可视化和量化基于内分泌酶的站点特定DNA损伤
August 21st, 2021
本文介绍了免疫染色和染色质免疫沉淀的基本步骤。这些协议通常用于研究DNA损伤相关的细胞过程，并可视化和量化与DNA修复有关的蛋白质的招募。
该方法视频介绍了免疫染色和染色质免疫沉淀协议的关键步骤，这些协议经常用于研究DNA损伤相关的细胞过程，并可视化和量化与DNA修复有关的蛋白质的招募。这项技术为研究人员提供了强大的工具，以识别与受损基因组细胞落结合的新型蛋白质，以及它们在DNA修复过程中微调调节所需的转化后修饰。由于这些技术可用于研究不同的细胞过程，因此如果使用激光微辐射或基于细胞核的DNA破坏性诱导系统，它们具有潜在的相关性。
最近，我们开发了几种强大的工具来诱导特定部位的DNA损伤，这些损伤可用于扩大我们对DNA修复的理解。这些用具采用生化和遗传方法，对于揭示与DNA损伤现场DNA修复复合物的招募和组装相关的细胞事件至关重要。此外，这些技术允许使用固定细胞和活细胞在单细胞分辨率下研究这些过程。
在DMEM培养基的单层中保持U2OS细胞，辅以10%胎儿小腿血清、2毫摩尔谷氨酰胺和1%抗生素抗菌溶液。在潮湿的 5% 二氧化碳环境中以 37 度生长细胞，直到达到 80% 的汇合，每两到三天更新一次介质。吸气介质，用PBS清洗细胞。
分离细胞与特林-EDTA解决方案。当细胞分离时，通过在细胞中添加培养介质来阻止试金素的活动，从而产生细胞悬浮。使用细胞计数室计算细胞。
每口井每口井的板材为2万个细胞，每口井的无菌12毫米圆形盖滑。在潮湿的 5% 二氧化碳环境中，在 37 度下孵育细胞 24 小时，以便附着在盖子上。用每毫升10毫微克的新卡齐诺他汀治疗细胞，或使用适当的方法通过内核基系统诱导双链断裂。
在潮湿的5%二氧化碳环境中，在37度下孵育细胞1至8小时，以跟踪DNA修复的动力学。在 25 度下用 4% 甲醛 PBS 溶液修复细胞 20 分钟。取出固定溶液，用 PBS 清洗细胞三次，每次五分钟。
取出 PBS 并添加溶解在 PBS 中的 0.2%特里顿 X。将样品孵化20分钟。用 PBS 清洗细胞三次。
用在 BSA-PBST 中稀释的 5% BSA 阻止非特定结合，并孵育样品至少 20 分钟。在 1%BSA-PBST 溶液中加入稀释的适量原发抗体。将每个盖子倒置到稀释抗体的副膜或 10 微升滴片上。
将样品在湿度室中孵化一个半小时，在四度。将盖子滑回侧面，放入 24 井板中，然后用 PBS 洗三次。加入在 1%BSA-PBST 中稀释的适当量的二级抗体。
将每个盖子倒置到抛物膜上，在稀释抗体的 10 微升滴片上。将样品在湿度室中孵化一小时。将盖子滑回设置在 24 井板中，然后用 PBS 洗三次。
在取出最后一个 PBS 洗涤液之前，用钳子和针头的一半轻轻取出盖片，然后用安装介质液滴将盖滑倒置到玻璃滑梯上。色度素免疫沉淀是一种广泛使用的技术，用于识别蛋白质与DNA的结合模式。为了揭示DSB周围渴望修复蛋白的占用情况，一种特定的抗体用于免疫沉淀染色素制备中感兴趣的蛋白质及其所受约束的DNA区域。
此外，ChIP 通常用于绘制 DSB 在给定基因组位点使用特定的转化后修改的地图。每毫升大约2000万个细胞应该培养成每片15厘米的盘子。去除培养介质，用冰冷的PBS清洗细胞两次。
使用 1% 甲醛-PBS 溶液修复细胞。将板放在轨道摇床上，轻轻搅拌20分钟。停止用甘油固定，达到125毫摩尔的最终浓度，并在25度的轻柔搅拌器上孵育5分钟。
将盘子放在冰上，用冰冷的PBS洗两次。将细胞刮在冰冷的PBS中，并将其转移到15毫升圆锥管中。以5000转时离心，在4度下5分钟。
小心地吸气超高分子，将颗粒重新吸回两毫升细胞裂解缓冲器，并在冰上孵育10分钟。离心机在下午5000转，在4度下5分钟。小心地丢弃超高分子，在500到1500微升核裂解缓冲器中重新吸管颗粒，并在冰上孵育30至60分钟。
将解冻剂转移到适合声波的聚苯乙烯锥形管中。将裂解物剪切成平均300到1000个碱基对的片段大小。为预清洁和免疫沉淀步骤准备发电机珠。
用 RIPA 缓冲器在 4 度下两次洗珠 10 分钟。在 RIPA 缓冲器的相同体积中重新使用 Dynabead，就像您在第 3.1 步从原始库存解决方案中取出的一样。通过4度旋转，预先清除每个样品的25至30微克染色质，并配以4个微升Dynabead，持续1至2小时。
用磁铁沉淀发电机珠，并将超强的引物转移到新的埃彭多夫管中。在每个染色质样本中加入适量的抗体，并在四度下在夜间旋转。第二天，在每个样品中加入40微升洗过的Dynabead，并在四度下在一夜之间孵育它们。
用300微升低盐缓冲器洗一次，10分钟，旋转4度。用300微升高盐缓冲器洗一次，10分钟，旋转4度。用300微升氯化锂缓冲器洗一次，10分钟，旋转4度。
用 300 微升 TE 洗两次，10 分钟，第一次洗 4 度旋转，第二次洗 25 度。在珠子中加入200微升的洗脱缓冲器，在热摇床中65度孵育，持续摇晃15分钟。在200微升的回流缓冲器中，将超高分子转移到一个新的管子和回流珠子上。
每毫升蛋白酶-K加入500微克，SDS含量增加0.5%，在50度下孵育样品两小时。执行氯仿萃取，并将上部起位转移到新的埃彭多夫管。加入两卷半绝对乙醇和0.1卷三摩尔醋酸钠pH 5.2。
在零下80度孵育至少20分钟。取出乙醇，将颗粒晾干。将颗粒重新悬回 50 微升 TE 中。为了研究它们在DNA上的特殊分布，应应用染色质免疫沉淀。
ChIP-qPCR获得的典型实验结果在图中显示，它显示了伽马组石AX的时效浓缩，作为对I-PpoI诱发的DNA损伤的反应。在图像的左侧，在断裂侧显示及时检测到的伽马岩AX信号，而在右侧，伽玛平岩AX分布呈现在未引起断裂的控制基因区域。虽然DNA修复是一个相对较新的研究领域，但我们的知识在生化和微观方法的帮助下正在迅速增加。
尽管如此，生化技术，如西式斑点、免疫沉淀和质谱学需要大量的细胞。研究修复过程表示所需的细胞群的快照。超分辨率显微镜等高分辨率技术彻底改变了显微场，使DNA损伤引起的细胞过程在核细胞水平上可视化，并确保蛋白质共定位的准确映射。
另一方面，色素免疫沉淀是一个强大的工具，特别是通过结合测序方法，可视化其全基因组结合模式所需的DNA修复相关蛋白质和双链断裂在染色素或异色素区域。
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概述
本文描述了免疫染色和染色质免疫沉淀的重要协议，这些对于研究与DNA损伤相关的细胞过程至关重要。这些方法使研究人员能够可视化和定量分析参与DNA修复机制的蛋白质的招募。
关键研究组成部分
研究领域
- DNA损伤反应
- 细胞修复机制
- 蛋白质招募可视化
背景
- 研究DNA损伤和修复对于理解细胞健康至关重要。
- 免疫染色和染色质免疫沉淀等技术对于检查蛋白质与受损DNA的相互作用至关重要。
- 最近的进展允许在诱导DNA损伤方面具有更高的特异性。
使用的方法
- 用于蛋白质可视化的免疫染色
- 用于识别蛋白质-DNA相互作用的染色质免疫沉淀
- 使用U2OS等细胞系进行实验程序
主要结果
- 在DNA损伤位点成功可视化修复蛋白
- 定量评估蛋白质招募动态
- 识别与受损DNA结合的蛋白质的翻译后修饰
结论
- 该研究证明了免疫染色和染色质免疫沉淀在阐明DNA修复机制方面的有效性。
- 这些技术对于推进分子生物学和细胞对DNA损伤反应的研究至关重要。
常见问题
Executive Industry Relevance
Precise visualization and quantification of site-specific DNA damage responses are critical for de-risking early discovery programs targeting genome maintenance pathways. The integration of endonuclease-based DNA damage induction with immunostaining and chromatin immunoprecipitation (ChIP) enables robust target validation and mechanistic insight into DNA repair factor recruitment. These capabilities support predictive confidence at key inflection points in oncology and genome stability portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of DNA repair pathway activation and protein recruitment at defined genomic loci.
- Supports functional target validation by quantifying repair factor occupancy and post-translational modifications.
- Facilitates mechanistic de-risking for candidate targets involved in genome integrity.
- Provides evidence for pathway engagement and biological relevance in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Establishes validated cellular systems for downstream screening of DNA repair modulators.
- Delivers reproducible, quantitative readouts of protein localization and chromatin binding.
- Enables assay standardization for high-content imaging and ChIP-based platforms.
- Supports reliable evaluation of compound effects on DNA repair dynamics.
Translational & Preclinical Research
- Aligns DNA repair factor dynamics with translational biomarker strategies when supported by genomic occupancy data.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of DNA repair targets.
- Informs risk-adjusted advancement decisions for genome maintenance therapeutics.
- Offers predictive de-risking for candidate interventions in DNA damage response pathways.
Pipeline & Workflow Integration
This methodology bridges early discovery, target validation, and preclinical research by enabling quantitative analysis of DNA repair protein dynamics at site-specific lesions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing repair complex assembly at induced DNA breaks.
- Screening: Provides assay-ready systems with reproducible, quantitative outputs for compound evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative measurements of protein occupancy and post-translational modifications at defined genomic regions.
- Translational Research: Connects mechanistic findings to biomarker development and preclinical validation when supported by occupancy data.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for interrogating diverse DNA repair targets and pathways.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in DNA repair target validation.
- Operational Value: Standardizes workflows for reproducibility and scalability across research teams.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of genome maintenance programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, immunostaining, and ChIP protocols.
- Demands access to high-resolution microscopy and quantitative PCR or sequencing infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for reproducible data generation and interpretation.
- Adaptation may be needed for different cell types or DNA damage induction systems.
- Sample throughput and cell number requirements may limit scalability for some applications.
