Name: 建立高通量表皮球体培养系统，以模拟角膜细胞干细胞可塑性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 了解高通量表皮球体培养系统的建立方法，使用Dispase酶分离新生儿包皮组织，通过三维悬浮培养模拟角膜细胞干细胞可塑性。该技术为研究上皮组织疾病和再生医学提供了可靠的细胞模型。

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南卡罗来纳大学医学院仪器资源中心（IRF）提供了成像和细胞分选设备的使用权限及技术协助。本工作部分由资助项目1R21CA201853支持。分子细胞生物学核心设施（MCF）和IRF还获得美国国立卫生研究院（NIH）资助项目P20GM103499（SC INBRE）的部分支持。MCF还获得NIH资助项目P20GM109091的支持。Yvon Woappi的部分研究工作由NIH资助项目2R25GM066526-06A1（PREP）和R25GM076277（IMSD）以及南卡罗来纳大学Grace Jordan McFadden教授项目奖学金资助。Geraldine Ezeka和Justin Vercellino由南卡罗来纳大学NIH资助项目2R25GM066526-10A1（PREP）支持。Sean M. Bloos获得了南卡罗来纳大学2016年Magellan学者奖的支持。

南卡罗来纳大学（UofSC）机构审查委员会（IRB）已审核皮肤标本采集与处理以及人角质形成细胞分离的实验方案，并将其归类为 &#34;不涉及人类受试者的研究&#34;，因为包皮样本是在常规手术程序（新生儿男婴包皮环切术）中产生的手术废弃组织，且完全不含任何可识别个人信息。该方案还定期接受南卡罗来纳大学生物安全委员会（UofSC Biosafety Committee）的审查与批准，所有实验室人员均接受了实验室生物安全培训。所有操作均符合南卡罗来纳大学（UofSC）的安全与伦理标准。
1. 从新生儿包皮组织中分离和培养人角质形成细胞
<ol>
	<li>在500 mL KSFM培养基中加入0.1 M HEPES缓冲液，配制洗涤液，并调节pH至7.2。使用500 mL真空滤器（孔径0.22 µm）对培养基进行灭菌。MCDB 153-LB基础培养基也可作为替代洗涤液用于代替KSFM。</li>
	<li>在超净工作台内，将新生儿包皮用5 mL洗涤液在50 mL锥形管中洗涤一次，重复两次。</li>
	<li>将洗涤后的包皮转移至无菌培养皿中。使用解剖刀和镊子刮除真皮层上的脂肪组织和疏松结缔组织。再用5 mL洗涤液在50 mL锥形管中重新洗涤包皮一次。</li>
	<li>将包皮表皮面朝上放置于6孔板中，每孔加入2 mL用洗涤液稀释的dispase酶溶液（50 U/mL）。</li>
	<li>将6孔板置于培养箱中孵育4小时（37 °C，5% CO2，95%湿度）。</li>
	<li>从培养箱中取出包皮，在无菌条件下转移至培养皿中。使用细尖镊子将表皮层与真皮层分离。</li>
	<li>将表皮组织放入含有2 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA的15 mL锥形管中。使用5 mL移液管机械性碾压漂浮的表皮组织。在37 °C孵育15分钟，每隔5分钟涡旋振荡5秒。</li>
	<li>孵育结束后，加入2 mL大豆胰蛋白酶抑制剂，通过移液混匀以中和胰蛋白酶活性。</li>
	<li>将细胞悬液在450 x g离心2分钟，随后在250 x g离心8分钟。</li>
	<li>用镊子小心去除漂浮的碎片，注意不要扰动细胞沉淀。小心吸除细胞沉淀上方的上清液。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于12 mL完全KSFM-scm培养基中，接种至10 cm培养皿。在37 °C、5% CO2、95%湿度条件下过夜培养。</li>
	<li>次日，使用吸液移液管移除旧培养基，更换为12 mL新鲜完全KSFM-scm培养基。在第4天和第7天重复换液操作。</li>
	<li>为维持正常人角质形成细胞（NHKc）培养的最佳生长状态，应在第10天以1:5比例传代细胞，防止细胞融合度超过80%。</li>
</ol>
2. 体外生成皮肤表皮球培养物
<ol>
	<li>在50 mL玻璃瓶中，将2.5 g琼脂糖加入50 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制5%琼脂糖混合液。在液体循环条件下进行高压灭菌，随后冷却至室温。</li>
	<li>准备培养板时，将含有已冷却琼脂糖溶液的玻璃瓶置于盛有200 mL去离子水（dH2O）的1 L塑料烧杯中。使用科研级微波炉加热熔化琼脂糖混合物，最多加热2分钟，每隔60秒轻轻左右倾斜瓶子以混匀琼脂糖。 
	警告：在微波炉中熔化琼脂糖会导致容器极度高温并产生压力积聚。每30秒应释放一次压力积聚。请穿戴适当的防护装备以防止受伤。</li>
	<li>将3 mL熔化的5%琼脂糖加入12 mL预热至42 °C的KSFM-scm中，最终获得1%琼脂糖（wt/vol）的浓度。 
	可选步骤：预热移液管和枪头，以防止软琼脂过早聚合。</li>
	<li>使用多通道移液器迅速将200 µL的1%琼脂糖混合液加入96孔圆底板的各个孔中（图1A）。将培养板置于25 °C的无菌环境中静置4小时，使琼脂糖充分聚合。 
	注意：实验可在此处暂停，并于次日继续。聚合后的琼脂糖板若用封口膜密封，可在37 °C保存最多24小时，或在4 °C保存最多48小时。使用前需在加湿培养箱中于37 °C预热至少1小时。</li>
	<li>通过吸除培养基并将细胞用2 mL PBS洗涤，传代球体形成的NHKc细胞。吸除PBS后，向洗涤后的细胞中加入2 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA。在37 °C孵育5分钟，或直至所有细胞完全脱落。向培养板中加入2 mL大豆胰蛋白酶抑制剂，将细胞从板上冲洗至15 mL离心管中。在250 x g条件下离心5分钟。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于1 mL PBS中。使用台盼蓝染色结合血细胞计数板或自动细胞计数仪测定细胞活力。</li>
	<li>将2 × 104个NHKc细胞分装至100 µL KSFM-scm中，并接种至预先制备的96孔圆底板的各个孔中。将培养板在37 °C、5% CO2、95%湿度条件下孵育过夜。</li>
	<li>使用倒置相差显微镜观察接种孔中表皮球体的形成情况。 
	注意：来源于正常人角质形成细胞的人表皮球体可在三维悬浮培养中维持活性长达96小时，但细胞活力会显著下降（图2）。</li>
</ol>
3. 表皮球体重新接种实验
<ol>
	<li>在3D表皮球体形成后24-48小时，向6 cm培养皿中加入4 mL预热的KSFM-scm。使用宽口1 mL移液枪头将单个球体转移至培养皿中，注意避免将其破坏。或者，可用无菌剃须刀片切割1 mL移液枪头末端以扩大其口径。</li>
	<li>将培养皿置于37 °C、5% CO2、95%湿度条件下过夜培养。</li>
	<li>使用倒置相差显微镜观察接种后的球体是否已贴附于培养皿底部，并观察细胞的增殖情况（图3）。每96小时更换一次培养基：轻柔吸除皿内2 mL旧培养基，缓慢加入2 mL新鲜KSFM-scm培养基。</li>
	<li>当球体来源的正常人角质形成细胞（SD-NHKc）达到70-80%融合度时进行传代，并继续开展后续实验。应频繁监测SD-NHKc的生长状态，避免细胞在培养中达到完全融合，否则将导致过早分化和细胞生长停滞（图3E-F）。</li>
	<li>表皮球体重铺实验通过捕捉表皮再生可塑性的各个关键连续阶段，模拟角质形成细胞介导的伤口修复过程，包括：a）稳态维持，b）分化停止/逆转，c）应激下的谱系可塑性，d）组织重建（图1B；表2）。该实验还可用于获取细胞群体以进行类器官漂浮培养，或如我们先前研究所示，用于模拟HPV介导的肿瘤发生过程11,12。</li>
</ol>
4. 三维荧光细胞追踪
<ol>
	<li>在6 cm培养皿中，用携带增强型绿色荧光蛋白（eGFP）基因的1 µg pMSCV-IRES-EGFP质粒载体转染可形成球体的2D单层NHKc细胞。将培养板置于37 °C、5% CO2、95%湿度条件下过夜孵育，并在荧光显微镜下观察（图4A）。 
	注意：转染过程必须在无血清、无抗生素的条件下完成。</li>
	<li>不移除转染混合物，向细胞中加入2 mL预热的KSFM-scm培养基。将培养板置于37 °C、5% CO2、95%湿度条件下过夜孵育。</li>
	<li>吸除培养皿中的全部转染培养基，加入3 mL预热的KSFM-scm培养基喂养细胞。在荧光显微镜的FITC通道下检测EGFP表达细胞的存在情况。</li>
	<li>将2 × 104个EGFP转染的细胞传代并接种至预先准备好的96孔圆底板的各个孔中。将培养板置于37 °C、5% CO2、95%湿度条件下过夜孵育。在荧光显微镜的FITC通道下观察并监测EGFPpos球体细胞的运动情况（图4B-C）。</li>
	<li>接种后24小时，向6 cm培养皿中加入3 mL预热的KSFM-scm培养基。使用宽口1 mL移液枪头将单个球体转移至培养皿中，注意避免将其破坏。将培养板置于37 °C、5% CO2、95%湿度条件下过夜孵育。</li>
	<li>使用荧光显微镜观察并分析扩增的SD-NHKcEGFP细胞。每96小时更换一次培养基：轻柔吸除培养皿内2 mL旧培养基，缓慢加入2 mL新鲜的KSFM-scm培养基。</li>
	<li>收获SD-NHKcEGFP细胞用于FACS分选或选定的实验分析。</li>
</ol>
5. 通过流式细胞术对球状体衍生（SD）亚群进行表征
<ol>
	<li>通过吸除旧培养基，并用 2 mL PBS 洗涤细胞，对 SD-NHKc 及相应的自体 2D 单层培养物进行传代。吸除 PBS 后，向洗涤后的细胞中加入 2 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA。在 37 °C 下孵育 5 分钟，或直至所有细胞完全脱落。</li>
	<li>向培养板中加入 2 mL 大豆胰蛋白酶抑制剂，将细胞转移至 15 mL 离心管中。在 250 x g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>用 1 mL PBS 重悬细胞沉淀。使用台盼蓝染色和自动细胞计数仪或血细胞计数板定量细胞活力。</li>
	<li>将含有 0.1–4 × 106 个 NHKc 细胞的 100 µL 悬液分装至 1.5 mL 微量离心管中。将管子置于冰上，并在避光环境中操作，可通过关闭超净台内的强光源来实现。</li>
	<li>向各管中加入 2 µL FITC 标记的抗整合素α6 抗体和 2 µL PE 标记的抗 EGFR 抗体，使终浓度为 1:50 稀释。准备一管不加抗体的样本作为未染色对照。在冰上避光或 4 °C 条件下孵育 30 分钟。可使用微珠或皮肤鳞状细胞癌（SCC）细胞系作为阳性对照，因为皮肤 SCC 细胞高表达整合素α6 和 EGFR。</li>
	<li>使用配备适当激光器的流式细胞仪进行流式细胞分析。</li>
	<li>利用阴性与阳性对照设定门控。分选整合素α6hi/EGFRlo 细胞亚群；该群为表皮干细胞组分。整合素α6hi/EGFRhi 细胞为增殖性前体细胞组分。整合素α6lo/EGFRhi 细胞为定向分化前体细胞组分（图 4D）。分选时，FACS 管中应至少含有 1 mL 冰冷的 KSFM-scm 培养基。</li>
	<li>通过将各分选管中的细胞转移至含有 PBS 的 15 mL 圆锥形离心管中（PBS 体积为分选细胞体积的 10 倍），检测分选后各细胞亚群的增殖能力。注意：必须用移液器反复吹打分选 FACS 管内壁数次，以彻底去除附着在管口边缘的细胞，因为角质形成细胞常在此处黏附。</li>
	<li>将 15 mL 离心管在 250 x g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，用 12 mL KSFM-scm 重悬细胞沉淀。将重悬的细胞转移至 6 cm 培养皿中，在 37 °C、5% CO2、95% 湿度条件下孵育过夜。</li>
	<li>次日，吸除培养皿中的培养基，加入 8 mL 预热的 KSFM-scm。在 37 °C、5% CO2、95% 湿度条件下继续孵育。每 3 天更换一次培养基（每次加入 12 mL），直至细胞融合度达到 70–80%（图 4E）。</li>
</ol>
6. 表皮球体中基底干细胞标志物的免疫荧光与染色
<ol>
	<li>将表皮球体转移至多聚赖氨酸包被的盖玻片上，使SD-NHKc细胞增殖至75%融合度。</li>
	<li>用预冷的PBS（4 °C）洗涤细胞两次，每次5分钟。</li>
	<li>用4%多聚甲醛（PFA）在室温下固定细胞20分钟。</li>
	<li>使用含1%甘氨酸的0.5% Triton X-100进行细胞通透处理，随后在室温下用含0.5% BSA和5%山羊血清的封闭液封闭30分钟。</li>
	<li>将样本与抗P63抗体（1:200）和抗角蛋白14抗体（1:200）在封闭液中4 °C孵育过夜。</li>
	<li>用含Tween 20的PBS（PBST，4 °C）洗涤三次，随后加入FITC和Alexa 568标记的二抗（1:1000稀释）进行孵育。</li>
	<li>封片前用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染核（1:5000稀释）。</li>
	<li>使用配备FITC和PE激光通道的荧光显微镜观察细胞（图4F）。</li>
</ol>
7. 表皮球培养物的转录分析
<ol>
	<li>设置三份低代次 NHKc 培养物的培养板，可用于从同一自体细胞系的单层、球状体及球状体衍生培养物中分离 RNA。</li>
	<li>将 3–5 个相应的表皮球体收集至一个 1.5 mL 微量离心管中。分别收获自体 SD-NHKc 和二维单层培养物。</li>
	<li>从所有三个组中提取总 RNA。</li>
	<li>使用 1 µg 总 RNA 进行逆转录反应。</li>
	<li>以 cDNA 为模板进行实时 PCR，以 GAPDH 作为内参对照（表 1）。</li>
	<li>通过琼脂糖凝胶电泳（2% v/v）验证扩增产物大小。 
	注意：若需对表皮球体培养物进行全转录组范围的表达谱分析，应从单个 NHKc 供体的大规模培养物及其相应供体来源的 SD-NHKc 中分别提取总 RNA，每组设置六个重复。</li>
	<li>使用生物分析仪评估 RNA 质量，确保 RNA 完整性数值（RIN）至少在 9.0 至 9.1 范围内。</li>
	<li>通过扩增和生物素标记总 RNA 样本进行微阵列实验。</li>
	<li>每份样本使用 100 ng 总 RNA，在含有 T7 RNA 聚合酶启动子序列的 NNN 随机引物存在下，逆转录生成双链 cDNA（ds-cDNA）。</li>
	<li>向 cDNA 样本中加入 T7 RNA 聚合酶以扩增 RNA，随后将 RNA 转录为单链 cDNA（ss-cDNA）。使用 RNase H 降解过量的 RNA。</li>
	<li>对 ss-cDNA 分子进行片段化并用生物素标记。</li>
	<li>在 45 °C 下对标记后的样本扩增 16 小时。</li>
	<li>使用杂交炉及洗涤染色试剂盒进行样本杂交。</li>
	<li>对已杂交的芯片进行洗涤和染色。</li>
	<li>使用扫描系统和计算机工作站对芯片进行扫描。</li>
	<li>完成芯片扫描后，将探针细胞强度（CEL）文件导入表达分析控制软件，结合库文件和鲁棒多芯片分析（RMA）算法，在基因水平上进行数据处理，生成 CHP 文件。</li>
	<li>在 Expression Console 中确认数据质量后，将包含每个探针 log2 表达信号的 CHP 文件导入转录组分析软件，采用单因素被试间方差分析方法分析细胞类型特异性的转录响应。</li>
</ol>
8. 评估 SD-NHKc 的集落形成效率
<ol>
	<li>当细胞融合度达到70-80%时，吸去培养板中的培养基。用预冷的PBS（4 °C）洗涤细胞三次，每次5分钟。</li>
	<li>加入3 mL 100%甲醇（4 °C）固定细胞15分钟。再用PBS洗涤三次，每次5分钟。</li>
	<li>加入3 mL 10%吉姆萨染液染色30分钟。用PBS洗涤三次，每次5分钟。将细胞置于室温下避光晾干过夜。</li>
	<li>次日观察集落形成情况，并统计获得的集落数量。</li>
</ol>
9. 确定 SD-NHKc 群体倍增次数
<ol>
	<li>通过吸除旧培养基，并用 2 mL PBS 洗涤细胞，对 SD-NHKc 及相应的自体 2D 单层培养物进行传代。去除 PBS 后，向洗涤后的细胞中加入 2 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA。孵育 5 分钟，或直至所有细胞完全脱落（37 °C，5% CO2，95% 湿度）。</li>
	<li>向培养皿中加入 2 mL 大豆胰蛋白酶抑制剂，将细胞转移至 15 mL 离心管中。</li>
	<li>以 250 x g 离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀重悬于 12 mL KSFM-scm 中。</li>
	<li>以低密度（1–2 × 104 NHKc）将细胞接种至各自的 10 cm 培养皿中，并过夜孵育（37 °C，5% CO2，95% 湿度）。</li>
	<li>次日每皿加入 8 mL KSMF-scm 进行换液。每 4 天换液一次，直至细胞融合度至少达到 25%，之后改为每 2 天换液一次。</li>
	<li>在 60 cm 培养皿中以 1:5 比例连续传代，直至细胞增殖能力耗尽。通过台盼蓝染色定量细胞活力。使用公式 log(N/N0) / log2 计算每次传代的群体倍增数，其中 N 表示每次传代获得的总细胞数，N0 表示实验开始时接种的细胞数。</li>
</ol>

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</ol>

作者没有需要披露的财务关系。

三维球状体培养系统在评估细胞干性方面具有广泛应用。这些系统已被证明可增强组织干细胞的富集13，但其在人类表皮干细胞研究中的应用尚鲜有报道。本文中，我们描述了一种利用三维培养技术富集人类角质形成细胞干细胞的策略。在该系统中，正常人角质形成细胞（NHKc）以自组装的多细胞球状体悬浮形式进行培养，由多种角质形成细胞亚型组成，并悬浮于含有KSFM-scm的琼脂糖基质上方。该实验方案的建立对时间较为敏感，因为琼脂在室温下会迅速聚合。将血清移液管、微量移液器吸头、琼脂/细胞混合管以及培养基预热至42 °C，可显著减少过早聚合的发生。我们观察到，在将琼脂/培养基混合物加入孔板后，立即将96孔板置于4 °C环境中，可显著加快聚合速度，并确保琼脂垫充分固化，以便后续接种细胞。在整个聚合过程中，必须始终保持孔板水平，因为琼脂/培养基混合物聚合不良会导致细胞在软琼脂内部接种或生长，从而使实验失效。
本方案还介绍了一种在二维单层培养条件下扩增表皮球体以获得类干细胞的球体来源细胞的策略。表皮球体重铺板实验能够富集出一类具有整合素α6hi/...

哺乳动物的复层上皮是所有生命系统中最复杂的上皮结构，最常受到损伤和伤害。作为一种保护性组织，复层上皮在进化过程中形成了复杂而有效的组织损伤应答机制。在受到损伤时，这些细胞必须激活谱系可塑性程序，使其能够迁移到损伤部位并执行修复功能1,2,3。这一多层面的应答过程包含多个连续的步骤，目前仍了解甚少。
研究上皮再生这一复杂过程的主要障碍在于缺乏能够捕获细胞再生特定阶段动态细胞活动的高通量模型系统。尽管体内小鼠模型可为伤口愈合提供相关见解，并最接近地模拟人类再生过程，但其构建需要大量人力投入和高昂成本，限制了其通量能力。因此，迫切需要建立能够在高通量规模下实现人类上皮组织再生功能研究的系统。
近年来，人们已做出多项尝试以应对可扩展性挑战，这体现在创新的体外&#160;和离体细胞模型的迅速发展上，这些模型能够高度模拟体内再生环境。其中包括器官芯片4、球状体5、类器官6以及组织型培养系统7等方面的进展。这些基于三维细胞的体系各自具有独特的优势，同时也存在不同的实验局限性。迄今为止，球状体培养仍是成本效益最高且应用最广泛的三维细胞培养模型。尽管已有若干研究报告表明球状体培养可用于研究皮肤干细胞特性，但这些研究大多使用动物组织8,9或真皮成纤维细胞10进行，几乎未见对人表皮球状体培养再生特性的系统性表征。在本实验方案中，我们详细描述了由正常人角质形成细胞（NHKc）建立的表皮球状体培养体系的功能性构建、培养与维持方法。同时，我们也阐述了该体系在体外模拟表皮再生各阶段过程以及角质形成细胞干细胞可塑性的应用价值。

<table><tbody><tr><td>Affymetrix 平台</td><td>Affymetrix</td><td></td><td>用于微阵列实验</td></tr><tr><td>Affymetrix&amp;rsquo;s HuGene-2_0-st 文库文件</td><td>Affymetrix</td><td></td><td>处理</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td>用于微阵列实验</td></tr><tr><td>All Prep DNA/RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td>用于 RNA 提取</td></tr><tr><td>Analysis Console 软件版本 3.0.0.466</td><td></td><td></td><td>使用单因素被试间方差分析分析细胞类型特异性转录响应</td></tr><tr><td>BD FACSAria II 流式细胞仪</td><td>Beckman</td><td></td><td>用于流式细胞术</td></tr><tr><td>Console 软件版本 3.0.0.466/Expression Console 软件</td><td>Affymetrix/Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>用于确认数据质量</td></tr><tr><td>细胞角蛋白 14</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53253</td><td>1:200 稀释</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4818</td><td>用于细胞培养基</td></tr><tr><td>FITC 标记的抗整合素&amp;alpha;6 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab30496</td><td>用于 FACS 分析</td></tr><tr><td>GeneChip Command Console 4.0 软件</td><td>Affymetrix/Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>用于确认数据质量</td></tr><tr><td>GeneChip Fluidics Station 450（Affymetrix/Thermo Fisher Scientific）</td><td>Affymetrix/Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>用于杂交阵列的洗涤和染色</td></tr><tr><td>GeneChip HuGene 2.0 ST 阵列</td><td>Affymetrix/Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>用于总 RNA 的杂交和扩增</td></tr><tr><td>GeneChip 杂交炉 640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>用于总 RNA 的杂交和扩增 | 扩增标记的样本</td></tr><tr><td>GeneChip 杂交、洗涤和染色试剂盒（Affymetrix/Thermo Fisher Scientific）</td><td>Affymetrix/Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>用于杂交阵列的洗涤和染色</td></tr><tr><td>GeneChip Scanner 3000 7G 系统</td><td>Affymetrix/Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>扫描杂交阵列</td></tr><tr><td>GeneChip WT PLUS 试剂盒</td><td>Affymetrix/Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>用于生物素化总 RNA 的扩增</td></tr><tr><td>人碱性成纤维细胞生长因子（hFGF basic/FGF2）</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>8910</td><td>用于细胞培养基</td></tr><tr><td>人表皮生长因子（hEGF）</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>8916</td><td>用于细胞培养基</td></tr><tr><td>人胰岛素</td><td>Millipore Sigma</td><td>9011-M</td><td>用于细胞培养基</td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Supermix（Bio-Rad）</td><td>Bio-Rad</td><td>1708880</td><td>用于 RT-qPCR</td></tr><tr><td>iScript cDNA 合成试剂盒</td><td>Bio-Rad</td><td>1708890</td><td>用于 RT-qPCR</td></tr><tr><td>KSFM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17005041</td><td>添加 1% 青霉素/链霉素、20 ng/ml EGF、10 ng/ml&lt;br/&gt; 碱性成纤维细胞生长因子、0.4% 牛血清白蛋白（BSA）和 4 &amp;micro;g/ml 胰岛素</td></tr><tr><td>KSFM-scm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17005042</td><td>添加 1% 青霉素/链霉素、20 ng/ml EGF、10 ng/ml&lt;br/&gt; 碱性成纤维细胞生长因子、0.4% 牛血清白蛋白（BSA）和 4 &amp;micro;g/ml 胰岛素</td></tr><tr><td>MCDB 153-LB 基础培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7403</td><td>含 HEPES 缓冲液的 MCDB 153-LB 基础培养基</td></tr><tr><td>NEST Scientific 1 孔细胞培养腔载玻片，黑色壁玻璃载玻片，6/包，12/箱</td><td>Stellar Scientific</td><td>NST230111</td><td>用于免疫染色</td></tr><tr><td>P63</td><td>Thermo Scientific</td><td>703809</td><td>1:200 稀释</td></tr><tr><td>PE 标记的抗 EGFR 抗体（San Jose, CA；货号）</td><td>BD Pharmingen</td><td>555997</td><td>用于 FACS 分析</td></tr><tr><td>pMSCV-IRES-EGFP 质粒载体</td><td>Addgene</td><td>20672</td><td>用于转染</td></tr><tr><td>Promega TransFast 试剂盒</td><td>Promega</td><td>E2431</td><td>用于转染</td></tr><tr><td>Qiagen RNeasy Plus Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td></td><td>用于微阵列实验</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;trade; 无菌一次性真空过滤装置</td><td>Thermo Scientific</td><td>09-740-63D</td><td>用于细胞培养基</td></tr><tr><td>Zeiss Axionvert 135 荧光显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td>与 Axiovision Rel. 4.5 软件配合使用</td></tr></tbody></table>

建立高通量表皮球体培养系统以模拟角质形成细胞干细胞可塑性

Establishing a High Throughput Epidermal Spheroid Culture System to Model Keratinocyte Stem Cell Plasticity

上皮功能紊乱是多种人类疾病和病症的关键环节，包括慢性伤口、炎症以及超过80%的人类癌症。作为覆盖组织，皮肤上皮经常遭受损伤，并在进化过程中通过获得必要的细胞可塑性来修复受损组织。多年来，研究人员已尝试利用体外（in&#160;vitro）和离体（ex vivo）细胞模型研究上皮可塑性。然而，这些方法在模拟上皮细胞可塑性的各个阶段方面存在局限性。本文介绍一种从原代新生儿人角质形成细胞生成三维表皮球体及其衍生细胞的实验方案。该方案阐明了表皮球体培养体系在功能上模拟角质形成细胞不同发育可塑性阶段的能力，并证明通过表皮球体重铺板可富集具有增强干样特性的整合素α6hi/EGFRlo角质形成细胞亚群，从而提高正常人角质形成细胞（NHKc）培养物的异质性。本研究报告了一种高通量系统的建立与维持方法，用于研究皮肤角质形成细胞的可塑性及表皮再生过程。

在皮肤表皮球体实验中，将正常人角质形成细胞（NHKc）培养物接种于涂有琼脂糖的96孔板孔中（图1A）。球体形成细胞应在48小时内自发聚集。可早在24小时时使用标准倒置相差显微镜评估其自主形成球体的能力。皮肤表皮球体的形成及再接种实验可模拟表皮组织再生的多个阶段（图1B）。图2展示了在三维培养条件下检测多种NHKc品系表皮球体形成能力的高分辨率图像。应仔细观察细胞是否形成致密的球形聚集体，因为这是自发形成球体的典型特征。我们发现，使用超过2 × 104个细胞对于确保充分的自发聚集至关重要。非球形的细胞聚集（如图2A所示品系中所见）不被视为有效的表皮球体形成。将不能形成球体的细胞悬液重新接种至二维单层培养体系中，通常难以获得可存活的NHKc细胞生长。然而，将表皮球体接种至二维培养体系中，则可促进小体积的、具有活性的NHKc细胞增殖（图3</s...

本文介绍了一种在三维悬浮培养体系中系统培养表皮球体的实验方案。该方案可广泛应用于多种上皮组织类型，并可用于多种人类疾病和病理状态的建模研究。

上皮功能紊乱是多种人类疾病和病症的关键环节，包括慢性伤口、炎症以及超过80%的人类...

本方案介绍了一种用于表皮球体培养物的培养与维持的创新方法，以及利用球体重铺板实验对其进行深入研究的策略。首先，按照文本稿件中的描述配制洗涤培养基。在超净工作台中，将新生儿包皮组织置于5毫升锥形管中，用5毫升洗涤培养基清洗两次，然后将清洗后的包皮组织转移至无菌培养皿中。使用手术刀和镊子从真皮层刮除脂肪组织和疏松结缔组织，然后用洗涤液重新清洗包皮。将包皮表皮面朝上置于六孔板中，孔内含两毫升用洗涤液稀释的Dispase酶。将六孔板转移至培养箱中孵育四小时。孵育后，将包皮转移至培养皿中，使用尖头镊子将表皮层与真皮层分离。将表皮放入含有2毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA的15毫升锥形管中。用5毫升移液管碾压悬浮的表皮组织，并在37°C孵育15分钟，每隔5分钟短暂涡旋振荡5秒。孵育后，加入2毫升大豆胰蛋白酶抑制剂，用移液器吹打混匀以中和胰蛋白酶，然后离心细胞悬液。将沉淀重悬于12毫升完全KSFM-SCM培养基中，将细胞接种至10厘米培养皿中，在37°C和5%二氧化碳条件下孵育过夜。次日，用抽吸移液器移除培养基，并更换为12毫升完全KSFM-SCM培养基。在第四天和第七天重复此操作。在100毫升玻璃瓶中，将2.5克琼脂糖加入50毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制5%琼脂糖混合液。将玻璃瓶放入高压灭菌器中进行液体循环灭菌，然后冷却至室温。制备平板时，将含有琼脂糖溶液的冷却玻璃瓶放入一个装有200毫升去离子水的1升烧杯中。在科研级微波炉中加热最多两分钟以熔化琼脂糖混合物，每隔60秒轻轻倾斜瓶子左右摇晃一次以混匀。取3毫升熔化的5%琼脂糖加入12毫升预热至42摄氏度的KSFM-SCM中，最终获得1%琼脂糖的终浓度。使用多通道移液器向96孔板的每个孔中加入200微升1%琼脂混合液。然后将板置于25摄氏度的无菌环境中静置4小时。通过抽吸培养基并用2毫升PBS洗涤细胞，传代培养球体形成的正常人角质形成细胞。吸去 PBS，向洗涤后的细胞中加入 2 毫升 0.25% 胰蛋白酶-EDTA。然后在 37 摄氏度下孵育 5 分钟。孵育结束后，向培养板中加入 2 毫升大豆胰蛋白酶抑制剂，并将细胞从培养板上冲洗至 15 毫升离心管中。以250 ×g离心5分钟。用1毫升PBS重悬细胞沉淀，并使用台盼蓝染色法对细胞进行计数。取20,000个正常人角质形成细胞，加入100微升KSFM-SCM培养基，接种至预先准备好的96孔板的每个孔中。然后将培养板在室温下孵育过夜。使用倒置相差显微镜，观察接种孔中表皮球体的形成情况。在三维表皮球体形成后24至48小时，向六厘米培养皿中加入4毫升预热至37摄氏度的KSFM-SCM培养基。使用宽口1毫升移液器吸头将单个球状体转移至培养板中，并将培养板过夜培养。使用倒置相差显微镜分析接种后的球状体是否有细胞贴壁或增殖。每96小时更换一次培养基，方法是移除旧培养基并向培养板中加入2毫升新鲜KSFM-SCM培养基。以先前所述方法传代70%至80%融合度的类球体来源的正常人角质形成细胞及二维单层培养细胞。随后使用台盼蓝染色和自动细胞计数仪定量细胞活力。将含有10万至400万个正常人角质形成细胞的100微升细胞悬液分装至1.5毫升微量离心管中。将试管置于暗处的冰上，关闭超净台内的强光。向每支试管中加入2 µL FITC标记的整合素α6抗体和2 µL PE标记的EGFR抗体，使稀释比例为1:50。另准备一支不加抗体的试管，作为未染色对照。将试管置于冰上避光孵育30分钟。使用适当的激光进行流式细胞术分析。利用阴性对照和阳性对照设置圈门。分选表皮干细胞组分、增殖性前体细胞组分以及定向分化前体细胞组分。通过将每根分选管中的细胞转移至含有 PBS 缓冲液的 15 毫升锥形管中（PBS 体积为分选细胞体积的 10 倍），检测分选后各细胞亚群的增殖能力。以 250 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，将沉淀物重悬于4毫升KSFM-SCM中。将重悬的细胞转移至6厘米培养皿中，在37°C、5%二氧化碳、95%湿度的培养箱中过夜培养。次日，从培养皿中移除培养基，并每隔三天加入4毫升预热至37°C的KSFM-SCM，直至细胞融合度达到70%至80%。通过皮肤表皮球体检测法评估正常人角质形成细胞在三维培养中自主形成表皮球体的能力。非球形的细胞聚集不被视为充分的表皮球体形成。致密的球形聚集被认为是自发球体形成的标志。需要使用超过两万的细胞数量，以确保充分的自发聚集。将表皮球体接种于二维培养体系中，可促进少量具有活性的正常人角质形成细胞增殖。维持这些细胞培养物的融合度低于100%至关重要，因为过高的融合度会显著影响其生长能力及体外培养中的干细胞状态。通过转染带有荧光报告基因的细胞，在单细胞水平上对表皮球体形成过程进行了功能性追踪。球体来源的正常人角质形成细胞亚群为整合素α6高表达、EGF低表达的细胞。这类细胞通常约占培养细胞总数的25%。通过检测基底型角蛋白14和肿瘤蛋白63的免疫染色分析，实现了对该类干细胞样角质形成细胞亚群的表征。类球体再接种实验是从新生儿人皮肤中富集表皮干细胞的有效策略。该系统可作为高通量的细胞模型，用于研究皮肤疾病，如伤口愈合和癌症。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

建立高通量表皮球体培养系统，以模拟角膜细胞干细胞可塑性

介绍了一种从人皮肤中快速、高效分离活体成年上皮干细胞的方法。该方法利用酶消化皮肤胶原基质，随后拔取毛囊，并分离单细胞悬液或组织碎片用于细胞培养。...

从成人皮肤中分离和培养表皮干细胞

本论文提供了从拔取的毛发中分离和培养人角质形成细胞，并通过附加体型载体进一步生成无整合的人诱导性多能干细胞（hiPSCs）的逐步操作流程。...

利用毛发来源的角质形成细胞生成无整合的人诱导性多能干细胞

本文的目的是提供一种全面且详细的方案，介绍如何利用表皮角质形成细胞和去活性的人类真皮生成基因修饰的人类类器官皮肤。...

利用去细胞化人真皮生成基因修饰的类器官皮肤培养物

人类皮肤作为抵御外部环境的第一道防线。本文介绍一种从成人皮肤中分离原代人角质形成细胞的方法。这些分离得到的角质形成细胞可用于多种实验体系，是研究皮肤生物学中分子机制的理想模型。 体外.

成年皮肤来源人原代角质形成细胞的分离与培养

在此，我们介绍一种用于构建三维类器官黑色素瘤球体皮肤模型的方案，该模型可重现器官/肿瘤的结构特征和多细胞复杂性 体内...

一种三维类器官黑色素瘤球体皮肤模型

本文介绍一种从成人皮肤组织中高效分离原代人角质形成细胞的方案。该方法通过在接种培养基中使用ROCK抑制剂Y-27632，使表皮细胞与真皮细胞自发分离，从而简化了传统操作步骤。...

一种简化且高效的人类原代角质形成细胞从成人皮肤组织中的分离方法

本实验方案的目的是从成年小鼠背部皮肤中分离表皮角质形成细胞，用于多种后续应用，如分子生物学、生物化学、荧光激活细胞分选以及原代体外培养（例如，克隆形成性角质形成细胞）。...

小鼠表皮角质形成细胞的分离及其体外克隆培养

本方案描述了一种简便的方法，可重复且稳定地培养三维重建人表皮。此外，还对表皮屏障模型的结构-功能关系进行了表征。同时展示了重建人表皮在受到促炎刺激后的生物学反应。...

大规模培养三维重建人表皮

本方案概述了用于活细胞成像的新鲜获取（第0代）角质形成细胞的培养方法。...

生成用于角质形成细胞活细胞成像的原代培养

本文提供了一种活细胞成像分析方法，可用于手动追踪第0代角质形成细胞的谱系，并能够收集增殖相关指标，包括细胞分裂命运和细胞周期持续时间。...

活细胞成像结合延时摄影研究表皮角质形成细胞增殖动力学

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利用气液界面培养系统生成人诱导性多能干细胞来源的含毛囊平面皮肤类器官

了解高通量表皮球体培养系统的建立方法，使用Dispase酶分离新生儿包皮组织，通过三维悬浮培养模拟角膜细胞干细胞可塑性。该技术为研究上皮组织疾病和再生医学提供了可靠的细胞模型。

建立高通量表皮球体培养系统以模拟角质形成细胞干细胞可塑性

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