Name: 端粒上的化学分化诱导蛋白凝结物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 了解化学诱导二聚化系统如何在端粒上形成蛋白质凝聚物，实现可逆且时间可控的活细胞成像。该方法适用于研究染色质相关凝聚物的动态与功能。

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本工作由美国国立卫生研究院（H.Z. 获资助号 1K22CA23763201，D.M.C. 获资助号 GM118510）和H.Z. 获查尔斯·E·考夫曼基金会资助。作者感谢 Jason Tones 对手稿的校对。

1. 瞬时细胞系的制备
<ol>
	<li>将U2OS受体细胞培养于6孔板中经多聚-D-赖氨酸包被的22 × 22 mm玻璃盖玻片（用于活细胞成像）或12 mm直径圆形盖玻片（用于免疫荧光或FISH）上，使用生长培养基（含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液的DMEM），待细胞融合度达到60–70%。</li>
	<li>转染前，将生长培养基更换为1 mL转染培养基（不含青霉素-链霉素溶液的生长培养基）。</li>
	<li>每孔转染体系中，向150 μL低血清培养基中加入4 μL转染试剂，涡旋10秒，室温孵育5分钟。</li>
	<li>每孔中，将Halo载体质粒（Halo-GFP-TRF1或Halo-TRF1）与eDHFR载体质粒（mCherry-eDHFR-SIM或mCherry-eDHFR-SIM突变体）以1:1质量比（0.5 μg Halo载体质粒与0.5 μg eDHFR载体质粒）逐滴加入150 μL低血清培养基中，用移液器轻轻混匀。 
	注意：标签分子量相对较小（Halo 33 kD，eDHFR 28 kD，mCherry 30 kD，eGFP 27 kD），未观察到对相分离有影响。然而，建议使用突变体（如本实验中使用的SIM突变体），以确保相变行为对突变敏感，而非受标签影响。SIM来源于﻿PIASx28,30。SIM序列为AAAGTCGATGTAATTGACTTAACGATCGAATCTAGCAGCGATGAAGAAGAAGATCCACCGGCTAAACGT。SIM突变体通过将SIM氨基酸VIDL突变为VADA28获得，其序列为AAAGTCGATGTAGCCGACGCCACGATCGAATCTAGCAGCGATGAAGAAGAAGATCCACCGGCTAAACGT。我们已将质粒提交至addgene：#164644 3XHalo-GFP-TRF1；#164646 mCherry-eDHFR-SIM；#164649 mCherry-eDHFR-SIM突变体。</li>
	<li>将150 μL转染试剂-低血清培养基混合液逐滴加入含DNA的150 μL低血清培养基中，用移液器轻轻混匀，室温孵育5分钟。</li>
	<li>将300 μL转染试剂-DNA混合液逐滴加入细胞中，然后将细胞放回培养箱继续培养。</li>
	<li>转染后24–48小时，进行活细胞成像、免疫荧光（IF）或荧光原位杂交（FISH）。</li>
</ol>
2. 端粒上的二聚化
<ol>
	<li>将二聚化分子溶解于二甲基亚砜中，配制成10&#8201;mM溶液，并分装于塑料微量离心管中，于−80 °C长期保存。 
	注意：此处使用的是在三甲氧苄啶（TMP）与Halo配体之间含有光敏连接子6-硝基愈创木基氧羰基（NVOC）的二聚化分子TMP-NVOC-Halo（TNH），而非直接将TMP与Halo连接的二聚化分子（TMP-Halo，TH）31。这是因为TNH进入细胞所需时间较短（约5分钟），而TH则需约20分钟。使用TH同样可以获得本文所示结果。使用TNH时，应避免其暴露于光线下，以防NVOC发生光解。操作TNH时应在暗室中使用微弱红光灯照明，将二聚化分子储存于琥珀色塑料管中，并用铝箔包裹含有TNH的容器或处理过的细胞。使用微分干涉差（DIC）显微镜观察TNH是安全的。</li>
	<li>从−80 °C取出10 mM的二聚化分子 aliquot，用成像培养基稀释至10 μM的储存浓度，并于−20 °C保存。</li>
	<li>使用前，将10 μM的二聚化分子储存液用生长培养基（用于固定后成像）或成像培养基稀释至终工作浓度100&#8201;nM。对于活细胞成像，直接在显微镜载物台上以100 nM终浓度处理细胞；若用于免疫荧光（IF）或荧光原位杂交（FISH），则需在培养箱中孵育4–5小时。 
	注意：所用二聚化分子的浓度会影响二聚化效率，从而影响相分离过程。实现最大二聚化效率所需的二聚化分子浓度取决于细胞类型及锚定蛋白的表达水平，因此需根据不同实验条件进行优化。一种简单方法是：将表达锚定蛋白和mCherry-eDHFR（未融合相分离蛋白，或融合非相分离突变体）的细胞与不同浓度的二聚化分子共孵育，测定锚定位点处mCherry荧光强度达到最高时对应的二聚化分子浓度。更系统的方法是：将仅表达锚定蛋白的细胞与不同浓度的二聚化分子孵育，随后加入Halo结合染料，通过检测Halo染料荧光强度开始趋于平台期的浓度，判断此时所有Halo融合的锚定蛋白已被二聚化分子占据，无剩余结合位点可供染料结合32。</li>
	<li>为逆转二聚化过程，先将细胞与二聚化分子孵育2–5小时（可伴随活细胞成像，也可不进行），或直至达到预期的液滴大小，然后向培养基中加入终浓度为100 μM的游离TMP（用成像培养基稀释后添加）。</li>
</ol>
3. 免疫荧光（IF）
<ol>
	<li>在6孔板中，将105个细胞接种于经多聚-D-赖氨酸包被的直径为12 mm的圆形盖玻片上。随后转染两种质粒（Halo-GFP-TRF1 与 mCherry-eDHFR-SIM 或 mCherry-eDHFR-SIM 突变体），转染后等待24–48小时，再进行免疫荧光实验。 
	注意：转染后等待超过一天可获得更高的表达水平。 &#160;</li>
	<li>用生长培养基稀释二聚化分子，使其终浓度为100 nM，将稀释后的二聚化分子加入细胞中，并在37 °C孵育4–5小时。 
	注意：加入二聚化分子后可迅速诱导相分离（< 30分钟）。延长孵育时间有助于液滴粗化并增大尺寸。可通过活细胞成像追踪液滴生长过程，以确定液滴达到目标状态所需的时间。</li>
	<li>在室温下，用含4%甲醛和0.1% Triton X-100的PBS溶液固定细胞10分钟，以实现细胞通透。用PBS洗涤细胞3次。 
	注意：此步骤后可暂停实验，细胞可在4 °C保存长达一周。 
	警告：甲醛吸入或吞咽有害，对眼睛、呼吸系统和皮肤具有刺激性，可能具有致癌风险。操作时需佩戴个人防护装备，仅在通风橱中使用。使用后应放入废液容器，不得倒入水槽。</li>
	<li>用50 μL TBS-Tx洗涤盖玻片两次，再用50 μL抗体稀释缓冲液（AbDil）洗涤一次。TBS-Tx由TBS、0.1% Triton X-100和0.05%叠氮化钠配制而成。AbDil由TBS-Tx、2% BSA和0.05%叠氮化钠配制而成。</li>
	<li>在湿润盒中，每张盖玻片加入50 μL一抗溶液（抗PML抗体，AbDil中1:50稀释；抗SUMO1抗体，AbDil中1:200稀释；抗SUMO2/3抗体，AbDil中1:200稀释），于4 °C孵育过夜。也可使用抗mCherry抗体（AbDil中1:200稀释）以辅助FISH实验中mCherry信号的检测。 
	注意：FISH会淬灭mCherry的荧光信号，导致在FISH实验中难以区分转染与未转染mCherry质粒的细胞。建议使用抗mCherry抗体。或者，可构建稳定表达含eDHFR蛋白的细胞系。</li>
	<li>用AbDil洗涤盖玻片3次，以去除未结合的一抗。</li>
	<li>在避光条件下，室温下用二抗溶液孵育细胞1小时[针对PML和SUMO使用Alexa Fluor 647标记的抗小鼠IgG (H+L)二抗，针对mCherry使用Alexa Fluor 555标记的抗兔IgG (H+L)二抗，均以AbDil中1:1000稀释]。</li>
	<li>用TBS-Tx洗涤盖玻片3次。</li>
	<li>标记载玻片，将DAPI稀释于封片介质中，使DAPI终浓度为1 μg/mL。取2 μL稀释后的DAPI滴加至载玻片上。将盖玻片翻转，使其细胞面朝下覆盖在DAPI液滴上，用吸水纸吸去盖玻片边缘多余液体。</li>
	<li>用指甲油封片，待其干燥后，从盖玻片顶部用水轻轻冲洗。保存于冷冻保存盒中，以备成像使用。</li>
</ol>
4. 荧光原位杂交（FISH）
<ol>
	<li>在6孔板中，将105个细胞接种于经多聚-D-赖氨酸包被的直径为12 mm的圆形盖玻片上。转染&#160;细胞，导入Halo-TRF1和mCherry-eDHFR-SIM或mCherry-eDHFR-SIM突变体质粒，转染后24–48小时进行FISH实验。二聚化步骤同3.2节所述。 
	注：此处TRF1未与GFP融合，因此绿色荧光通道可用于端粒DNA探针。</li>
	<li>用4%多聚甲醛在室温下固定细胞10分钟，用PBS洗涤4次。如需进行免疫荧光-荧光原位杂交（IF-FISH），从此处开始进行免疫荧光（IF）实验；在完成IF步骤中二次抗体的洗涤（3.8节）后，再次用4%多聚甲醛在室温下固定细胞10分钟，并用PBS洗涤3次。</li>
	<li>将盖玻片依次在70%、80%、90%乙醇中脱水，每种浓度各2分钟。</li>
	<li>在杂交液（含70%去离子甲酰胺、10 mM Tris（pH 7.4）、0.5%封闭试剂）中加入488标记的telC PNA探针（稀释比例1:2000），取5 μL加至盖玻片，于75 °C孵育5分钟，随后在湿盒中室温过夜孵育。</li>
	<li>用洗涤缓冲液（70%甲酰胺、10 mM Tris）在室温下洗涤盖玻片3次，每次2分钟，然后用含1 μg/mL DAPI的封片剂封片，用于成像。 
	注：本FISH实验方案引自已发表文献33’34。</li>
</ol>
5. 活细胞成像
<ol>
	<li>当细胞准备就绪进行成像时，将盖玻片置于磁性腔室中，并在带加热台的环境腔室内用1 mL不含酚红的成像培养基维持细胞。</li>
	<li>设置显微镜和环境控制装置。图像使用转盘共聚焦显微镜采集，配备100倍、1.4 NA物镜、压电Z驱动器、电子倍增电荷耦合器件&#160;(EMCCD)相机，以及由成像软件控制的、带有455、488、561、594和647 nm激光器的激光合束模块。所有激光器在光纤末端测得的输出功率均为20 mW。</li>
	<li>寻找端粒上具有明亮GFP信号、核质中mCherry信号呈弥散分布的细胞。找到约20个细胞，记录每个细胞的x、y、z位置信息，并设置延时成像参数：Z轴范围共8 μm，步距0.5 μm，时间间隔5分钟，持续2–4小时，同时采集GFP和mCherry通道图像。使用594 nm激光功率的30%和488 nm激光功率的50%，曝光时间为200 ms，相机增益为300。 
	注意：激光器单元的输出功率为20 mW。明亮的GFP焦点表明锚定结构较大，更易于成核形成凝聚体。应选择mCherry信号强度范围较广的细胞，因为相分离依赖于细胞内SIM的浓度。mCherry信号过弱或过强的细胞可能无法发生相分离。为避免光漂白，请勿使用过高的激光功率或过长的曝光时间。</li>
	<li>开始成像，采集一轮图像作为二聚化前的基准。暂停成像，向载物台上的成像腔室中加入0.5 mL含有15 μL 10 μM二聚化分子的成像培养基，使二聚化分子的终浓度为100 nM。恢复成像。</li>
	<li>当需要逆转二聚化时，暂停成像，向载物台上的成像腔室中加入0.5 mL含有2 μL 100 mM储备液TMP的成像培养基，使TMP终浓度达到100 μM。继续对细胞成像1–2小时。</li>
</ol>
6. 固定成像
<ol>
	<li>显微镜设置与活细胞成像相同，无需载物台加热。使用 488 nm 激光进行端粒 FISH 成像，561 nm 激光用于 mCherry 免疫荧光，647 nm 激光用于 PML 或 SUMO 免疫荧光。 
	注意：若未使用 mCherry 抗体，则可直接成像 mCherry 蛋白，但由于 FISH 过程中的淬灭作用，信号可能较弱。&#160; 仍应使用 561 nm 激光而非 594 nm 激光成像 mCherry，以避免 Cy5 信号渗漏至 mCherry 通道。</li>
	<li>寻找约 30–50 个具有红色信号（mCherry 或 mCherry 免疫荧光）的细胞，以筛选转染成功的细胞。</li>
	<li>采用 0.3 µm 的 Z 轴步进间距，共采集 8 µm 厚度的 Z 栈图像以获取更多信号。激光功率设置为 647 nm 的 80%、561 nm 的 80% 和 488 nm 的 70%，曝光时间为 600 ms，相机增益为 300。</li>
</ol>
7. 处理延时图像
<ol>
	<li>定义端粒的二值化图像 
	选择一个包含所有时间点和z-stack信息的细胞，仅选择GFP通道，并通过设定阈值创建二值化图层。调整阈值的下限和上限，使用“平滑”、“去噪”和“填充孔洞”等功能，观察该阈值在所有时间点上对目标对象的识别效果。</li>
	<li>减去背景信号 
	选择所有通道，在细胞外的背景区域绘制矩形兴趣区域（ROI）。将此ROI定义为背景，然后减去背景强度。</li>
	<li>将端粒二值化图像与端粒荧光强度关联 
	选择端粒二值化图像，并将其与GFP通道关联，以计算二值化对象内的GFP平均强度，作为端粒强度。</li>
	<li>随时间计算端粒数量和强度 
	指定需导出的信息，例如时间、对象ID、平均强度、总强度，并导出数据。使用绘图软件读取导出的表格，生成端粒数量和端粒强度随时间变化的图表（先对每个端粒体积内的强度进行汇总，再对单个细胞内所有端粒的强度取平均）。</li>
</ol>
8. 处理固定细胞图像
<ol>
	<li>定义APBs的二值图像 
	通过观察561 nm通道中的信号，选择转染的细胞进行分析。按照7.1节中的步骤，分别在GFP通道（端粒DNA FISH）和Cy5通道（PML或SUMO免疫荧光）中设定阈值，生成端粒和PML小体或SUMO的二值图像。将GFP和Cy5的二值图层合并，并创建一个新图层，包含同时具有GFP和Cy5信号的颗粒，以表示PML小体在端粒上的共定位，即APBs。</li>
	<li>计算APB/SUMO的数量和强度 
	按照7.2节进行图像背景扣除。按照7.3节将APB/SUMO二值图层与Cy5通道关联。计算APB/SUMO的数量和强度。按照7.4节导出并绘制数据。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案展示了利用化学二聚化系统在端粒上形成和解聚凝聚物的过程。通过活细胞成像监测相分离动力学以及液滴融合诱导的端粒聚集现象。采用DNA FISH和蛋白质免疫荧光（IF）确定凝聚物的定位及其组分。&#160;
本实验方案中有两个关键步骤。第一步是确定相分离蛋白和二聚化诱导剂（dimerizer）的浓度。在基因组位点诱导局部相分离的成功与否，取决于相分离蛋白在局部的浓度是否超过其发生相分离的临界浓度（图1B）。相分离蛋白的全局浓度必须足够高，以确保有足够数量的蛋白可被富集到局部区域；但又不能过高，以免引发全细胞范围内的相分离或使其易于被诱导发生全局相分离。&#160; 锚定DNA的长度（即锚定蛋白所结合的修饰染色质区域的大小）以及Halo融合锚定蛋白的浓度，共同决定了在最大二聚化效率下成核中心的大小。锚定区域越大，越有利于相分离凝聚体的成核。二聚化效率受二聚化诱导剂与锚定蛋白相对量的影响：二聚化诱导剂过少时，无法占据所有可用的锚定蛋白；而过多时，则会导致eDHFR与过量的游离二聚化诱导剂发生非功能性结合，而非与锚定蛋白上的二聚...

许多蛋白质和核酸经历液-液相分离（LLPS），并自组装形成生物分子凝聚体，以在细胞内组织生物化学反应1,2染色质结合蛋白的液-液相分离导致与特定基因组位点相关联的凝聚体形成，并参与多种局部染色质功能3例如，HP1蛋白的液-液相分离（LLPS）是异染色质结构域形成的基础，有助于基因组的组织4,5转录因子的液-液相分离形成转录中心以调控转录6, &#65279; 新生mRNA与多性梳蛋白的液-液相分离形成组蛋白基因座小体以调控组蛋白mRNA的转录和加工7. &#160;然而，尽管已发现大量与染色质相关的凝聚体实例，其形成、调控及功能的潜在机制仍远未明确。特别是，并非所有与染色质相关的凝聚体都通过液-液相分离（LLPS）形成，仍需在活细胞中对凝聚体的形成进行严谨评估。8,9例如， &#65279; 小鼠中的HP1蛋白在活细胞中仅表现出较弱的液滴形成能力 &#65279;异染色质焦点表现为坍缩的聚合物球状体10因此，开发可在活细胞染色质上诱导从头形成凝聚体的工具具有重要意义，尤其是那些能够结合活细胞成像与生化分析，用于监测凝聚体形成动力学、所形成凝聚体的理化性质以及凝聚体形成所致细胞效应的工具。
本方案报告了一种通过化学二聚化系统在染色质上诱导蛋白质凝聚体的方法11 (图1A）。该二聚化分子由两个相连的蛋白结合配体组成：甲氧苄啶（TMP）和Halo配体，可使与相应受体融合的蛋白发生二聚化： 大肠杆菌 二氢叶酸还原酶（eDHFR）和一种细菌烷基脱卤酶酶（Halo酶）12Halo配体与Halo酶之间的相互作用是共价的，从而能够 &#160;Halo酶通过与染色质结合蛋白融合，作为锚定装置，用于将与eDHFR融合的相分离蛋白招募至染色质。在初始招募后，相分离蛋白的局部浓度升高，超过相分离所需的临界浓度，从而在锚定位点成核并形成凝聚体（图1B通过将荧光蛋白（如 mCherry 和 eGFP）分别与 eDHFR 和 Halo 融合，可利用荧光显微镜实时观察凝聚体的成核与生长过程。由于 eDHFR 与 TMP 之间的相互作用为非共价结合，可通过加入过量游离 TMP 与二聚化分子竞争 eDHFR 的结合位点，从而将相分离蛋白从锚定位点释放，导致染色质相关凝聚体解聚。
我们利用该工具在端粒酶阴性的癌细胞中诱导端粒上新生早幼粒细胞白血病（PML）核体的形成，这些细胞通过端粒替代性延长机制维持端粒长度&#160;端粒维持的替代性延长（ALT）途径13,14. &#160;PML核小体是无膜结构的细胞核区室，参与多种细胞核过程15,16 并在ALT端粒上特异性定位，形成与ALT端粒相关的PML小体（APBs）17,18. 端粒在APBs内聚集，推测可为替代性长度延长（ALT）途径中同源定向的端粒DNA合成提供修复模板19确实，在APB中已检测到端粒DNA的合成，且APB在富集DNA修复因子至端粒的过程中发挥着关键作用20,21然而，APB组装以及APB内端粒聚集的机制尚不清楚。由于ALT细胞中的端粒蛋白被小泛素样修饰物（SUMO）特异性修饰22许多APB组分含有SUMO化位点 22,23,24,25 和/或 SUMO 相互作用基序（SIMs）26,27 以及SUMO-SIM相互作用驱动相分离28我们假设端粒上的SUMO化修饰会导致含SUMO/SIM的蛋白质在端粒富集，这些蛋白质之间的SUMO-SIM相互作用进而引发相分离。 &#160;PML蛋白具有三个SUMO化位点和一个SIM结构域，可被招募至发生SUMO化的端粒，形成APB，而液态APB的融合会导致端粒聚集。为验证这一假设，我们采用化学诱导二聚系统，通过将SIM招募至端粒来模拟由SUMO化诱导的APB形成过程图2A)11GFP 与 Halo酶 融合用于可视化，并与端粒结合蛋白 TRF1 融合以将二聚化分子锚定至端粒。SIM 与 eDHFR 和 mCherry 融合。通过活细胞成像追踪凝聚体形成的动力学及液滴融合诱导的端粒聚集。 &#160;通过添加过量游离的TMP以竞争eDHFR结合，可逆转相分离。采用免疫荧光（IF）和荧光原位杂交（FISH）检测凝聚体的组成及其与端粒的关联。招募SIM可使SUMO在端粒上富集，且所诱导形成的凝聚体含有PML，因此为APBs。而招募无法与SUMO相互作用的SIM突变体，则不能在端粒上富集SUMO，也不能诱导相分离，表明APB凝聚的基本驱动力是SUMO-SIM相互作用。与此观察一致，将polySUMO-polySIM聚合物与TRF2结合因子RAP1融合，同样可诱导APB的形成。29与聚SUMO-聚SIM融合系统（只要表达足够量的蛋白即可发生相分离）相比，本文介绍的化学诱导二聚化方法能够按需诱导相分离，从而提供更优的时间分辨率，以监测相分离及端粒聚集过程的动力学。此外，该化学二聚化系统允许招募其他蛋白质，以评估其诱导相分离和端粒聚集的能力。例如，一种无序蛋白被招募至端粒后，虽不诱导APB形成，但仍可形成液滴并促使端粒聚集，表明端粒聚集独立于APB的化学组成，仅依赖于APB的液态特性11.&#160;

<table><tbody><tr><td>不含钙、镁和碳酸氢钠的HBSS中的0.25%胰蛋白酶和0.1%EDTA</td><td>Corning</td><td>MT25053CI</td><td></td></tr><tr><td>16%（w/v）甲醛，无甲醇</td><td>Thermo Scientific</td><td>28906</td><td>用1×PBS配制1%溶液</td></tr><tr><td>6孔培养板</td><td>VWR</td><td>10861-554</td><td></td></tr><tr><td>铝箔</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-101</td><td></td></tr><tr><td>抗mCherry抗体</td><td>Abcam</td><td>Ab183628</td><td></td></tr><tr><td>抗PML抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc966</td><td></td></tr><tr><td>抗SUMO1抗体</td><td>Abcam</td><td>Ab32058</td><td></td></tr><tr><td>抗SUMO2/3抗体</td><td>Cytoskeleton</td><td>Asm23</td><td></td></tr><tr><td>封闭剂</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9706100</td><td></td></tr><tr><td>BTX Tube micro 1.5ML&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>89511-258</td><td></td></tr><tr><td>圆形盖玻片</td><td>Thermo Scientific</td><td>3350</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MQS31000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>含L-谷氨酰胺、4.5 g/L葡萄糖和丙酮酸钠的DMEM培养基</td><td>Corning</td><td>MT10017CV</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD相机</td><td>iXon Life&amp;nbsp;</td><td>897</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>4355221</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清，经认证，符合美国农业部批准地区标准</td><td>Gibco</td><td>A4766801</td><td></td></tr><tr><td>去离子甲酰胺</td><td>MilliporeSigma</td><td>46-101-00ML</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG（H+L）重组二抗，Alexa Fluor 647标记</td><td>Invitrogen</td><td>A28181</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG（H+L）重组二抗，Alexa Fluor 647标记</td><td>Invitrogen</td><td>A32733</td><td></td></tr><tr><td>高精度直锥超细尖镊子/持针器</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-122</td><td></td></tr><tr><td>激光合并模块&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>NIIMHF47180</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz L-15培养基</td><td>Gibco</td><td>21083027</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000转染试剂</td><td>Invitrogen</td><td>11668027</td><td></td></tr><tr><td>图形绘制软件，MATLAB</td><td>The MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片盒</td><td>Fisher Scientific</td><td>34487</td><td></td></tr><tr><td>指甲油</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-949-071</td><td></td></tr><tr><td>成像软件，NIS-Elements&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM减血清培养基</td><td>Gibco</td><td>51985091</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm封口膜</td><td>Bemis</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10×，pH 7.4</td><td>Fisher Scientific</td><td>70-011-044</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液，100×</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Piezo Z-驱动器&amp;nbsp;</td><td>Physik Instrumente (PI)</td><td>91985</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>VWR</td><td>10017</td><td></td></tr><tr><td>带磨砂夹角的普通载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-037-246</td><td></td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP922I-500</td><td></td></tr><tr><td>转盘式共聚焦系统</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>方形盖玻片</td><td>Thermo Scientific</td><td>3305</td><td></td></tr><tr><td>TBS 10×溶液</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2471500</td><td></td></tr><tr><td>TelC-Alexa488</td><td>PNA Bio</td><td>F1004</td><td></td></tr><tr><td>TMP</td><td>由Chenoweth实验室合成</td><td></td><td>可应要求提供</td></tr><tr><td>TNH</td><td>由Chenoweth实验室合成</td><td></td><td>可应要求提供</td></tr><tr><td>Tris溶液</td><td>Fisher Scientific</td><td>92-901-00ML</td><td></td></tr><tr><td>10% Triton X-100溶液</td><td>MilliporeSigma</td><td>64-846-350ML</td><td>用1×PBS配制0.5%溶液</td></tr><tr><td>U2Os细胞系</td><td>来自E.V. Makayev实验室（新加坡南洋理工大学）</td><td>HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD抗荧光淬灭封片剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>NC9524612</td><td></td></tr></tbody></table>

化学诱导二聚化介导的端粒蛋白凝聚体

Chemical Dimerization-Induced Protein Condensates on Telomeres

染色质相关缩合物参与多种细胞核过程，但其潜在机制尚不明确。本实验方案描述了一种化学诱导的蛋白质二聚化系统，用于在端粒上形成缩合物。该化学二聚剂由两个相连的配体组成，每个配体可分别结合一种蛋白质：Halo配体结合Halo酶，三甲氧苄二氢叶酸还原酶（trimethoprim, TMP）结合大肠杆菌二氢叶酸还原酶（E. coli dihydrofolate reductase, eDHFR）。将Halo酶与端粒蛋白融合，可通过共价的Halo配体-酶结合将二聚剂锚定在端粒上。TMP与eDHFR的结合可招募与eDHFR融合的相分离蛋白至端粒，从而诱导缩合物的形成。由于TMP与eDHFR的相互作用为非共价结合，因此可通过加入过量游离TMP竞争eDHFR的结合位点，从而逆转缩合过程。本文展示了在端粒上诱导早幼粒细胞白血病（promyelocytic leukemia, PML）核体形成，并测定缩合物的生长、溶解、定位及组成的示例。通过将Halo酶融合至直接结合局部染色质的蛋白，或融合至由向导RNA靶向特定基因组位点的dCas9蛋白，该方法可轻松适用于在其他基因组位点诱导缩合物的形成。该方法兼具单细胞活体成像所需的时间分辨率，同时可在细胞群体中维持相分离状态以进行生物化学分析，因此适用于研究染色质相关缩合物的形成及其功能。

通过端粒DNA FISH与SUMO蛋白免疫荧光染色鉴定的SUMO在端粒定位的代表性图像如图2所示。与SIM突变体招募细胞相比，SIM招募细胞在端粒上富集了更多的SUMO1和SUMO2/3。这表明，由SIM二聚化诱导的端粒上SUMO富集依赖于SUMO-SIM相互作用。
TRF1 与 SIM 二聚化后的一个代表性延时录像如视频 1所示。图 3A展示了四个时间点的图像快照。SIM 成功被招募至端粒，且 SIM 与 TRF1 的焦点均变得更大更亮，符合液滴形成与生长的预期特征（图 1B）。此外，观察到 TRF1 焦点发生融合（图 3B），导致端粒聚集，表现为端粒数量减少（图 3E）以及随时间推移端粒信号强度增加（图 3D...

本方案介绍了一种通过化学诱导的蛋白质二聚化系统，在染色质上形成凝聚体的方法。&#160; 该方法利用化学二聚剂在端粒上诱导早幼粒细胞白血病（PML）核体的形成。通过活细胞成像、免疫荧光（IF）和荧光原位杂交（FISH）技术，对液滴的生长、溶解、定位及组成进行监测。

染色质相关缩合物参与多种细胞核过程，但其潜在机制尚不明确。本方案描述了一种……

本方案描述了一种通过化学二聚化系统在端粒上诱导蛋白质凝聚体的方法。该方法可轻松改造用于在其他基因组位点诱导凝聚体，适用于研究与染色质相关的凝聚体的形成及其功能。该技术可提供活细胞成像所需的时间分辨率，并能在细胞群体中维持相分离状态，适用于生化分析。首先，将二聚化剂溶解于DMSO中，配制成10毫摩尔浓度，并分装于塑料微量离心管中，于-80摄氏度长期保存。取10毫摩尔二聚化剂的等分试样，用成像培养基稀释至10微摩尔的储备浓度，并于-20摄氏度保存。使用前，将二聚化剂用生长培养基或成像培养基进一步稀释至100纳摩尔的工作浓度。在六孔板中，将 10 的 5 次方个细胞接种于经多聚-D-赖氨酸包被的直径为 12 毫米的圆形盖玻片上。随后用 Halo-GFP-TRF1 和 mCherry-eDHFR-SIM 或 mCherry-eDFR-SIM 突变体质粒转染细胞，并继续培养 24 至 48 小时，然后进行免疫荧光实验。向细胞中加入稀释后的 100 纳摩尔二聚化诱导剂，在 37 摄氏度下孵育 4 至 5 小时。孵育结束后，在含有4%多聚甲醛和0.1%Triton X-100的PBS溶液中室温固定细胞10分钟，以通透细胞膜。随后用PBS洗涤细胞三次。再用50 µL TBS-Tx洗涤盖玻片两次，然后用50 µL抗体稀释缓冲液洗涤一次。将每张盖玻片与50微升一抗（抗PML、抗SUMO-1或抗SUMO-2和3抗体）在湿盒中4摄氏度孵育过夜。用抗体稀释缓冲液洗涤盖玻片三次，以去除未结合的一抗，然后在室温避光条件下与二抗孵育一小时。染色完成后，用TBS-Tx缓冲液洗涤盖玻片三次。通过加入两微升浓度为每毫升一微克的DAPI对载玻片进行标记，然后将盖玻片翻转并放置在DAPI液滴上。用移液器从盖玻片边缘吸去多余液体。用指甲油封片，待其干燥后，用水冲洗盖玻片顶部。将载玻片置于冰箱中直至成像。在六孔板中，将10的5次方个细胞接种于经多聚-D-赖氨酸包被的12毫米圆形盖玻片上，并转染Halo-TRF1和mCherry-eDHFR-SIM或mCherry-eDHFR-SIM突变体质粒。室温下用4%甲醛固定细胞10分钟，随后用PBS洗涤四次。进行IF-FISH时，先用一抗和二抗对细胞进行染色，然后在室温下用4%多聚甲醛重固定10分钟，随后用PBS洗涤四次，再将盖玻片经梯度乙醇脱水。将盖玻片与488标记的端粒C-PNA探针在5 µL杂交溶液中混合，于75 °C孵育5分钟，然后在室温下的湿盒中过夜孵育。孵育结束后，在室温下用洗涤缓冲液洗涤盖玻片三次，每次2分钟，最后将盖玻片置于含1 µg/mL DAPI的封片剂中封片，用于成像。进行活体成像时，将盖玻片置于加热载物台上、环境培养箱内的磁性腔室中，并在不含酚红的一毫升成像培养基中维持细胞。按照文本手稿中的描述设置显微镜和环境控制装置。寻找端粒处具有明亮 GFP 信号、细胞质中具有弥散性 mCherry 信号的细胞。找到约20个细胞，记录每个细胞的XYZ位置信息，并设置延时成像参数。在Z轴方向使用0.5微米间距，总共采集8微米，GFP和mCherry通道的时间间隔均为5分钟，持续成像2至4小时。激光功率强度使用594纳米的30%和488纳米的50%，曝光时间设为200毫秒，相机增益设为300。开始成像并采集一个时间点作为二聚化前状态。然后暂停成像，向成像腔室中加入0.5毫升含15微升10微摩尔二聚化诱导剂的成像培养基，注意不要触碰载物台，随后恢复成像。当需要逆转二聚化时，暂停成像并向成像腔室中加入0.5毫升含2微升100毫摩尔储备液TMP的成像培养基。继续对细胞成像一到两个小时。对于固定样品成像，使用与活细胞成像相同的显微镜设置，但无需载物台加热。寻找约30至50个具有红色信号的细胞，以筛选转染成功的细胞。以0.3微米的步进间距在Z轴方向共采集8微米的图像。使用647纳米激光功率的80%、561纳米激光功率的80%以及488纳米激光功率的70%，曝光时间为600毫秒，相机增益为300。通过端粒DNA荧光原位杂交（FISH）和SUMO蛋白免疫荧光染色确定SUMO在端粒的定位。与SIM突变体招募的细胞相比，具有SIM招募功能的细胞中SUMO-1、SUMO-2和SUMO-3在端粒区域富集，表明SIM二聚化诱导的端粒区SUMO富集依赖于SUMO与SIM之间的相互作用。此处展示的是 TRF-1 与 SIM 在二聚化后的时间延时电影。SIM 成功被招募至端粒，且 SIM 与 TRF-1 的焦点均变得更大更亮，符合液滴形成与生长的预期特征。此外，观察到 TRF-1 焦点的融合现象，导致端粒发生聚集，表现为随时间推移端粒数量减少而端粒信号强度增加。相比之下，SIM突变体在二聚化后被招募至端粒，但未诱导任何液滴形成或端粒聚集，表明相分离和端粒聚集是由SUMO-SIM相互作用驱动的。在加入过量游离TMP后，观察到相分离和端粒聚集现象发生逆转。随着时间推移，端粒数量增加，端粒强度降低。此处展示的是通过端粒DNA FISH和PML蛋白免疫荧光（IF）鉴定出的APB的代表性图像。招募SIM的细胞比招募SIM突变体的细胞具有更多的APB，表明二聚化诱导的凝聚物确实是APB。在执行本方案时，切勿将对光敏感的二聚化分子暴露于光照下。在暗室中操作，使用发出红光的灯，并在孵育期间用铝箔包裹细胞。按照此步骤，可利用邻近标记技术生成诱导凝聚物中组分的全面列表。活体成像可用于追踪凝聚物中组分的动态变化。这些方法有助于确定调控凝聚体组成控制的作用。

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科研

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Biology

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本视频介绍了一种利用单分子成像技术，在特定基因位点上可视化融合蛋白凝聚体在DNA分子上组装的方法。这些凝聚体的形成源于LCD-LCD和LCD-DBD相互作用，从而能够招募RNA聚合酶II并增强基因转录。...

单分子成像可视化融合蛋白在DNA幕上凝聚体的组装

构建具有理想亲和力和特异性的、可被任意给定小分子配体化学诱导的蛋白质二聚化系统，在生物学检测与调控方面具有广泛的应用前景。本文中，我们描述了一种高效且可推广的从头设计化学诱导二聚化系统的方法，该方法通过逐步筛选噬菌体展示的组合型单域抗体文库来实现。...

通过逐步噬菌体筛选组合式单域抗体文库创建高特异性化学诱导蛋白二聚化系统

本文介绍了利用单分子成像技术——DNA幕帘法，研究EWS-FLI1凝聚物在DNA上组装的生物物理机制。...

单分子成像观察EWS-FLI1凝聚体在DNA上的组装

本方案重点介绍了一种改进的方法，用于检测和定量由拓扑异构酶抑制剂和甲醛诱导的DNA-蛋白质交联（DPC）及其翻译后修饰（PTM），包括泛素化、SUMO化和ADP-核糖基化，从而能够研究DPC及其翻译后修饰的形成与修复过程。...

DNA-蛋白质交联及其翻译后修饰的定量检测

许多内在无序蛋白已被证实参与形成高度动态的生物分子凝聚体，这种行为对多种细胞过程具有重要意义。本文介绍了一种基于单分子成像的方法，用于定量分析蛋白质在活细胞生物分子凝聚体中相互作用的动力学过程。...

生物分子凝聚体中蛋白质相互作用动力学的单分子测量

我们介绍一种从两亲性DNA纳米星的组成DNA寡核苷酸出发，制备合成生物分子凝聚体的实验方案。该凝聚体可由单一纳米星组分或两种组分生成，并可进行修饰以维持 体外 从嵌入式DNA模板转录RNA...

两亲性DNA纳米结构构建的合成凝聚体与类细胞结构

本方案展示了如何利用单分子磁镊技术研究端粒DNA结合蛋白（端粒重复序列结合因子1 [TRF1] 和...

使用单分子磁镊分析端粒蛋白- DNA 相互作用

本文介绍了一种在聚丙烯酰胺凝胶中使用考马斯亮蓝（CBB）G-250对蛋白质进行染色的简短方案，该方法无需使用有机溶剂或乙酸，而传统CBB染色步骤中通常需要这些试剂。...

使用不含有机溶剂和乙酸的考马斯亮蓝G-250对凝胶中的蛋白质进行染色

使用 GELFREE 8100 分离系统进行基于分子量的液相回收分离

了解化学诱导二聚化系统如何在端粒上形成蛋白质凝聚物，实现可逆且时间可控的活细胞成像。该方法适用于研究染色质相关凝聚物的动态与功能。

化学诱导二聚化介导的端粒蛋白凝聚体

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