外径（按英尺计）</td><td>Automate Scientific</td><td>05-14</td><td></td></tr><tr><td>Sola SM 光源引擎</td><td>Lumencor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Snap25-2A-GCaMP6s-D</td><td>JAX</td><td>025111</td><td></td></tr><tr><td>学生用精细剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>外科探针</td><td>Roboz Surgical Store</td><td>RS-6067</td><td></td></tr><tr><td>外科探针支架</td><td>Roboz Surgical Store</td><td>RS-6061</td><td></td></tr><tr><td>缝线</td><td>G&amp;uuml;termann</td><td>02776</td><td></td></tr><tr><td>BD Intramedic 管路</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-046941</td><td></td></tr><tr><td>两级气体调节器</td><td>Airgas</td><td>Y12FM244B580-AG</td><td></td></tr><tr><td>Tygon 聚氯乙烯管路 - 1/16&quot;</td><td>Automate Scientific</td><td>05-11</td><td></td></tr><tr><td>Valvelink8.2 数字/手动控制器</td><td>Automate Scientific</td><td>01-18</td><td></td></tr><tr><td>Valvelink8.2 夹管阀灌流系统</td><td>Automate Scientific</td><td>17-pp-54</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Anased</td><td>NADA# 139-236</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠膝状神经节神经元对味觉刺激反应的活体钙成像

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

在过去的十年中，基因编码钙指示剂（GECIs）的技术进步推动了活体功能成像领域的革命。这些技术以钙信号作为神经元活动的代理指标，能够实时监测大型神经元群体中单个细胞对多种刺激的反应。我们及其他研究者已将这些技术应用于成像活体麻醉小鼠舌部施加味觉刺激后，单个膝状神经节神经元的反应。膝状神经节由支配舌前部和腭部的味觉神经元胞体组成，同时也包含部分支配耳廓的躯体感觉神经元。利用GCaMP对膝状神经节神经元的味觉诱发反应进行成像，不仅提供了有关野生型小鼠中这些神经元调谐特性的关键信息，还为检测基因操作小鼠中外周味觉神经异常连接表型提供了有效手段。本文将演示暴露膝状神经节的手术步骤、GCaMP荧光图像采集、数据分析的初步步骤以及常见问题的解决方法。该技术可结合转基因表达的GCaMP使用，也可通过AAV介导表达GCaMP，并可进一步改造以成像特定遗传标记的神经元亚群（例如通过Cre介导的GCaMP表达）。总体而言，膝状神经节神经元的活体钙成像是一种监测外周味觉神经元活动的强大技术，可为传统的整体神经鼓索神经记录或味觉行为检测提供互补的信息。

根据实验方案，对一只转基因 Snap25-GCaMP6s 动物进行镇静，暴露其膝状神经节，并在舌头上施加味觉刺激物，同时记录视频。本实验的目的是确定每种味觉刺激物可引发哪些细胞产生反应。所使用的味觉刺激物包括：30 mM AceK、5 mM 奎宁、60 mM NaCl、50 mM IMP + 1 mM MPG、50 mM 柠檬酸18 用去离子水溶解后，施加于舌头上持续2秒，期间以13秒的去离子水间隔。
<img alt="膝状神经节成像、刺激反应图、第7对脑神经分析、味觉反应比较" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62172/62172fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：使用活体 GCaMP6s 成像技术记录膝状神经节神经元对味觉刺激物的反应。</st...

本文介绍了如何暴露一只活体、麻醉状态下的实验小鼠的膝状神经节，并利用钙成像技术记录这些神经元群体对不同味觉刺激的反应，从而实现使用多种刺激物进行多次重复实验。该方法可用于深入比较哪些神经元对哪些味觉物质产生反应。

在过去的十年中，基因编码钙指示剂（GECIs）的进展推动了活体功能成像领域的革命。利用……

该技术可用于解答关于膝状神经节中神经元对味觉反应的重要功能问题，膝状神经节是鼓索味觉通路内部的关键部分。该技术可在单次实验过程中实时监测多个单个神经元的反应，因为每只动物记录到的细胞数量显著高于通常通过电生理方法所观察到的数量。将头部固定装置安装好的小鼠仰卧于加热垫上，从胸骨至下颌，在咽喉部皮肤上做一条两厘米长的正中切口。牵拉皮肤和下颌下腺，充分暴露二腹肌。找到气管旁肌层的缝合线后，用钝性解剖法分离该缝合线，并牵拉组织使其打开。仔细在气管顶部切开一个开口，大小以能插入一段聚乙烯导管为宜，注意切口勿超过气管直径的一半，然后将导管沿气管向肺部方向插入。调整拉钩位置，松开气管旁肌并牵开下颌下腺。然后使用少量兽用胶将气管旁肌在导管上方粘合封闭。为打开鼓泡，轻柔地向上分离目标的二腹肌，并将结缔组织拉开。在肌肉的前端做切口，避开血管。并向后牵拉，直至远离鼓泡。将头部略微后仰以抬起鼓泡，找到位于二腹肌后端附着点前方的颈动脉分支。在此血管后方稍远处触诊，寻找鼓泡的凸起结构，并定位肌肉上的缝线处。使用两把精细镊子，在缝线处进行钝性分离，直至暴露出鼓泡骨，并使用牵开器以保持对骨骼的清晰视野。找到鼓泡上自前向后走行的缝线，用外科探针在缝线中心位置于骨头上穿刺一个小孔。然后，使用一把精细的内剪刀在骨头上剪出一个圆形区域，注意避免损伤鼓泡前方、后方及下方的血管。为了暴露膝状神经节，首先定位耳蜗。在耳蜗前方是鼓膜张肌。使用弹簧剪剪除并移除该肌肉。使用手术探针在耳蜗隆凸处刺一个小孔，并立即用吸引器吸出从小孔流出的任何液体。扩大耳蜗上的小孔时，注意不要损伤环绕耳蜗后外侧边缘的血管。将小鼠头部向前倾斜，以定位位于原耳蜗结构下方颞骨上的小孔。注意位于孔前方的隆起，该孔正好处于第七脑神经的上方。将外科探针插入孔中，以便小心抬起颞骨，暴露第七脑神经。如果膝状神经节未完全可见，可轻轻向后倾斜动物头部，并尝试牵起神经前方的骨质部分。如果神经节仍然难以辨认，可从下方再向上剥离部分骨组织，注意不要将探针深入骨下方，以免损伤膝状神经节。进行味觉刺激剂检测时，使用吸引装置吸除膝状神经节表面的液体，并将小鼠置于解剖显微镜下吸水垫上。利用鼓室上残留的孔洞、颞骨上的孔洞以及第七脑神经定位膝状神经节。使用落射荧光显微镜的FITCGFP滤光片，检测表达GCaMP的单个膝状神经节神经元。将一种味觉刺激物管路的分配针牢固地插入动物口中，并在口下方放置培养皿以收集任何液体。在开始呈现味觉刺激物的同时启动视频录制，并通过实时画面观察记录过程中的反应、漂移和渗漏情况。如果发生渗漏，用负压吸除液体，直至膝状体视野清晰，然后重新递送味觉刺激物。如果发生漂移，检查头固定装置的所有部件是否均已牢固拧紧。如果无反应，检查液体是否在流动，并确认显微镜和相机已聚焦于正确位置，且视野中无任何遮挡物。当完成所有预期实验后，轻轻松开牵开器，并在动物

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在活体钙成像小鼠致病性甘里昂神经元对味觉刺激的反应

来源：Shannonhouse, J., 等. 活体背根神经节初级感觉神经元网络中神经元集群的钙成像. 《视觉化实验杂志》...

小鼠完整背根神经节中神经元集群的活体钙成像

来源：Fowler, B. E., et al. 味觉刺激下小鼠膝状神经节神经元反应的活体钙成像。J. Vis. Exp. (2021)...

使用落射荧光显微镜对膝状神经节神经元反应进行活体成像

我们介绍一种从腹侧暴露成年小鼠脑干的实验方案。通过使用梯度折射率透镜与微型显微镜，可利用钙成像技术在活体中检测下橄榄核神经元胞体的活动。...

in vivo 小鼠下橄榄核钙成像

本方案描述了背根神经节（DRG）的手术暴露过程，随后在对同侧后爪施加多种刺激的同时，利用Pirt-GCaMP3小鼠对神经元集合进行GCaMP3（基因编码的Ca2+指示剂；绿色荧光蛋白-钙调蛋白-M13蛋白3）Ca2+成像。...

体内完整背根神经节初级感觉神经元网络中神经元集群的钙成像

本方案概述了 体内 利用钙成像技术测量腰段6背根神经节（L6...

体内背根神经节神经元对躯体和内脏刺激反应的钙成像

基因编码的钙离子指示剂（GECI）可实现对感觉神经元信号传导的稳健且群体水平的分析。本文中，我们开发了一种新方法，可实现 体内 大鼠三叉神经节神经元活动的GECI可视化...

体内大鼠三叉神经节感觉神经元的钙成像

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本方案描述了 体内 完整三叉神经节（TG）神经元的GCaMP钙成像。该描述包括TG暴露手术， 体内 共聚焦显微镜成像三叉神经节神经元、在三叉神经节神经元显微成像期间施加体感刺激，以及分析 体内 GCaMP...

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我们展示了一种 体内 电穿孔转染方案，用于在多种出生后年龄段的小鼠中转染单个或少量成簇的视网膜神经节细胞（RGCs）及其他视网膜细胞类型。该方法实现了对出生后RGCs的标记与遗传操作 体内...

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我们介绍一种已建立的技术，用于测量和分析活体黑腹果蝇（Drosophila...

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学习在小鼠膝状神经节神经元中进行活体钙成像的技术，使用GCaMP荧光指示剂实时监测单个神经元对味觉刺激的反应。该方法可量化神经调谐特性并检测基因修饰小鼠的外周味觉错接表型。

小鼠膝状神经节神经元对味觉刺激反应的活体钙成像

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