Name: 创建鸟类前脑嵌合体以评估面部发育 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 10 s
Description: 学习鸟类前脑嵌合体技术以评估颅面发育中的组织相互作用。该方法通过分离基底前脑并防止神经嵴细胞污染，为发育神经科学研究提供了可靠的组织移植工具。

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本研究的资助来自美国国立卫生研究院下属的国立牙科与颅面研究所，项目编号为 R01DE019648、R01DE018234 和 R01DE019638。

将北京鸭（Anas platyrhynchos）、白来航鸡（Gallus gallus）和日本鹌鹑（Coturnix coturnix japonica）置于37 °C的加湿培养箱中孵育，直至发育至HH7/8期17。
1. 准备受体组织
注意：试剂和工具的准备以及如何打开鸡蛋以进行实验操作已在文献中描述6。
<ol>
	<li>准备含有中性红的DMEM培养基、玻璃转移移液管和锋利的钨针。</li>
	<li>暴露胚胎（如文献6所示）。</li>
	<li>从7/8期胚胎前脑基底部的左侧获取组织移植物。使用弯曲的锋利钨针6，轻轻切取一块大小约为0.3 mm长、0.2 mm宽的前脑组织；操作时需将钨针插入前脑下方，使其与神经管轴线平行，以确保不包含深层的内胚层。</li>
	<li>使用玻璃转移移液管从供体胚胎中拾取移植物。</li>
	<li>将移植物转移至含有中性红（0.01% PBS溶液，23 °C）的DMEM中染色2分钟，随后将其放入不含中性红的DMEM中，待移植时使用。</li>
</ol>
2. 准备受体
<ol>
	<li>将白来航鸡（Gallus gallus）的受精卵置于37 °C的湿润培养箱中孵育，直至发育至HH7/8阶段17。</li>
	<li>暴露胚胎（如文献6所示）。</li>
	<li>使用 sharpened tungsten needles，通过轻柔切割并移除左侧前脑基底部一块0.3 mm × 0.2 mm的组织，以制备移植物植入位点，操作方式与分离供体组织时相同。</li>
	<li>注意避免过度损伤下方的内胚层，否则卵黄颗粒会从破损处渗出。该操作需要练习，且并非每次尝试都能成功。</li>
	<li>将移植物转移至宿主后6，将其定位以替代宿主被切除的前脑基底部组织。</li>
	<li>用胶带紧密封住开口，并将胚胎放回37 °C培养箱中，孵育适当时间后进行分析。</li>
</ol>

<ol><li>Waddington, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+Mechanics+of+Chicken+and+Duck+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developmental Mechanics of Chicken and Duck Embryos.</a> Nature. 125, 924-925 (1930).</li>
<li>Noden, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+neural+crest+in+patterning+of+avian+cranial+skeletal%2C+connective%2C+and+muscle+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The role of the neural crest in patterning of avian cranial skeletal, connective, and muscle tissues.</a> Developmental Biology. 96 (1), 144-165 (1983).</li>
<li>Borue, X., Noden, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+and+aberrant+craniofacial+myogenesis+by+grafted+trunk+somitic+and+segmental+plate+mesoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Normal and aberrant craniofacial myogenesis by grafted trunk somitic and segmental plate mesoderm.</a> Development. 131 (16), 3967-3980 (2004).</li>
<li>Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quail-chick+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quail-chick chimeras.</a> Methods in Molecular Biology. 461, 337-350 (2008).</li>
<li>Hu, D., Marcucio, R. S., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zone+of+frontonasal+ectoderm+regulates+patterning+and+growth+in+the+face%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A zone of frontonasal ectoderm regulates patterning and growth in the face.</a> Development. 130 (9), 1749-1758 (2003).</li>
<li>Hu, D., Marcucio, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+signaling+properties+of+ectodermal+epithelia+during+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Assessing signaling properties of ectodermal epithelia during craniofacial development.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).</li>
<li>Hu, D., Marcucio, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+organization+of+the+frontonasal+ectodermal+zone+in+birds+and+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Unique organization of the frontonasal ectodermal zone in birds and mammals.</a> Developmental Biology. 325 (1), 200-210 (2009).</li>
<li>Griffin, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf8+dosage+determines+midfacial+integration+and+polarity+within+the+nasal+and+optic+capsules%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Fgf8 dosage determines midfacial integration and polarity within the nasal and optic capsules.</a> Developmental Biology. 374 (1), 185-197 (2013).</li>
<li>Schneider, R. A., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+and+molecular+origins+of+beak+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The cellular and molecular origins of beak morphology.</a> Science. 299 (5606), 565-568 (2003).</li>
<li>Tucker, A. S., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+cells+provide+species-specific+patterning+information+in+the+developing+branchial+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Neural crest cells provide species-specific patterning information in the developing branchial skeleton.</a> Evolution & Development. 6 (1), 32-40 (2004).</li>
<li>Fish, J. L., Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+species-specific+contributions+to+craniofacial+development+using+quail-duck+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Assessing species-specific contributions to craniofacial development using quail-duck chimeras.</a> Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).</li>
<li>Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+and+the+origin+of+species-specific+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Neural crest and the origin of species-specific pattern.</a> Genesis. 56 (6-7), 23219(2018).</li>
<li>Sohal, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+reciprocal+forebrain+transplantation+on+motility+and+hatching+in+chick+and+duck+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of reciprocal forebrain transplantation on motility and hatching in chick and duck embryos.</a> Brain Research. 113 (1), 35-43 (1976).</li>
<li>Chen, C. C., Balaban, E., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+avian+brain+chimeras+reveal+that+large+brain+size+differences+are+influenced+by+cell-interdependent+processes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Interspecies avian brain chimeras reveal that large brain size differences are influenced by cell-interdependent processes.</a> PLoS One. 7 (7), 42477(2012).</li>
<li>Hu, D., Marcucio, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+cells+pattern+the+surface+cephalic+ectoderm+during+FEZ+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Neural crest cells pattern the surface cephalic ectoderm during FEZ formation.</a> Developmental Dynamics. 241 (4), 732-740 (2012).</li>
<li>Hu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signals+from+the+brain+induce+variation+in+avian+facial+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Signals from the brain induce variation in avian facial shape.</a> Developmental Dynamics. 244 (9), 1133-1143 (2015).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li>
<li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlations+Between+the+Morphology+of+Sonic+Hedgehog+Expression+Domains+and+Embryonic+Craniofacial+Shape%5BTitle%5D)+AND+%22Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Correlations Between the Morphology of Sonic Hedgehog Expression Domains and Embryonic Craniofacial Shape.</a> Evolutionary Biology. 42 (3), 379-386 (2015).</li>
<li>Eames, B. F., Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genesis+of+cartilage+size+and+shape+during+development+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The genesis of cartilage size and shape during development and evolution.</a> Development. 135 (23), 3947-3958 (2008).</li>
<li>Merrill, A. E., Eames, B. F., Weston, S. J., Heath, T., Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchyme-dependent+BMP+signaling+directs+the+timing+of+mandibular+osteogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mesenchyme-dependent BMP signaling directs the timing of mandibular osteogenesis.</a> Development. 135 (7), 1223-1234 (2008).</li>
</ol>

所有作者均无披露事项。

本方法可用于研究基底前脑与邻近外胚层之间的组织相互作用。该方法与以往的前脑移植技术不同，因为供体组织仅限于前脑腹侧区域，从而避免了神经嵴细胞的移植；已知神经嵴细胞参与面部形态的模式形成9,10。因此，将移植物限定在基底前脑对于评估预定的实验结果至关重要。
在先前采用前脑移植的研究中13,14，额外的非神经组织并未干扰对预设结局指标的解释，因为这些结局指标要么是行为学方面的，要么专门用于检测宿主与供体环境对整体脑发育的影响。在设计使用这些胚胎学方法的实验时，这一点是一个重要的考虑因素，必须在可行性与严谨性之间取得平衡。例如，排除预定神经嵴细胞的要求带来了显著的技术困难。移植必须在神经胚早期的胚胎上进行。在此阶段，内胚层紧邻移植部位，因此必须格外小心以避免损伤内胚层，因为这会降低胚胎存活率。尽管尚不明确内胚层污染移植物是否会影响我们的结局指标，但本研究的...

目前，发育生物学的许多研究重点集中在基因在胚胎形态形成过程中的作用。从遗传学角度研究发育机制已有较为完善的工具。然而，胚胎的构建及其形态发生是组织间相互作用的结果。鸟类系统是一种经典的工具，可用于评估调控发育过程中的多种组织相互作用，原因如下：其胚胎发育过程已被充分阐明，胚胎易于获取，针对鸟类系统的研究工具已相当成熟，且胚胎成本低廉。
近一个世纪以来，禽类移植系统已被广泛用于谱系示踪以及发育过程中组织相互作用的研究1,2,3,4。该系统曾被用于研究调控上颌形态发生的信号中心——前鼻外胚层区（Frontonasal Ectodermal Zone, FEZ）5，此前已有视频发表描述该技术6。除了鹌鹑-鸡嵌合系统外，其他物种也被用于构建嵌合体以分析组织间的相互作用。例如，小鼠的FEZ已从野生型7和突变型小鼠8中移植获得，此外还有研究利用鸭、鹌鹑和鸡系统来评估神经嵴在面部骨骼模式形成中的作用9,10,11,12。
本研究通过在鹌鹑、鸭和鸡胚胎之间相互移植前脑，评估前脑在调控额鼻外胚层（FEZ）基因表达模式中的作用，因为前脑来源的信号是诱导FEZ中Sonic hedgehog表达所必需的。前脑移植在该领域并非首次应用。此前已有研究利用此类移植来评估鹌鹑和鸭胚胎运动功能的发育13，但在那些实验中，同时移植了可形成非神经组织的细胞。在其他研究中，通过前脑移植评估了鸟类的听觉环路14，但这些移植物中包含了神经嵴前体细胞，而神经嵴细胞会影响面部形态9,10，并参与调控FEZ中的SHH表达15。因此，研究人员建立了一种在神经管闭合之前将一种鸟类的腹侧前脑移植到另一种鸟类中的体系，以专门评估大脑在面部形态形成中的作用16（图1A、B）。该方法避免了移植物中神经嵴细胞的污染。本文将图示该技术的操作流程，描述预期结果，并讨论实际操作中可能遇到的挑战。

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>TEK</td><td>TEKZR114</td><td></td></tr><tr><td>35x10 mm 培养皿</td><td>Falcon</td><td>1008</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermofisher</td><td>11965084</td><td></td></tr><tr><td>持针器</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>中性红</td><td>Sigma</td><td>553-24-2</td><td></td></tr><tr><td>5 号杜蒙特镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>Thermofisher</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>QCPN 抗体</td><td>发育研究杂交瘤库，爱荷华大学，爱荷华州，美国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>钨针</td><td>Fine Science Tools</td><td>26000</td><td></td></tr></tbody></table>

创建禽类前脑嵌合体以评估面部发育

Creating Avian Forebrain Chimeras to Assess Facial Development

鸟类胚胎作为模式系统已被使用了一个多世纪，促进了对脊椎动物发育的基本理解。该模式系统的一个优势在于，可以在嵌合胚胎中直接评估组织之间的效应及其相互作用。我们先前已证明，前脑发出的信号通过调控前鼻外胚层区（FEZ）中音猬因子（SHH）表达区域的形态，参与面部形态发生。本文描述了构建前脑嵌合体的方法，并展示了这些实验结果的图示。

嵌合体评估与移植物污染检测 
为了评估嵌合体，需明确嵌合程度以及移植物是否被其他细胞类型污染。通过将鹌鹑组织移植到鸡胚中可构建此类嵌合体，从而进行该分析。利用QCPN抗体可以可视化鹌鹑细胞，并将其与宿主组织区分开来（图1 C,D）。在此例中，仅由前脑腹侧发育而来的组织被抗体染色，表明移植物未被包括神经嵴在内的其他细胞类型污染。。 可通过体视学方法对这些切片进行分析，以估算嵌合程度，具体可通过计数宿主与供体细胞数量，或通过评估供体与宿主组织所占面积来实现。
形态学与分子结果的评估 
本研究的目的是评估腹侧前脑对面部形态以及额鼻外胚层（FEZ）中SHH表达的影响。最初，将鹌鹑组织移植到鸭胚胎中，以便利用QCPN对嵌合体进行评估（如上所述）。然而，由于鹌鹑脑发育较快，导致嵌合体严重畸形（图2），因...

本文介绍了一种设计用于检测基底前脑信号传导与模式形成特性的组织移植技术。&#160;在颅面发育过程中。

鸟类胚胎作为模型系统已被使用了一个多世纪，促进了对脊椎动物发育的基本理解。其中之一的……

该方法可使研究人员评估基底前脑与面部之间的组织相互作用。此技术的主要优势在于能够分离基底前脑以进行分析，同时避免神经嵴细胞的污染，从而防止对分析结果造成干扰。该技术的难点在于将前脑从宿主中移除，并用供体组织进行替换。演示该实验步骤的是来自拉尔夫·马尔库乔博士实验室的研究科学家Diane Hu。首先，准备含有中性红的DMEM培养基、玻璃转移移液管以及 sharpened tungsten。使用10毫升注射器和18号针头，从蛋壳的尖端一端吸取0.5毫升的白蛋白。使用剪刀尖在卵壳顶部开一个小孔。然后在孔上贴一片胶带，剪出一个圆形开口以暴露胚胎。用中性红对胚胎进行染色。从7或8期胚胎的前脑基底部左侧获取组织移植物。使用弯曲的 sharpened 钨针轻轻切取一块前脑组织。为避免包含下方的内胚层，应将针尖滑入前脑下方，并与神经管轴线平行推进。使用玻璃转移移液管从供体胚胎中拾取移植物，并将其转移到含有中性红的DMEM中染色两分钟。然后将染色后的移植物置于不含中性红的DMEM中，直至准备进行移植。将白来航鸡的受精卵置于37摄氏度的湿润培养箱中孵育，直至达到Hamburger-Hamilton 7至8期。按照先前已展示的方法暴露胚胎。使用锋利的钨针，通过切割并移除一块0.3 × 0.2 毫米的前脑基底部组织，以制备移植部位，为移植材料留出空间。应避免过度损伤下方的内胚层，否则会出现卵黄颗粒从任何撕裂处渗出的现象。将移植物移植到宿主后，将其定位以替代宿主被切除的前脑基底部。用胶带紧密封住孔口，并将胚胎放回37°C培养箱中，直至准备进行分析。最初，通过将鹌鹑组织移植到鸡胚胎中来构建嵌合体。使用QCPN抗体，可对鹌鹑细胞进行可视化并将其与宿主组织区分开来。鹌鹑-鸡嵌合系统证实，所有移植物仅由神经组织构成，未受到其他细胞类型的污染。将鹌鹑组织移植到鸭胚胎中会导致严重畸形的嵌合体，原因是鹌鹑脑发育速度较快。因此，将鸭的组织移植到鸡胚胎中。所获得的鸭-鸡嵌合体表明，大脑参与了形态的调控。采用全 mount C2 杂交方法检测嵌合体中Sonic hedgehog的表达。与形态学类似，嵌合体鸭侧的Sonic hedgehog表达也呈现更接近鸭子的特征。准备宿主位点需要练习。大量胚胎无法存活，因此制备大量嵌合体有助于确保获得足够的分析样本。该方法使得评估来自大脑的信号如何调控额鼻外胚层区域中Sonic hedgehog表达域成为可能。

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发育生物学

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