从冷冻嵌合肝组织中提取染色质，用于染色质免疫沉淀分析

该协议侧重于从快速冷冻组织中制备染色质，适用于交联染色质免疫沉淀（X-ChIP），然后进行定量PCR分析（X-ChIP-qPCR）或下一代测序方法（X-ChIP-seq）。

该方案导致从冷冻肝脏标本中提取可重复且可靠的染色质，用于染色质免疫沉淀实验。首先，将装有冷冻组织的管子放在研钵中，让它在那里静置五分钟。然后使用预冷的杵对样品施加压力，直到不再有固体碎屑。

从研钵中取出装有样品的管子。加入950微升冰冷的PBS和所需的抑制剂，轻轻上下移液，直到样品完全重悬。立即将组织悬浮液转移到均质器中，并用杵A施加20至30次冲程以获得更精细的悬浮液。

避免将杵移出液相以防止起泡。将匀浆转移到先前在冰上冷却的新1.5毫升管中。然后将试管在 1， 300 G 和 4 摄氏度下离心五分钟。

小心地除去上清液，并通过轻轻移液将沉淀完全重悬于950微升室温PBS中。然后加入63.6微升16%无甲醇甲醛，得到终浓度为1%立即在室温下旋转试管10分钟。旋转后，在室温下加入113微升1.25摩尔甘氨酸以获得125毫摩尔终浓度，并将管再旋转五分钟。

然后将样品在 1， 300 G 的温度下在 4 摄氏度下离心三分钟。弃去上清液，并通过移液到含有所需抑制剂的950微升冰冷PBS中小心重悬沉淀。再次离心样品并重悬沉淀，如前所述。

再次重复离心步骤，并立即进行染色质分离程序。将950微升缓冲液A与所需的抑制剂添加到沉淀中，并通过移液轻轻混合，直到沉淀完全重悬。然后在 4 摄氏度下旋转试管 10 分钟。

旋转后，将样品在4摄氏度下以2， 000 G离心5分钟，然后小心地除去上清液。向沉淀中加入950微升缓冲液B和所需的抑制剂，并通过移液轻轻混合，直到沉淀完全重悬。然后在 4 摄氏度下旋转试管 10 分钟。

旋转后，再次离心样品。除去上清液。然后将300微升室温缓冲液C与所需的抑制剂加入沉淀中，并大力移液。

涡旋样品15至30秒。然后短暂旋转试管以收集盖子上的液滴。对染色质样品进行超声处理后，加入30微升10%Triton X-100溶液并涡旋5至10秒。

将样品在 16， 000 G 下在 4 摄氏度下离心 15 分钟。并将上清液转移到在冰上预冷的干净的1.5毫升管中。将10至25微升剪切染色质转移到新管中，并加入缓冲液C以达到200微升的最终体积。

等分试样和电击将染色质的其余部分冷冻在零下 80 摄氏度，直到进一步使用。加入八微升五摩尔氯化钠，在加热块中以65摄氏度孵育至少6小时，同时以1， 000 RPM振荡。如果可能，将孵育时间延长过夜。

让样品在室温下冷却五分钟后，加入两微升RNase A并在37摄氏度下孵育一小时，同时以1， 000 RPM振荡。从加热块中取出样品，加入7微升300毫摩尔氯化钙和2微升蛋白酶K.将样品在56摄氏度的加热块中孵育30分钟，同时以1， 000 RPM振荡。同时，通过在 4 摄氏度下将样品离心至 16， 000 G 一分钟，为每个样品准备一个相分离管。

从加热块中取出试管并让它们在室温下平衡三分钟后，将 400 微升样品转移到先前离心的相分离管中。接下来，加入400微升苯酚氯仿异戊醇溶液，涡旋5秒钟。将试管以 16， 000 G 在 4 摄氏度下离心五分钟。

然后加入400微升氯仿并涡旋五秒钟。将试管再离心五分钟，然后将400微升上相转移到新的1.5毫升管中，该管含有24微升5摩尔氯化钠和0.75微升糖原。然后短暂涡旋试管。

加入1， 055微升100%乙醇。然后彻底涡旋并将样品在零下80摄氏度下孵育一小时或在零下20摄氏度孵育过夜。孵育完成后，将样品在4摄氏度下以16， 000G离心30分钟，并小心地除去上清液而不会使沉淀脱位。

加入500微升冷的70%乙醇，轻轻倾斜试管以确保颗粒被清洗。将试管以 16， 000 G 在 4 摄氏度下离心 15 分钟。小心地除去整个上清液，让沉淀在室温下干燥。

或者，将试管在 37 摄氏度下孵育以加快干燥速度。加入50微升Tris-EDTA溶液，将管子放在加热块上，以300 RPM振荡5至10分钟。然后在1%琼脂糖凝胶上分析DNA。

在染色质去交联和琼脂糖凝胶上DNA可视化后，可以通过存在100至300个碱基对范围内的片段来识别成功的剪切。染色质经H3K4三甲基化、H3K27乙酰化和H3 K27三甲基化抗体成功沉淀，并进一步通过qPCR进行分析。在肝脏中积极转录的染色体一开放阅读框43、蛋白酶体20S亚基β2和甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子区域显示H3K4三甲基化和H3K27乙酰化富集。

相比之下，同源盒C13，同源盒C12和小鼠髓鞘转录因子一启动子区域在肝脏中沉默没有像预期的那样富集。H3 K27 三甲基化显示出相反的行为，从而证实了染色质免疫沉淀或 ChIP 测定的成功。染色质成功经受ChIP-Seq。

测序后，将芦苇与先前制备的指数对齐，并根据物种进行分离。H3K4三甲基化和H3K27乙酰化沉积在基因转录起始位点与H3K27三甲基化沉积拮抗。众所周知，Hox C簇在小鼠和人类肝脏中均无转录活性。

H3K4三甲基化和H3K27乙酰化的分析显示，这两种翻译后修饰在簇外出现峰值，而H3K27三甲基化的信号强度在基因簇内趋于增加。从冷冻组织标本中提取染色质具有很高的内在变异性，很大程度上取决于交联过程中的细胞悬液细度和温度。确保固定的实验室条件有助于保持片段大小范围的可重复性。