基于荧光的测量磷酸酯/磷酸二醇 4-磷酸盐膜之间的交换
March 14th, 2021
在这里，我们描述协议使用荧光脂质传感器和脂质体，以确定蛋白质提取物和运输磷酸二醇或磷二醇4磷酸盐 体外。
这种方法使用荧光来确定蛋白质是否在合成膜之间转移到生物学上重要的脂质，从而有助于这些脂质在真核细胞内的分布。这项技术使蛋白质能够提取和运输天然脂质，它需要荧光细胞和脂质体，很容易制造。这种方法可以使用和修改，通过器官和膜之间一些基本脂质分布背后的蛋白质来深入了解细胞生物学。
视觉演示对于解释如何通过荧光对脂质转移进行实时测量至关重要。因此，演示程序也将是莫德马格德琳，我的实验室工程师。首先准备新鲜的过滤和脱气的 HEPES 醋酸钾缓冲器，辅以一毫摩尔氯化镁，形成 HKM 缓冲器。
然后，准备仅由 PC 制成的脂质体，或额外掺杂两个摩尔百分比 PS 或 PI （4）P。现在，将烧瓶放在旋转蒸发器上，在真空下干燥脂质。在一口井中，将含有两摩尔%PS的脂质体与脂质传感器NBD-C2乳酸混合，最终浓度为250纳米摩尔和100微升。
用同样数量的脂质体和NBD-C2乳酸与三种微摩尔脂质转移蛋白或LTP混合，填充第二口井。用250纳米摩尔NBD-C2乳糖与纯80微摩尔PC脂质体混合，用纯80微摩尔PC脂质体填充第四口井。重复这些步骤，准备另外三个系列的四口井。
然后将多井板放入荧光读卡器中。每口井记录的NBD频谱为505至650纳米，在25摄氏度的490纳米激发时带宽为5纳米。对于每个系列减去仅从其他光谱中记录的脂质体记录的光谱。
对于PI（4）P提取检测准备脂质体掺杂了2摩尔%磷酸二甲基二醇-4磷酸盐，并使用NBD-PH FAPP探头进行测量。执行控制实验并确定提取百分比。完成挤压脂质体后，用这些挤出的脂质体填充管子。
准备新鲜脱气和过滤的HKM缓冲器，并在室温下保持含有挤出脂质体的管子。将含有脂质体的管子与标有磷酸二醇胺的铝箔包裹起来，并存放在不透明的盒子中，以防止任何照片漂白。将温度设置在 25 至 37 摄氏度之间，并将激发单色计调整为 460 纳米，带宽短 1 到 3 纳米，将辐射到 530 纳米，带宽大于 10 纳米。
将采集时间设置为 25 分钟，时间分辨率最多为 1 秒。在石英中，夸维特稀释了30微升的LA脂质体悬浮液和NBD-C2乳酸库存溶液和预温HKM缓冲器，以准备一个570微升样品，其中含有200微摩尔总脂质和250纳米摩尔或NBD-C2乳酸盐。添加一个小的磁搅拌棒，并将 cuvette 放置在荧计支架中。
一旦样品被热平衡触发测量。一分钟后，在样品中加入 30 微升 LB 脂质体悬浮剂。三分钟后将LTP注入样品中，使LTP的最终浓度为200纳米摩尔，然后获得剩余21分钟的信号。
进行并行实验，使 NBD 信号正常化。将 30 微升 LA 平衡脂质体悬浮液与 250 纳米摩尔 NBD-C2 乳酸混合在 HKM 缓冲器中，最终体积为 570 微升。一分钟后，注射30微升LB平衡脂质体悬浮液。
转换使用感兴趣的 LTP 测量的动能曲线，以确定随着时间的推移从 LA 传输到 LB 脂质体的 PS 量。然后使曲线的每个数据点正常化。使用与 PS 传输检测相同的地板发射器设置和条件执行 PI （4）P 实验。
在 cuvette 中，将 30 微升磅脂体悬架和 NBD-PH FAPP 探针与预加热的 HKM 缓冲器混合，获得 570 微升的最终体积。一旦达到样品的热平衡，就开始测量。一分钟后，注射30微升LA脂质体悬浮剂。
三分钟后，注入感兴趣的LTP并记录信号。执行第二个实验以使 NBD 信号正常化。将 30 微升磅平衡脂质体悬浮液与 250 纳米摩尔 NBD-PH FAPP 和 570 微升 HKM 缓冲器混合。
一分钟后，注射30微升LA平衡脂质体悬浮液。转换动能曲线，确定随着时间的推移从 LB 传输到 LA 脂质体的 PI （4）P 量，然后使每个数据点正常化。量化 LTP 的有效程度。
对传输动力学的第一个数据点进行线性回归以获得坡度。将斜值除以反应混合物中的 LTP 浓度，以确定每个时间单位每个蛋白质转移的脂质分子数量。通过 SDS 页面分析验证了从珠子中高效回收 C2 乳糖。
标有NBD的C2乳酸的紫外线可见吸光谱证实，所有C2乳酸分子都标有NBD组。NBD-C2乳清的纯度及其荧光是由SDS页面分析确定的。当只有含有PS或PI（4）P的脂质体用于孵育时，NBD-C2乳酸或NBD-PH FAPP的荧光是最大的，表明传感器是膜结合的。
当Osh6p也出现时，出现了低荧光，表明这种蛋白质从脂质体中有效地提取了PS或PI（4）P。使用 Osh6p 作为 LTP 的 PS 传输检测结果如图所示。计算了从 LA 脂质体到 LB 脂质体、掺杂或未掺杂磷脂质醇-4-磷酸盐的 PS 传输的平均动能曲线。
平均初始PS传输速率是由三个不同的实验确定的。同样，使用 Osh6p 作为 LTP 的 PI （4）P 传输检测结果也显示在此处。以及信号正常化后获得的平均动能曲线。
平均转移率测量与 LA 脂质体被掺杂或不掺杂与 PS。执行此协议时，使用新的缓冲器并准备相同的日期。尽量减少荧光脂质体和蛋白质的光展示，使用纯化良好的NBD标签蛋白质，并把它们留在冰上。可以通过使用基因编码荧光脂质传感器测量蛋白酶细胞内细胞之间的PS和PI（4）P转移来确认。
该技术为更好地了解 PS 和 PI （4） 分布在细胞内铺平了道路，它们的活动经过多个 LTPS 的特异性。
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概述
本文描述了一种使用荧光来评估蛋白质转运生物学重要脂质的方法。重点关注磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇4-磷酸，它们对细胞功能至关重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 生物化学
背景
- 了解脂质转运对细胞生物学至关重要。
- 磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇4-磷酸在细胞信号传导中发挥关键作用。
- 荧光脂质传感器为研究脂质动力学提供了一种视觉方法。
- 使用脂质体的协议促进了脂质转运机制的研究。
研究目的
- 开发研究蛋白质脂质转运的协议。
- 利用荧光传感器实时测量脂质转运。
- 增强对真核细胞中脂质分布的理解。
使用的方法
- 为实验准备HEPES钾醋酸盐缓冲液。
- 使用荧光脂质传感器来追踪脂质运动。
- 应用脂质体模拟细胞环境。
- 实时荧光测量以评估脂质转运。
主要结果
- 证明了蛋白质提取和运输脂质的过程。
- 提供了一种理解脂质动力学的视觉方法。
- 显示了在脂质转运研究中使用脂质体的可行性。
- 强调了细胞生物学中实时测量的重要性。
结论
- 该方法为脂质转运机制提供了洞见。
- 荧光传感器对于研究脂质动力学是有效的。
- 协议可以适应各种细胞生物学应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Fluorescence-based quantification of phosphatidylserine (PS) and phosphatidylinositol 4-phosphate (PI(4)P) exchange by lipid transfer proteins (LTPs) addresses a critical gap in mechanistic de-risking for membrane lipid trafficking. This capability enables precise target validation and functional interrogation of lipid transporters, supporting predictive confidence in early discovery and translational research. The approach is directly relevant for portfolio decisions where membrane lipid dynamics influence disease-relevant pathways and therapeutic hypotheses.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of LTP-mediated lipid extraction and transfer, clarifying transporter function.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying PS and PI(4)P movement between defined membranes.
- Facilitates functional target validation for proteins implicated in lipid homeostasis and signaling.
- Provides quantitative data to inform predictive confidence and triage of transporter targets.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible fluorescence assays for LTP activity using artificial membranes.
- Generates quantitative kinetic outputs suitable for comparative compound or protein evaluation.
- Enables assay scalability and platform reuse for diverse LTPs and lipid species.
- Prepares validated systems for downstream screening of modulators or inhibitors.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems where membrane lipid distribution impacts cellular signaling.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of lipid transport mechanisms.
- Provides risk-adjusted data for advancement decisions in transporter-targeted programs.
- Enables mechanistic studies that inform translational biomarker strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This fluorescence-based protocol integrates from early discovery through lead identification, supporting both hypothesis testing and quantitative screening of lipid transfer activity.
- Discovery Biology: Quantifies LTP-mediated lipid exchange, clarifying transporter roles in membrane biology.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts for assay development and compound profiling.
- Analytics: Delivers kinetic measurements and normalized transfer rates for robust data comparison.
- Translational Research: Connects mechanistic lipid transfer to disease-relevant cellular processes when supported by model systems.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, adaptable platform for studying diverse LTPs and lipid interactions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in lipid transporter research.
- Operational Value: Standardizes fluorescence-based assays for reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and capital allocation by providing quantitative transporter activity data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of transporter targets and lipid pathway programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence assay design and lipid biochemistry.
- Needs access to fluorescence microplate readers and standard fluorometers for kinetic measurements.
- Demands rigorous cross-team standardization of liposome preparation and sensor labeling.
- Adaptation may be needed for different LTPs or lipid species based on probe compatibility.
- Careful control of buffer freshness, light exposure, and sample purity is essential for reliable results.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:59
Measurement of PS or PI(4)P Extraction
2:44
Real-time Measurement of PS Transport
4:54
Real-time Measurement of PI(4)P Transport
6:23
Results: Membrane-Exchange of Phosphatidylserine/ Phosphatidylinositol 4-Phosphate Using Fluorescent Sensors
7:58
Conclusion
