创建禽类前脑嵌合体以评估面部发育
2021年2月18日
本文介绍了一种设计用于检测基底前脑信号传导与模式形成特性的组织移植技术。 在颅面发育过程中。
该方法可使研究人员评估基底前脑与面部之间的组织相互作用。此技术的主要优势在于能够分离基底前脑以进行分析，同时避免神经嵴细胞的污染，从而防止对分析结果造成干扰。该技术的难点在于将前脑从宿主中移除，并用供体组织进行替换。
演示该实验步骤的是来自拉尔夫·马尔库乔博士实验室的研究科学家Diane Hu。首先，准备含有中性红的DMEM培养基、玻璃转移移液管以及 sharpened tungsten。使用10毫升注射器和18号针头，从蛋壳的尖端一端吸取0.5毫升的白蛋白。
使用剪刀尖在卵壳顶部开一个小孔。然后在孔上贴一片胶带，剪出一个圆形开口以暴露胚胎。用中性红对胚胎进行染色。
从7或8期胚胎的前脑基底部左侧获取组织移植物。使用弯曲的 sharpened 钨针轻轻切取一块前脑组织。为避免包含下方的内胚层，应将针尖滑入前脑下方，并与神经管轴线平行推进。
使用玻璃转移移液管从供体胚胎中拾取移植物，并将其转移到含有中性红的DMEM中染色两分钟。然后将染色后的移植物置于不含中性红的DMEM中，直至准备进行移植。将白来航鸡的受精卵置于37摄氏度的湿润培养箱中孵育，直至达到Hamburger-Hamilton 7至8期。
按照先前已展示的方法暴露胚胎。使用锋利的钨针，通过切割并移除一块0.3 × 0.2 毫米的前脑基底部组织，以制备移植部位，为移植材料留出空间。应避免过度损伤下方的内胚层，否则会出现卵黄颗粒从任何撕裂处渗出的现象。
将移植物移植到宿主后，将其定位以替代宿主被切除的前脑基底部。用胶带紧密封住孔口，并将胚胎放回37°C培养箱中，直至准备进行分析。最初，通过将鹌鹑组织移植到鸡胚胎中来构建嵌合体。
使用QCPN抗体，可对鹌鹑细胞进行可视化并将其与宿主组织区分开来。鹌鹑-鸡嵌合系统证实，所有移植物仅由神经组织构成，未受到其他细胞类型的污染。将鹌鹑组织移植到鸭胚胎中会导致严重畸形的嵌合体，原因是鹌鹑脑发育速度较快。
因此，将鸭的组织移植到鸡胚胎中。所获得的鸭-鸡嵌合体表明，大脑参与了形态的调控。采用全 mount C2 杂交方法检测嵌合体中Sonic hedgehog的表达。
与形态学类似，嵌合体鸭侧的Sonic hedgehog表达也呈现更接近鸭子的特征。准备宿主位点需要练习。大量胚胎无法存活，因此制备大量嵌合体有助于确保获得足够的分析样本。
该方法使得评估来自大脑的信号如何调控额鼻外胚层区域中Sonic hedgehog表达域成为可能。
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概述
本文介绍了一种组织移植技术，可使研究人员在颅面发育过程中评估前脑基底部与面部之间的组织相互作用。该方法能够分离前脑基底部以供分析，避免神经嵴细胞的污染。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 颅面发育
- 组织移植技术
背景
- 基底前脑在颅面发育过程中起着关键作用。
- 理解组织间的相互作用对于发育生物学至关重要。
- 神经嵴细胞的污染可能会干扰分析结果。
- 分离基底前脑有助于更清晰地评估其信号特性。
研究目的
- 检测基底前脑的信号传导和模式形成特性。
- 建立一种可靠的组织移植方法。
- 增进对颅面发育机制的理解。
使用的方法
- 制备含中性红的DMEM培养基。
- 使用玻璃转移移液管和 sharpened tungsten。
- 使用注射器从蛋壳尖端去除白蛋白。
- 用供体组织替换宿主前脑。
主要结果
- 该技术可有效分离基底前脑以进行分析。
- 由科研人员演示该操作流程。
- 成功评估组织相互作用且无污染。
- 深入揭示基底前脑在颅面发育中的作用。
结论
- 移植技术是研究颅面发育的有力工具。
- 分离前脑基底部可提高发育评估的准确性。
- 该方法可应用于发育神经科学的进一步研究。
常见问题
行业重要性概述
该方法通过分离基底前脑以排除神经嵴的干扰性贡献，从而实现对颅面发育过程中组织信号的精确评估。该方法通过阐明脑源性信号如何调控前鼻外胚层区域中的音猬因子（Sonic hedgehog）等形态发生通路，在靶点验证中的机制性风险排除方面提供支持。该技术为评估发育通路提供了一个与疾病相关的系统，可在早期发现阶段实现具有预测可信度的评价。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：探究脊椎动物发育过程中脑与面部组织相互作用的治疗假设。
- 操作价值：通过分离前脑基底部信号特性，实现功能靶点的验证。
- 预测价值：通过将前脑基底部操控与SHH表达区域的变化相联系，提升预测可信度。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：制备经过验证的嵌合系统，用于形态发生素表达的定量评估。
- 操作价值：标准化组织移植流程，确保在不同实验条件下检测结果的可重复性。
- 可扩展性：便于生成多个嵌合体，以克服存活率低的问题，并保证分析的稳健性。
转化与临床前研究
- 转化连续性：将发现阶段的机制性见解与颅面模式形成的临床前模型相联系。
- 机制性风险降低：阐明SHH的上游调控因子，SHH是先天性疾病建模中的关键通路。
- 疾病相关系统：利用禽类嵌合体研究保守的脊椎动物面部发育机制。
流程与工作流整合
该方法适用于早期发现阶段的工作流程，在此阶段，组织相互作用实验可为先导化合物筛选前的靶点确信度提供依据。
- 发现生物学：支持对颅面形态发生中信号中心的假设验证。
- 检测就绪性：建立标准化的生物系统，用于定量分析SHH表达。
- 分析技术：实现整体原位杂交，以测量空间基因表达变化作为关键读出指标。
- 转化研究：提供从神经组织移植到面部表型结果的机制连续性。
- 企业级复用：建立可重复使用的平台，用于评估组织特异性对发育通路的贡献。
运营与企业影响
- 科学价值：通过分离基底前脑信号，减少面部发育机制研究中的不确定性。
- 操作价值：采用标准化的移植与宿主制备技术，确保实验可重复性。
- 战略价值：通过明确可靶向通路（如SHH）的上游调控因子，优化“推进/终止”决策。
- 项目组合影响：基于已验证的组织互作数据，实现对靶点的风险校正优先排序。
实施注意事项
- 需要具备显微外科组织操作和鸟类胚胎操作的专业技术。
- 依赖于特殊工具，包括 sharpened tungsten needles 和玻璃转移移液管。
- 需要对宿主和供体胚胎采用标准化的孵化与发育分期方案。
- 涉及移植物位点制备的优化，以防止卵黄泄漏并确保宿主存活。
- 受限于较低的胚胎存活率，为获得可靠的分析结果需使用大量样本。
