使用清晰组织清除方法对全山视网膜进行免疫染色

在这里，我们提出了一个协议，以调整整个安装视网膜脑组织的CLARITY方法，以提高标准免疫化学染色和视网膜神经元及其细胞下结构的高分辨率成像的质量。

该协议允许研究视网膜神经元的精细形态，并可以深入了解在疾病状态中发生的细胞和亚细胞形态变化。该方法显著提高了视网膜的光学透明度，并允许在激素视网膜制备中实现视网膜神经元的高分辨率、三维成像、电路布线和精细的亚细胞结构。用弯曲的钳子使鼠标眼睛受洗，并将它们转移到带有 0.1 M PBS 的小培养皿中。

在解剖显微镜下用针头沿着角膜硬膜结处戳一个小孔，然后将眼睛转移到4%功率甲醛中一小时。将眼睛移回带有 PBS 的菜。在解剖显微镜下，使用解剖剪刀在科内奥斯特拉尔交界处一路切割。

取出角膜和镜片。然后在视神经底部切开它，用钳子小心地剥去硬膜，以隔离视网膜。在视网膜周围均匀地进行四个小切口，并使用浸入 PBS 的细尖刷，将其平整的 GCL 侧面放在三叶草状形状上，由硝基纤维素滤纸切成小方形。

用钳子拾起硝基纤维素纸的一角，放在48个油井板中，用4%的功率甲醛放置一小时，然后将滤纸和网膜转移到PBS的井中，每次洗三次，每次洗五分钟。在冰上解冻 A4P0 溶液。然后将小膜转移到A4P0溶液中，在四摄氏度的温度下温和地孵育一夜。

将植物油加入油井中，以完全覆盖 A4P0 溶液。在40摄氏度的水浴中孵化3小时，无颤抖。然后在 PBS 中洗三次，每次洗涤五分钟。

在40摄氏度的高温下将视网膜孵化两天，轻轻摇晃，然后用Triton X-100将滤纸和视网膜转移到PBS，每次洗涤90分钟洗5次。最后洗涤后，将视网膜存放在PBS-T的4摄氏度，含0.01%钠，或直接移动至免疫染色。用 PBS-T 中的细尖刷轻轻剥落滤纸，从滤纸中取出网膜。

在主抗体中孵育，在40摄氏度的阻塞溶液中稀释两天，轻轻摇晃。孵化后，在PBS-T中洗5次90分钟。在40摄氏度的阻塞溶液中用适当的二次抗体孵育视网膜，轻轻摇晃两天。

在整个过程的剩余过程中保护样品免受光线的照射。在 0.02 M 磷酸盐缓冲区中洗涤 5 次，90 分钟。最后在40摄氏度的温度下，在基于山醇的折射指数匹配溶液中孵育网膜，轻轻摇晃。

勾勒出带有细尖永久标记的玻璃盖滑梯，以标记玻璃显微镜幻灯片背面的方形边界。翻转滑梯，使用注射器在滑梯正面用细细的硅胶油脂线追踪边界。在一个角落留下一个小缺口，以便多余的安装解决方案以逃避。

将直膜转移到边界区域的中心，用细尖刷将其放置，使其与光感受器侧平放在玻璃滑梯上。派珀特约60微升的SRIMS，以便它覆盖扁平的网状网膜，并延伸到外壳的一角。确保小膜保持平整和原位。

应用盖滑，从角落开始与 SRIMS，并慢慢降低它，直到它触及油脂的所有方面。将一叠三个盖片放在安装的网膜的每一侧作为垫片。使用另一张幻灯片的长边向下按下盖滑，使山是平的，均匀的。

将幻灯片存放在摄氏四度，直到成像。首先将幻灯片放在显微镜舞台上并定位样品。要获取样品的 Z 堆叠图像，请首先单独聚焦每个通道中的信号，并分别设置荧光或共焦显微镜的曝光时间或扫描速度。

通过手动将焦距设置在所需范围的顶部和底部，或者设置中点，然后在中点周围指定范围，为 Z 堆栈设置范围。根据需要调整步幅大小或切片数量。捕获图像并保存原始文件。

然后作为 TIF 文件或其他所需的格式导出。使用图像分析、选择的软件来调整每个通道的亮度和对比度，直到在单个图像和 Z 堆栈的三维渲染中实现最佳清晰度。与非加工控制视网膜相比，使用修改后的 CLARITY 协议处理时，观察到视网膜厚度的完全光学透明度。

此处显示了在 ONL 中标记的塞洛丁标记圆锥体的 Z 堆叠图像，在 INL 中标记 DAC 的 TH 的 Z 堆叠图像，以及在 GCL 中标记的 RBPMS 标记的 RGC 的 Z 堆叠图像。在叠加图像中观察到神经元在整个视网膜厚度的相对位置。TH染色和CLARITY处理整个视网膜山与从标准制备获得的图像进行比较。

与标准网状网膜相比，DAC 的树突和轴突状过程在清晰处理的网状中更清晰地显现出来。与标准的光膜相比，DAC 的Axon 样过程在清晰的网状网膜中表现出完整的环状结构。使用荧光显微镜拍摄的CLARITY光子的环状结构与使用共聚焦显微镜观察到的结构几乎相同。

类似轴龙的过程也向外视网膜运行。对GluA2和PSD-95的免疫染色显示明显的双关语，分别揭示含有AMPA受体和假设性后突触位点的单独GluA2。叠加图像显示了 DAC 进程上的一些点缀。

在 XZ、YZ 和 XY 平面中提出了假设性联合本地化点，TH 与 GluA2 和 PSD-95 都清晰地进行了联合本地化。重要的是，在水凝胶聚合过程中，网膜保持平整，以便清除的网膜可以平放用于安装和成像过程。