Name: 基于荧光的测量磷酸酯/磷酸二醇 4-磷酸盐膜之间的交换 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 学习使用荧光标记传感器和人工脂质体测量Osh6p蛋白介导的磷脂酰丝氨酸与磷脂酰肌醇4-磷酸在合成膜之间的提取与转运动力学。该方法为研究真核细胞脂质分布机制提供了可重复的定量分析手段。

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我们感谢 A. Cuttriss 博士对本文手稿的仔细校对。本工作由法国国家研究署资助项目 ExCHANGE（ANR-16-CE13-0006）以及法国国家科学研究中心（CNRS）资助。

作者声明不存在利益冲突。

这些检测的结果直接依赖于荧光脂质传感器的信号。因此，将这些探针以1:1的比例与NBD标记，并确保不含游离NBD荧光染料污染的纯化步骤，是本方案中的关键环节。同时，必须检测待研究的脂质转移蛋白（LTP）是否正确折叠且未发生聚集。在提取检测中所使用的LTP量必须等于或高于可及的磷脂酰丝氨酸（PS）或磷脂酰肌醇-4-磷酸（PI(4)P）分子的数量，以准确评估该LTP是否能有效提取这些脂质。事实上，NBD-C2Lact和NBD-PHFAPP分别与PS和PI(4)P结合，其结合曲线符合经典的饱和结合模式。鉴于它们各自对PS和PI(4)P的亲和力，即使脂质体中含有微量残留的这些配体，这些探针仍会大量结合在脂质体上。这可能导致错误结论，即某种LTP无法有效提取这些脂质。本方案采用标准且可商业获得的磷脂酰胆碱（PC）、PS和PI(4)P亚型，分别为18:1/18:1-PC、16:0/18:1-PS和16:0/16:0-PI(4)P。&#160;如先前报道所述，使用具有其他酰基链组成的脂质种类进行实验可能会得到不同的结果12,<sup cla...

真核细胞不同膜之间及膜内脂质的精确分布1,2&#160;具有深远的生物学意义。解析LTPs的功能机制是细胞生物学中的一个重要课题3,4,5,6，以及 体外 这些方法在解决这一问题方面具有重要价值7,8,9,10,11。在此，一种 体外, 提出了一种基于荧光的策略，该策略在证实多种ORP/Osh蛋白介导细胞膜间磷脂酰丝氨酸（PS）与磷脂酰肌醇-4-磷酸（PI(4)P）交换的过程中发挥了关键作用12 从而构成一类新的LTPs。PS是一种阴离子型甘油磷脂，在真核细胞膜脂质总量中占2-10%13,14,16它在内质网和质膜之间呈梯度分布，分别占甘油磷脂的5-7%和最高达30%17,18,19此外，磷脂酰丝氨酸（PS）主要富集于质膜的胞质侧小叶。PS 在质膜中的这种富集及其分布的不对称性，对细胞信号传导过程至关重要。19由于PS分子带负电荷，质膜的胞质侧脂质单层比其他细胞器的胞质侧脂质单层具有更高的负电性。1,2,19,20。这能够实现招募， 通过 静电作用力，如豆蔻酰化富含丙氨酸的C-激酶底物（MARCKS）等信号蛋白的静电作用力21，肉瘤病毒癌基因（Src）22，Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因（K-Ras）23以及Ras相关C3肉毒杆菌毒素底物1（Rac1）24 含有带正电荷的氨基酸序列和脂质尾部。
PS 也能以立体选择性方式被常规蛋白激酶 C 识别 通过 一个C2结构域25然而，磷脂酰丝氨酸（PS）在内质网中合成26，表明其必须被转运至质膜后才能发挥功能。此前尚不清楚这一过程是如何实现的19 直到发现酵母中的 Osh6p 和 Osh7p 能将磷脂酰丝氨酸（PS）从内质网（ER）转移至质膜（PM）27这些脂质转移蛋白（LTPs）属于真核生物中进化上保守的一个蛋白家族，该家族的原型成员是OSBP，其包含一系列整合了OSBP相关结构域（ORD）的蛋白质（人类中的ORPs，酵母中的Osh蛋白），该结构域具有容纳脂质分子的结合口袋。Osh6p和Osh7p仅由一个ORD构成，其结构特征特异性地适应于结合磷脂酰丝氨酸（PS）并在膜之间转移该脂质。然而，这些蛋白如何将PS从内质网（ER）定向转移至质膜（PM）尚不清楚。Osh6p和Osh7p能够捕获PI(4)P作为替代性脂质配体12在酵母中，PI(4)P 在高尔基体和质膜中由磷脂酰肌醇（PI）合成&#160;分别由PI 4-激酶Pik1p和Stt4p催化生成。相比之下，内质网（ER）膜中不存在PI(4)P，因为该脂质被Sac1p磷酸酶水解为PI。因此，在ER/高尔基体和ER/质膜（PM）界面均存在PI(4)P浓度梯度。Osh6p和Osh7p将磷脂酰丝氨酸（PS）从内质网转移至质膜 通过 利用这两种膜之间存在的 PI(4)P 梯度进行 PS/PI(4)P 交换循环12.
在一个循环中，Osh6p 从内质网提取磷脂酰丝氨酸（PS），在质膜处将 PS 与磷脂酰肌醇-4-磷酸（PI(4)P）交换，并将 PI(4)P 转运回内质网以提取另一个 PS 分子。Osh6p/Osh7p 与 Ist2p 相互作用28, 少数能够连接内质网膜与质膜并使其紧密靠近，从而在酵母中形成内质网-质膜接触位点的蛋白质之一29,30,31此外，Osh6p 与带负电荷膜的结合在其提取出一种脂质配体后会立即减弱，这是由于构象变化改变了其静电特性所致。32这有助于缩短 Osh6p 在膜上的停留时间，从而维持其脂质转移活性的效率。结合与 Ist2p 的结合，该机制可使 Osh6p/7p 在内质网与质膜接触界面快速而准确地执行脂质交换。在人类细胞中，ORP5 和 ORP8 蛋白在内质网-质膜接触位点执行磷脂酰丝氨酸/磷脂酰肌醇-4-磷酸（PS/PI(4)P）的交换 通过 不同的机制33它们具有一个类似于 Osh6p 的中央 ORD 结构域，但可直接锚定在内质网上 通过 C端跨膜区段33 并与质膜结合 通过 一个N端Pleckstrin同源（PH）结构域，可识别PI(4)P和PI(4,5)P233,34,35ORP5/8 利用 PI(4)P 转运 PS，已有研究表明 ORP5/8 还可调节质膜上的 PI(4,5)P₂2 水平，并可能调节信号通路。相应地，PI(4)P 和 PI(4,5)P 的减少2 PS水平升高会降低ORP5/ORP8的活性，因为这些蛋白以依赖磷脂酰肌醇磷酸（PIP）的方式与质膜（PM）结合。异常升高的PS合成（可导致Lenz-Majewski综合征）通过ORP5/8影响PI(4)P水平36当两种蛋白质的活性均被抑制时，磷脂酰丝氨酸（PS）在质膜（PM）上的丰度降低，从而减弱信号蛋白的致癌能力。37.
相反，ORP5的过表达似乎会促进癌细胞的侵袭和转移过程38。因此，ORP5/8活性的改变可通过影响脂质稳态而显著改变细胞行为。此外，ORP5和ORP8定位于内质网-线粒体接触位点，并维持部分线粒体功能，这可能通过向线粒体提供磷脂酰丝氨酸（PS）实现39。另外，ORP5还定位于内质网-脂滴接触位点，通过PS/PI(4)P交换将PS递送至脂滴40。本文所述的策略旨在检测（i）从脂质体中提取PS和PI(4)P，以及（ii）脂质体间PS和PI(4)P的转运，该方法最初用于建立和分析Osh6p/Osh7p的PS/PI(4)P交换活性12,32，并已被其他研究团队用于分析ORP5/ORP835及其他脂质转运蛋白（LTPs）的活性10,41。该方法基于使用荧光酶标仪、标准L型荧光分光光度计，以及两种分别可检测PS和PI(4)P的荧光探针NBD-C2Lact 和NBD-PHFAPP。
NBD-C2乳糖 对应于乳粘素（lactadherin）糖蛋白的C2结构域，该结构域经重新设计，在假定的磷脂酰丝氨酸（PS）结合位点附近引入了一个独特的溶剂暴露性半胱氨酸残基；一个对极性敏感的NBD（7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑）荧光探针共价连接至该残基图1A)12更准确地说，将乳粘素（Bos taurus，UniProt: Q95114，残基270-427）的C2结构域克隆至pGEX-4T3载体中，以实现其与谷胱甘肽S-转移酶（GST）的融合表达 大肠杆菌C2乳糖 将序列进行突变，以丙氨酸残基取代两个溶剂可及的半胱氨酸残基（C270、C427），并在假定的PS结合位点附近区域引入一个半胱氨酸残基（H352C突变），后者可随后用N,N'-二甲基-N-(碘乙酰基)-N'-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)乙二胺（IANBD）进行标记&#160;12在GST蛋白与C2结构域N端之间存在一个凝血酶切割位点。主要优势在于该结构域能在Ca²⁺存在下选择性识别磷脂酰丝氨酸（PS）。2+-独立的方式，与其他已知的C2结构域或膜联蛋白A5相反42NBD-PHFAPP 源自人类PH结构域&#160;四磷酸肌醇适配蛋白1（FAPP1），经重新设计后包含一个位于PI(4)P结合位点附近、暴露于溶剂的单个半胱氨酸，可标记NBD基团图1A)43人源FAPP蛋白PH结构域的核苷酸序列（UniProt: Q9HB20，片段[1-100]）已克隆至pGEX-4T3载体中，用于与GST标签串联表达。该PHFAPP 序列已进行修饰，以在蛋白质的膜结合界面内插入一个独特的半胱氨酸残基43此外，在凝血酶切割位点与PH结构域的N端之间引入了一个九氨基酸残基的连接序列，以确保蛋白酶能够有效接触切割位点。
为了测量NBD-C2从脂质体中的提取情况乳糖 与含有少量磷脂酰丝氨酸（PS）的磷脂酰胆碱（PC）脂质体混合。由于该探针对PS具有亲和性，因此会结合到脂质体上，当NBD荧光基团接触到膜的疏水环境时，其极性发生变化，导致荧光发生蓝移并增强。若通过化学计量的LTP几乎完全提取了PS，则探针无法与脂质体结合，NBD荧光信号降低（图1B)32该信号差异被用于判断是否存在长时程增强（LTP）例如， Osh6p）提取PS。NBD-PH也采用类似策略。FAPP 测量PI(4)P的提取图1B），如先前所述12,32. 设计了两种基于FRET的检测方法，用于（i）测量PS从LA 至 LB 分别模拟内质网膜和质膜的脂质体，以及（ii）PI(4)P逆向运输。这些实验在相同条件下进行（即， 相同的缓冲液、温度和脂质浓度）以检测PS/PI(4)P交换. 为了测量PS的转运，使用NBD-C2乳糖 与L混合A 由磷脂酰胆碱组成并掺入5 mol%磷脂酰丝氨酸和2 mol%荧光罗丹明标记的磷脂酰乙醇胺的脂质体&#160;(Rhod-PE)-和LB 掺入5 mol% PI(4)P的脂质体
在零时刻，Rhod-PE 的 FRET 会淬灭 NBD 荧光。如果磷脂酰丝氨酸（PS）从 L 转运A 至 LB 脂质体例如， 注射Osh6p后，由于NBD-C2的转位，迅速发生去淬灭现象乳糖 L中的分子A 至 LB 脂质体图1C）。根据可接触的PS量，NBD-C2乳糖 在整个实验过程中基本保持在膜结合状态12因此，NBD信号的强度与NBD-C2的分布直接相关乳糖 L之间A 和 LB 脂质体，并可轻松进行归一化处理以确定转移的PS量。为测量PI(4)P在相反方向的转移，使用NBD-PHFAPP 与L混合A 和 LB 脂质体；因为它仅与L结合B 含有PI(4)P但不含Rhod-PE的脂质体，其荧光强度较高。若PI(4)P被转移至LA 脂质体，它会转位至这些脂质体，并因与Rhod-PE发生FRET而导致信号减弱（图1C）。信号经过归一化处理，以确定转移的PI(4)P量43.

<table><tbody><tr><td>&amp;nbsp;L-半胱氨酸 &amp;ge;97%（FG）&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>W326305-100G</td><td>用去离子水配制10 mM的L-半胱氨酸储备液。分装后于-20 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>2 mL 棕色小瓶，带PTFE/橡胶内衬，用于CHCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;中脂质的储存</td><td>Wheaton</td><td>W224681</td><td></td></tr><tr><td>直径4 mm玻璃珠</td><td>Sigma</td><td>Z265934-1EA</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 锥形离心管</td><td>Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;Auml;KTA 纯化仪</td><td>GE healthcare</td><td></td><td>FPLC</td></tr><tr><td>铝箔</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 超滤离心管，截留分子量为3 kDa和10 kDa</td><td>Merck</td><td>UFC900324, UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 超滤离心管，截留分子量为3 kDa和10 kDa</td><td>Merck</td><td>UFC800324, UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td></td><td></td><td>用过滤除菌的水配制50 mg/mL的储备液，并于-20 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>亮肽素（Bestatin）</td><td>Sigma</td><td>B8385-10mg</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Gold 感受态细胞</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C16:0 Liss&amp;nbsp;（Rhod-PE）溶于CHCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;（1 mg/mL）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810158C-5MG</td><td></td></tr><tr><td>C16:0/C16:0-PI(4)P&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Echelon Lipids</td><td>P-4016-3</td><td>将1 mg C16:0/C16:0-PI(4)P粉末溶于250 &amp;micro;L甲醇和250 &amp;micro;L CHCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;中，再用CHCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;补至1 mL，溶液应变为澄清</td></tr><tr><td>C16:0/C18:1-PS（POPS）溶于CHCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;（10 mg/mL）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840034C-25mg</td><td></td></tr><tr><td>C18:1/C18:1-PC（DOPC）溶于CHCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;（25 mg/mL）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C-500mg</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td>用去离子水配制10 mM的CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;储备液</td></tr><tr><td>细胞破碎仪</td><td>Constant Dynamics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯仿（CHCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;），RPE-ISO级</td><td>Carlo Erba</td><td>438601</td><td></td></tr><tr><td>不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物（Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail）</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>去离子水（Milli-Q水）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>二甲基甲酰胺（DMF），无水，&gt;99%纯度</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>重组DNA酶I，无RNA酶，粉末状</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Euromedex</td><td>EU0006-B</td><td>用Milli-Q水配制1 M的DTT储备液。&amp;nbsp; 分装为1 mL每管，于-20 &amp;deg;C保存&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Econo-Pac层析柱（1.5 &amp;times; 12 cm）</td><td>Biorad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>2 mm电穿孔比色皿</td><td>Ozyme</td><td>EP102</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 2510电穿孔仪</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>固定角转子Ti45及Ti45离心管</td><td>Beckman</td><td>用于细菌裂解液的离心</td><td></td></tr><tr><td>玻璃注射器（10、25和50 &amp;micro;L），用于荧光实验</td><td>Hamilton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃注射器（25、100、250、500和1000 &amp;micro;L），用于处理脂质储备液</td><td>Hamilton</td><td>1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN type3, 1001RN</td><td></td></tr><tr><td>谷胱甘肽Sepharose 4B珠</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0756-05</td><td></td></tr><tr><td>甘油（99%纯度）</td><td>Sigma</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>带盖溶血管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES，&gt;99%纯度</td><td>Sigma</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>Illustra NAP 10脱盐柱</td><td>GE healthcare</td><td>GE17-0854-02</td><td></td></tr><tr><td>异丙基-&amp;beta;-D-硫代半乳糖苷（IPTG）&amp;nbsp;</td><td>Euromedex</td><td>EU0008-B</td><td>用Milli-Q水配制1 M的IPTG储备液。分装为1 mL每管，于-20 &amp;deg;C保存&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>乙酸钾（K-Acetate）</td><td>Prolabo</td><td>26664.293</td><td></td></tr><tr><td>不含葡萄糖的Lennox LB培养基</td><td></td><td></td><td>用Milli-Q水配制并高压灭菌</td></tr><tr><td>液氮</td><td>Linde</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甲醇（MeOH）&amp;ge;99.8%</td><td>VWR</td><td>20847.24</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td></td><td>配制2 M的MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;溶液，用0.45 &amp;micro;m滤膜过滤&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>96孔黑色非结合型聚苯乙烯微孔板</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655900</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Extruder，配有两个1 mL气密型Hamilton注射器</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610023</td><td></td></tr><tr><td>基于单色仪的荧光酶标仪</td><td>TECAN</td><td>M1000 Pro</td><td></td></tr><tr><td>N,N'-二甲基-N-(碘乙酰基)-N'-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)乙二胺（IANBD酰胺）</td><td>Molecular Probes</td><td></td><td>将25 mg IANBD溶于2.5 mL二甲基亚砜（DMSO）中，分装为25管，每管100 &amp;micro;L，置于1.5 mL螺口管中。盖子不要完全拧紧。然后用冻干机除去DMSO，每管得到1 mg干燥的IANBD。将管子密封后避光保存于-20 &amp;deg;C&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，1.8 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，高压灭菌后于4 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>梨形玻璃烧瓶（25 mL，14/23，Duran玻璃）</td><td>Duran Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胃蛋白酶抑制剂（Pepstatin）</td><td>Sigma</td><td>p5318-25mg</td><td></td></tr><tr><td>pGEX-C2&lt;sub&gt;LACT&amp;nbsp; &lt;/sub&gt;质粒</td><td></td><td></td><td>可向本实验室申请获取</td></tr><tr><td>pGEX-PH&lt;sub&gt;FAPP&lt;/sub&gt;质粒</td><td></td><td></td><td>可向本实验室申请获取</td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟（PMSF）&amp;ge;98.5%（GC）</td><td>Sigma</td><td>P7626-25g</td><td>用异丙醇配制200 mM的PMSF储备液</td></tr><tr><td>磷酰胺（Phosphoramidon）</td><td>Sigma</td><td>R7385-10mg</td><td></td></tr><tr><td>聚碳酸酯滤膜（直径19 mm），孔径0.2 &amp;micro;m</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610006</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Prep层析柱（床体积0–2 mL，带10 mL储液槽）</td><td>Biorad</td><td>7311550</td><td></td></tr><tr><td>预滤器（直径10 mm）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610014</td><td></td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>http://pymol.org/</td><td></td><td>构建蛋白质的三维模型（图1A）</td></tr><tr><td>用于紫外/可见光荧光检测的石英比色皿（最小体积600 &amp;micro;L）</td><td>Helma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>石英比色皿</td><td>Helma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷冻离心机 Eppendorf 5427R&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>旋转蒸发仪</td><td>Buchi</td><td>B-100</td><td></td></tr><tr><td>螺口微量离心管（1.5 mL）</td><td>Sarsted</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小型聚四氟乙烯（PTFE）磁力搅拌子（5 &amp;times; 2 mm）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>快封微量离心管（0.5、1和2 mL）</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYPRO Orange</td><td></td><td></td><td>用于SDS-PAGE凝胶中蛋白质的荧光染色</td></tr><tr><td>恒温混匀仪（Thermomixer）</td><td>Starlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>人血浆凝血酶（THROMBIN, FROM HUMAN PLASMA）</td><td>Sigma</td><td>10602400001</td><td>将20单位溶于1 mL Milli-Q水中，分装为25 &amp;micro;L每管，置于0.5 mL Eppendorf管中。冻干后于-80 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>Tris，超纯</td><td>MP</td><td>819623</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机 L90K</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>紫外/可见光吸收分光光度计</td><td>SAFAS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>带温控样品池和搅拌装置的紫外/可见光荧光分光光度计</td><td>Jasco 或 Shimadzu</td><td>Jasco FP-8300 或 Shimadzu RF-5301PC</td><td></td></tr><tr><td>真空室</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Julabo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XK 16/70层析柱，填充Sephacryl S200HR</td><td>GE healthcare</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

基于荧光的膜间磷脂酰丝氨酸/磷脂酰肌醇-4-磷酸交换测量方法

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

近年来，人们发现进化上保守的氧化固醇结合蛋白（oxysterol-binding protein, OSBP）相关蛋白（ORP）/OSBP同源蛋白（Osh）家族中的多个成员代表了一类新型的脂质转移蛋白（lipid transfer protein, LTP），可在酵母和人类细胞中将磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine, PS）从内质网（endoplasmic reticulum, ER）转移至质膜（plasma membrane, PM）。 通过 PS/磷脂酰肌醇4-磷酸（PI(4)P）交换循环。该发现有助于更深入理解对信号传导过程至关重要的PS在细胞内的分布方式，以及这一过程与磷脂酰肌醇（PIP）代谢之间关联的研究。新型基于荧光的实验方案的开发在这一新细胞机制的发现与表征过程中发挥了关键作用。 体外 在分子水平上。本文描述了两种荧光标记脂质探针 NBD-C2 的制备与应用乳糖 和 NBD-PHFAPP，用于检测某种蛋白质提取磷脂酰丝氨酸（PS）或磷脂酰肌醇-4-磷酸（PI(4)P）的能力，以及在人工膜之间转移这些脂质的能力。首先，本方案描述了如何制备、标记并获得这两种构建体的高纯度样品。其次，本文阐述了如何结合荧光酶标仪使用这些传感器，以Osh6p为实例，检测目标蛋白是否能够从脂质体中提取PS或PI(4)P。最后，本方案展示了如何利用标准荧光分光光度计，通过荧光共振能量转移（FRET）技术，精确测定由特定脂质组成脂质体之间的PS/PI(4)P交换动力学，并计算脂质转移速率。

<img alt="蛋白质-脂质相互作用；NBD标记的蛋白质结合PS/PI(4)P；荧光实验示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62177/62177fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：荧光脂质传感器的描述及 体外 检测方法 (ANBD-C2的三维模型乳糖 和 NBD-PHFAPP 基于牛乳粘素C2结构域的晶体结构（PDB ID: 3BN6）48）以及人源FAPP1蛋白PH结构域的NMR结构（PDB ID: 2KCJ）46）。一个 N,N'-二甲基-N-(硫代乙酰基)-N'-(7-硝基苯并...

本文描述了利用荧光脂质探针和脂质体来确定某种蛋白质是否提取并转运磷脂酰丝氨酸或磷脂酰肌醇4-磷酸的实验方案 体外.

近期发现，进化上保守的氧化固醇结合蛋白（oxysterol-binding protein, OSBP）相关蛋白（ORP）/OSBP同源蛋白（Osh）家族的多个成员……

该方法利用荧光技术检测蛋白质是否在合成膜之间转移生物学上重要的脂质，从而揭示这些脂质在真核细胞内的分布机制。该技术可实现对蛋白质提取和转运天然脂质过程的研究，仅需使用易于制备的荧光细胞和脂质体。该方法可用于研究蛋白质在细胞器与膜之间分配某些必需脂质的生物学过程，并可进行修改以深入探究相关细胞生物学机制。通过荧光法实时测量脂质转移过程的操作步骤，需要借助直观的视觉演示才能有效阐明。因此，本实验操作将由本实验室工程师 Maud Magdeleine 进行示范。首先配制新鲜的 HEPES 钾盐缓冲液，经滤膜过滤并脱气处理，再加入一毫摩尔氯化镁，制成 HKM 缓冲液。然后，制备仅由PC组成的脂质体，或额外掺入2摩尔百分比的PS或PI(4)P的脂质体。接着，将烧瓶置于旋转蒸发仪上，在真空条件下干燥脂质。在一个孔中，将含有2摩尔百分比PS的脂质体与脂质传感器NBD-C2 Lact混合，终浓度为250纳摩尔，终体积为100微升。用相同量的脂质体和NBD-C2乳剂混合物填充第二个孔，并加入3微摩尔的脂质转移蛋白（LTP）；用250纳摩尔的NBD-C2乳剂与纯80微摩尔的PC脂质体混合填充第三个孔，第四个孔则仅加入纯80微摩尔的PC脂质体。重复上述步骤，再制备三组各四个孔的样品。然后将多孔板放入荧光读板仪中。在25°C条件下，于490纳米激发光下，对每个孔采集505至650纳米波长范围内的NBD荧光光谱，激发带宽为5纳米。对于每组实验，用其他样品的光谱减去仅含脂质体的对照孔所记录的光谱。对于 PI(4)P 提取实验，制备掺入2摩尔百分比磷脂酰肌醇-4-磷酸的脂质体，并使用 NBD-PH FAPP 探针进行检测。进行对照实验并确定提取百分比。完成脂质体挤出后，将挤出的脂质体装入离心管中。新鲜配制并脱气过滤的 HKM 缓冲液，将含有挤出脂质体的试管置于室温下保存。对于含有罗丹明标记的磷脂酰乙醇胺的脂质体试管，需用铝箔包裹，并存放于不透明盒子中，以防止光漂白。将温度设定在 25 至 37 摄氏度之间，激发单色器调节至 460 纳米（带宽较窄，为 1 至 3 纳米），发射波长设为 530 纳米（带宽较宽，大于 10 纳米）。将采集时间设置为二十五分钟，时间分辨率不超过一秒。在石英比色皿中，稀释30微升LA脂质体悬浮液和NBD-C₂-lact储备溶液，并预热HKM缓冲液，制备终体积为570微升的样品，其中包含200微摩尔总脂质和250纳摩尔NBD-C₂-lact。加入一根小型磁力搅拌子，将比色皿置于荧光仪样品槽中。待样品达到热平衡后，启动测量。一分钟后，向样品中加入30微升LB脂质体悬浮液。三分钟后，加入LTP，使LTP的终浓度为200纳摩尔，随后继续采集剩余21分钟的信号。进行平行实验以标准化NBD信号。将30微升LA平衡脂质体悬浮液与250纳摩尔NBD-C2 lact在HKM缓冲液中混合，终体积为570微升。一分钟后，注入30微升LB平衡脂质体悬浮液。将使用目标LTP测得的动力学曲线转换为随时间从LA脂质体转移到LB脂质体的PS量。然后对曲线中的每个数据点进行归一化处理。使用与PS转移实验相同的底物发射体设置和条件进行PI(4)P实验。在比色皿中，加入30微升lb脂质体悬浮液和NBD-PH FAPP探针，并用预热的HKM缓冲液定容至终体积570微升。待样品温度平衡后，开始测定。一分钟后，注入30微升LA脂质体悬浮液。三分钟后，注入感兴趣的LTP并记录信号。进行第二次实验以标准化NBD信号。将30微升lb平衡脂质体悬浮液与250纳摩尔NBD-PH FAPP及570微升HKM缓冲液混合。一分钟后，注入 30 微升 LA 平衡脂质体悬液。转换动力学曲线以确定 PI(4)P 随时间从 LB 转移至 LA 脂质体的量，然后对每个数据点进行归一化处理，以量化 LTP 的效率程度。对转移动力学的初始数据点进行线性回归以获得斜率。将斜率值除以反应混合物中 LTP 的浓度，以确定每单位时间内每个蛋白质转移的脂质分子数。通过 SDS-PAGE 分析验证了从磁珠中有效回收 C2 乳酸。用NBD标记的C2乳蛋白的紫外-可见吸收光谱证实，所有C2乳蛋白分子均被NBD基团标记。通过SDS-PAGE分析确定了NBD-C2乳蛋白的纯度及其荧光特性。当仅使用含有PS或PI(4)P的脂质体进行孵育时，NBD-C2乳蛋白或NBD-PH FAPP的荧光信号最强，表明该传感器与膜结合。 当同时存在 Osh6p 时，观察到荧光较低，表明该蛋白能有效从脂质体中提取磷脂酰丝氨酸（PS）或磷脂酰肌醇-4-磷酸（PI(4)P）。图中显示了以 Osh6p 作为脂质转运蛋白（LTP）进行的 PS 转运实验结果。计算了 PS 从 LA 脂质体向 LB 脂质体转移的平均动力学曲线，LB 脂质体中掺入或未掺入磷脂酰肌醇-4-磷酸。平均初始PS转运速率由三个不同的实验确定。同样，此处展示了使用Osh6p作为脂质转移蛋白的PI(4)P转移实验的结果，以及信号归一化后获得的平均动力学曲线。使用掺入或未掺入PS的LA脂质体测量了平均转移速率。执行本方案时，请使用新鲜缓冲液并于同一天进行制备。尽量减少荧光脂质体和蛋白质的光照暴露，使用纯度良好的NBD标记蛋白，并将其置于冰上保存。可通过利用基因编码的荧光脂质传感器测量原核细胞内细胞器之间PS和PI(4)P的转移来验证。该技术为进一步理解PS和PI(4)在细胞内的分布情况，以及多种LTPS的活性特异性提供了途径。

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磷脂酰肌醇4,5-二磷酸，质膜，单分子成像，超分辨率显微镜，荧光探针

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基于荧光的膜间磷脂酰丝氨酸/磷脂酰肌醇-4-磷酸交换测量方法

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