Name: 通过冷冻软X射线断层扫描对细胞进行3D制图描述 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: 学习冷冻软X射线断层扫描技术，无需染色或切片即可对完整细胞进行高分辨率三维成像。该方法可在几分钟内获取定量细胞超微结构数据，适用于感染、疾病形态学及药物作用等生物医学研究。

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该项目获得了欧洲委员会“地平线2020”iNEXT-Discovery项目以及欧盟“地平线2020”研究与创新计划下玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里基金协议No 75439的资助。

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作者声明无利益冲突。

样品制备是获得高质量软X射线断层图像的关键步骤，因为图像质量直接取决于样品玻璃化效果以及细胞所嵌入的冰层厚度。在冰层较薄的区域可采集到高信噪比的投影图像，从而能够最小化实现最高可能分辨率所需的辐射剂量。此外，细胞的融合度也会影响最终断层图像的质量，因为在旋转过程中应避免邻近细胞进入视场（FoV）。最后，金（Au）标记物的合理分布将决定投影图像配准的准确性，从而最终影响三维重建体积的质量。需要注意的是，若金标记物在载网上分布得当，可实现投影图像配准步骤的自动化；否则，这一关键步骤将需要操作者具备较高的专业技能。
本文所述的方案仅代表一种可能的样品制备策略，该策略与冷冻电子断层扫描（cryo-ET）中所采用的方法具有相似之处。在这两种情况下，改进苛刻的样品制备流程以提高可重复性，对于这些技术的成功应用至关重要，目前已有诸多努力致力于实现这一目标29。值得指出的是，除了成像分离的细胞外，只要在高倾转角度下穿过切片的透射信号足够强，组织切片也可用于成像。通常情况下，这要求切片厚度为几微米（低于10 µm）。
为了对细胞内的特定结构或事件进行成像，必须确保该特定特征位于倾斜系列图像的视场（FoV）范围内。由于冷冻软X射线断层成像（cryo-SXT）中的视场通常限制在10 × 10 µm2到15 × 15 µm2之间（具体取决于物镜，并需考虑分辨率至少两倍的像素过采样），其范围往往小于整个细胞的延伸区域（参见图5中红色方框所示）。因此，必须找到感兴趣区域（ROI）并进行准确标记。这通常通过荧光标记和可见光关联成像方法实现。结合落射荧光的二维策略较为直接，因为软X射线透射显微镜集成了在线可见光荧光显微镜；但也可采用其他方法获取高分辨率的二维或三维荧光信号4,12,13,15,16。在这些情况下，载网需首先在特定仪器（如超分辨率显微镜）中进行成像。需要注意的是，最有效的关联成像策略是在低温条件下进行数据采集。这是因为室温（RT）下的可见光荧光成像与样品玻璃化之间的时间延迟可能导致无法及时捕捉到目标细胞事件；此外，玻璃化过程还可能导致在室温下已成像的目标细胞从载网上脱落。尽管大多数关联成像方法都涉及将样品载网在不同仪器之间操作和转移，从而增加了载网污染或损坏的风险，但其优势显而易见：能够在细胞整体结构背景下精确定位特定事件或分子。
当需要进行全细胞成像时，只要总剂量不超过辐射损伤限度，就可以将不同的断层图像拼接起来。通常，在同一细胞上采集少数几个断层图像所沉积的剂量远低于可达到分辨率下的限值（109 Gy），因此无需采取特定策略来降低剂量，尽管具体情况取决于样品和实验条件。然而，在进行如光谱断层成像等高强度数据采集时，则确实需要尽量减少剂量，并应采用相应的便捷数据采集方法和特定的处理策略。
冷冻软X射线断层成像技术（Cryo-SXT）存在若干局限性，此处应予以说明。第一个局限性是众所周知的“缺失楔形”问题，这是使用平面样品支撑材料所固有的缺陷。过去曾使用并仍在某些设施中采用允许180度旋转的毛细管样品支撑材料，但这类支撑材料也存在缺点，例如由于玻璃吸收导致对比度降低，以及仅限于使用悬浮状态的细胞。减轻缺失楔形影响的一种方法是进行双倾转断层成像，目前在Mistral光束线上已可实现该技术。第二个局限性来自此类显微镜中所使用的菲涅耳波带片透镜。该透镜决定了可达到的最终分辨率和景深（DoF），二者密切相关。这意味着提高分辨率将导致景深减小，而细胞的厚度通常较大。例如，一个40 nm的波带片透镜理论上具有3 µm的景深和24.4 nm的半节距分辨率。因此，分辨率与景深之间的权衡至关重要，透镜的选择将取决于细胞类型30,31。最后，全球范围内的操作型透射X射线显微镜（TXM）远未达到理想显微镜的水平，目前正不断努力改进光学系统以实现理论预期性能。此外，重建体积数据的可视化与分割可通过特定的软件工具完成25,32,33,34。
总之，冷冻软X射线断层成像技术（cryo-SXT）能够在中等分辨率（半节距25-30 nm）下对细胞进行定量成像，并实现统计意义上的成像数量（每天可获取数十个断层图像）。该技术可用于获取特定条件下细胞器的结构组织、空间分布和尺寸信息，例如在病原体感染或疾病过程中，或在精确的时间点及特定处理后。因此，cryo-SXT 是一种有用的生物成像补充技术，可与更常见的电子显微镜和可见光显微镜相互补充，各类技术分别适用于不同尺度的样品和分辨率范围。cryo-SXT 常与可见光荧光显微技术联用，实现关联成像，但也可与其他冷冻关联成像策略结合使用。

冷冻软X射线断层成像（Cryo-SXT）在生物成像研究中可发挥核心作用，因其能够提供水合完整细胞的三维中等分辨率（25-30 nm半节距）图像体数据1,2,3,4,5,6。在碳和氧的K吸收边之间（4.4-2.3 nm）的“水窗”能量范围内，富含碳的细胞结构的吸收率比其周围及内部富含氧的介质高出10倍。在此能量范围内，厚度达10 µm的玻璃态冰冻细胞无需切片或染色即可成像，从而获得具有高吸收对比度的定量投影图像；结合样品旋转能力，可实现细胞结构的断层重建。Cryo-SXT在样本尺寸和空间分辨率方面填补了其他成像技术难以企及的空白。
简而言之，冷冻软X射线断层成像（cryo-SXT）的吸收对比度是定量的，因为光子穿过厚度为 t 的样品时的衰减遵循比尔-朗伯定律，如下所示：<img alt="光学与光子学分析中的指数衰减公式，I(t)=I₀e^(-μlt)。" src="/files/ftp_upload/62190/62190eq01.jpg" style="margin:-.4em 0;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1">，其中 I0 表示入射光强，µl 表示线性吸收系数，其值取决于波长 λ 以及样品折射率的虚部 β（<img alt="磁导率公式，\( μ_l = 4πβ/λ \)，科学公式。" src="/files/ftp_upload/62190/62190eq02.jpg" style="margin:-.4em 0;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 2">）。衰减程度取决于被成像结构的生化组成和厚度，每种生化组分都具有特定的X射线线性吸收系数 µl（LAC）。这意味着每个断层成像体素的数值取决于该体素内化学元素的种类及其浓度7。因此，仅基于重建所得的固有LAC值，即可自然地区分不同的细胞器（如细胞核、核仁、脂滴或线粒体）或染色质的不同压缩状态2,8,9。
此外，冷冻软X射线断层成像（cryo-SXT）是一种高通量技术，可在几分钟内完成断层图的采集。该技术特别适用于对细胞群体进行介观尺度成像，可在关键时间点（如细胞分裂、分化和凋亡）捕获细胞状态，也可在不同响应状态（如特定药物治疗的化学暴露或病原体感染所诱导的状态）下进行观察。在这些关键时间点采集的数据将提供系统的三维描述，真实记录特定时刻下各类细胞器的空间组织结构。
通常，冷冻软X射线断层成像（cryo-SXT）会与其他技术结合使用，采用相关联的方法，以在三维细胞环境中定位特定的结构、事件或大分子4,10,11,12,13,14,15,16，或硬X射线荧光数据17,18。在低温条件下实现多模态关联分析对于获取目标体系最完整且有价值的信息至关重要。中国台湾Alba同步辐射光源Mistral线站和英国Diamond光源B24线站上典型的cryo-SXT实验流程概要如图1所示。
此外，利用同步辐射设施的波长调谐能力，除了结构信息外，还可通过样品中特定元素的特征性差分吸收获取光谱信息。一个典型例子是在细胞生物矿化过程研究中对钙元素的定位。19,20,21通过在不同光子能量（光谱）下或在感兴趣X射线吸收边以下和附近的能量处获取二维图像或断层扫描图像，可识别含有选定元素的像素或体素。光谱还可用于区分化学状态（例如，前文生物矿化示例中无定形钙向羟基磷灰石的转化过程）20二维和三维中均可实现不同元素的定量分析。冷冻细胞的光谱成像通常在水窗范围内进行，但如果样品含水量足够低，或采用包括脱水在内的其他样品制备方法，也可在其他能量范围内实现。22详细的光谱学逐步操作方案不在本方案的重点范围内。
下文将简要概述主要的样品制备步骤，尽管每个系统可能需要单独优化，随后详细介绍冷冻软X射线断层扫描的数据采集流程。

<table><tbody><tr><td>Amira</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td>用于分割的软件</td></tr><tr><td>Au 穿孔碳膜&amp;nbsp; 定位网格</td><td>（Quantifoil Micro Tools Gmb</td><td>&amp;nbsp;R 2/2 Au G200F1</td><td>Au Holey Carbon Films 寻找网格</td></tr><tr><td>金纳米颗粒</td><td>&amp;nbsp;BBI集团，英国加的夫</td><td>100纳米金纳米颗粒</td><td>100 nm 金纳米颗粒（NPs）在 Mistral（Alba）的制备</td></tr><tr><td>金纳米颗粒</td><td>&amp;nbsp;BBI集团，英国加的夫</td><td>250纳米金纳米颗粒</td><td>B24（Diamond）处的250 nm金纳米颗粒（NPs）</td></tr><tr><td>Axio Scope A1</td><td>Zeiss</td><td>430035 9060</td><td>荧光显微镜</td></tr><tr><td>1号滤纸印迹法</td><td>Whatman</td><td>WHA10010155</td><td>印迹滤膜</td></tr><tr><td>Bsoft</td><td></td><td></td><td>用于投影比对、重构与可视化的软件（Heymann 等，2008）</td></tr><tr><td>嵌合体</td><td></td><td></td><td>用于分割的软件（Pettersen 等，2004）</td></tr><tr><td>冷冻电镜电晕放电装置套件</td><td>PELCO easiGlow</td><td>91000S</td><td>辉光放电清洗系统</td></tr><tr><td>铜孔状碳膜&amp;nbsp; 定位网格</td><td>（Quantifoil Micro Tools Gmbh）</td><td>&amp;nbsp;R 2/2Cu G200F1</td><td>铜质带孔碳膜寻位网格</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td>热灭活，经无菌过滤，适用于细胞培养</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>用于图像处理与分析的 Java 软件（NIH） &amp;amp; LOCI 威斯康星大学</td></tr><tr><td>IMOD</td><td></td><td></td><td>用于投影对齐、重构与可视化的软件（Kremer 等，1996）</td></tr><tr><td>Leica EM GP 网格冷冻制样仪</td><td>Leica</td><td>16706401</td><td>自动冷冻制样仪 EM</td></tr><tr><td>LINKAM 冷冻载台</td><td>Linkam科学仪器公司</td><td>CMS 196</td><td>冷冻关联显微镜载台</td></tr><tr><td>MIB</td><td></td><td></td><td>用于分割的软件（Belevich 等，2016）</td></tr><tr><td>P100 培养皿</td><td>Sigma</td><td>P6106</td><td>用于细胞培养和无菌处理</td></tr><tr><td>P60 培养皿</td><td>Sigma</td><td>D8054</td><td>用于细胞培养和无菌处理</td></tr><tr><td>聚赖氨酸</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td>聚-L-赖氨酸溶液 0.01%，经无菌过滤</td></tr><tr><td>软X射线显微镜 0.25–1.2 keV</td><td>Xradia</td><td>NCT-SB</td><td>透射软X射线显微镜</td></tr><tr><td>SURVOS</td><td></td><td></td><td>用于分割的软件&amp;nbsp; （Luengo 等，2017）</td></tr><tr><td>Tomo3d</td><td></td><td></td><td>用于重建的软件（SIRT，WBP）（Agulleiro 等，2011）</td></tr><tr><td>TomoJ</td><td></td><td></td><td>用于重构的软件（ART）（Messaoudi 等，2007）</td></tr><tr><td>XM 数据浏览器</td><td>Zeiss</td><td></td><td>TXM 软件</td></tr></tbody></table>

通过低温软x射线断层扫描对细胞进行三维制图描述

A 3D Cartographic Description of the Cell by Cryo Soft X-ray Tomography

成像技术对于理解生物研究及相关领域中的细胞结构与机制至关重要。在这些技术中，低温软X射线断层成像（cryo soft X-ray tomography, Cryo-SXT）能够在水窗X射线能量范围（284–543 eV）内对完整冷冻保存的细胞进行成像。在此能量范围内，碳基结构对X射线的吸收率天然高于水，从而可实现对每个体素内物质线性吸收系数的三维重建。通过该方法，可获得厚度达10 µm的完整细胞水平的定量结构信息，空间分辨率可达25–30 nm半节距，且具有较高的通量。Cryo-SXT已证明其在当前生物医学研究中的重要价值，可提供有关细胞感染过程（病毒、细菌或寄生虫）、疾病引起的形态学变化（如隐性遗传病）的三维信息，并有助于理解药物在细胞水平的作用机制，或在三维细胞环境中定位特定结构。此外，借助同步辐射装置可调谐的波长特性，还可利用光谱显微术或其三维形式——光谱断层成像，对细胞内特定元素（如生物矿化过程中的钙）进行成像与定量分析。Cryo-SXT可为其他生物成像技术（如电子显微镜、X射线荧光或可见光荧光成像）提供互补信息，通常作为冷冻条件下二维或三维关联成像的联合方法，以关联功能、位置与形态。

制备冷冻软X射线断层成像（cryo-SXT）样品可能具有挑战性。即使在同一块样品载网上，也可能同时存在理想区域和非理想区域，如图5所示，该图展示了同一块金标记网格（Au finder grid）上的两个方格。理想的样品应在方格中心位置含有单个细胞，细胞嵌入一层薄冰中，并被均匀分散的金 fiducial 标记物包围，这些标记物用于在断层重建前对倾斜投影图像进行对齐。图5A 显示了一个成纤维细胞样细胞（NIH 3T3），其符合上述多项标准。使用ART27对红色方框标记的视野区域（FoV）进行三维重建后所得的一个切片如图5B所示。由于对线性吸收系数（LACs）进行了定量重建，多种细胞器（如线粒体（M）、内质网（ER）、囊泡（V）和细胞核（N））均可清晰分辨。此外，重建图像的信噪比非常高，使细胞结构具有很强的对比度。相比之下，图5C 显示的是一个细胞密度较高的方格。由于细胞密度过高，通常会导致 blotting 效果较差，从而形成较厚的冰层，甚至出现玻璃化不良的问题。在某些情况下，这些问题在X射线成像前通过落射荧光定位扫描载网时即可被发现，此类载网应坚决避免使用。在图5C中，可以观察到一条贯穿整个网格方格的裂纹（由红色箭头标示），该裂纹存在于载网及玻璃化冰层中。由于载网在受到X射线束照射时可能发生不稳定，因此应避免在裂纹附近进行任何成像。此外，裂纹也可能是冰层过厚的征兆，本区域即属此种情况。在红色方框标记的区域采集了一组倾斜系列图像，其对应的三维重建结果中的一个切片如图5D所示。尽管仍可识别出一些较大的结构，但由于厚冰导致玻璃化质量差，细微结构在噪声和颗粒状纹理中丢失，例如箭头所指的上方线粒体区域即为明显例证。
<img alt="冷冻成像过程：玻璃化、可见光、X射线断层扫描；实验装置示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62190/62190fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：工作流程。 冷冻软X射线断层成像（cryo-SXT）数据采集前遵循的示意图工作流程。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62190/62190fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细胞生长实验：培养皿培养、显微镜下细胞观察、用于细胞计数的网格。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62190/62190fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图2：在网格上培养细胞。（A）在P100培养皿中生长的细胞，融合度约为80%–90%。（B）接种细胞后的P60培养皿，其中含有多个网格。（C）接种24小时后，细胞在网格表面生长的情况。比例尺：100 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62190/62190fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于蛋白质结构分析的冷冻电子显微镜装置，显示样品架和显微镜。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62190/62190fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：将载网加载到样品架并装入转移腔室。（A）充满液氮的工作站，其中转运器和冷冻盒已准备就绪，可用于加载载网。（B）已插入加载器中的样品架，载网上已加载样品。（C）转运器中位于位置3的样品架，未加盖。（D）连接了转移腔室的工作站。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62190/62190fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="超高真空系统、光谱学装置、光学测量、表面分析设备。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62190/62190fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：将样品装入透射X射线显微镜（TXM）（A）将转移腔室连接到TXM。（B）TXM内部的样品穿梭装置。（C）TXM机械臂将样品支架插入样品台。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62190/62190fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞结构的电子显微镜图像；可见线粒体和细胞核；显微照片分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62190/62190fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：冷冻软X射线断层成像示例。 上排：理想样品，(A) 网格方格的二维马赛克视图，显示位于中心的孤立细胞。(B) 从重建的三维体积中选取的一个切片，显示图(A)中红框标记的区域。与(D)相比，图像更加平滑且细节更清晰。 下排：非理想样品，(C) 网格方格的二维马赛克视图，显示细胞密度过高以及冰层和网格膜中存在裂纹（红色箭头）。(D) 从重建的三维体积中选取的一个切片，显示图(C)中红框标记的区域。图像的颗粒状纹理表明玻璃化效果较差或次优。N：细胞核；M：线粒体；ER：内质网；MV：多泡体；V：液泡；比例尺：A &amp; C 20 µm；B &amp; D 2 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62190/62190fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

本文介绍了一种用于冷冻软X射线断层成像（SXT）的实验方案，该方案描述了对完整冷冻保存的细胞进行超微结构成像所需的样品制备和数据采集步骤，成像分辨率达到25 nm半节距。

通过低温软X射线断层扫描对细胞进行三维制图描述

成像技术对于理解生物研究及相关领域中的细胞结构与机制至关重要。在这些技术中……

冷冻软X射线断层成像可提供细胞水平上的定量且有价值的信息，这些信息可单独使用，也可与其他成像技术结合使用。该技术在冷冻含水状态下获取样本图像，无需染色或切片。此外，它是一种高通量技术，因为每个断层图像仅需几分钟即可采集完成。软X射线冷冻断层成像技术为在单细胞水平上追踪感染或缺陷细胞的修复过程提供了理想的平台。该技术可用于评估新型抗病毒药物或基因治疗逆转红acted表型感染的疗效。将样品装载至透射X射线显微镜时，需使用液氮冷却转移室，直至其温度降至100开尔文以下。向工作站中补充液氮，并打开工作站边缘加热器。当工作站边缘停止沸腾时，在低温条件下将装有载网的冷冻盒放入工作站内的相应位置，并将载网装载到预先冷却的样品 holder 上。将 holder 装载到传输 shuttle 上，并用盖子保护好。将样品杆装入低于100开尔文的转移腔室，并将腔室抽至低真空。将转移腔室连接至显微镜，并按照屏幕上的真空操作流程，将转移腔室中的样品杆装入显微镜。当样品杆连同样品进入显微镜后，使用显微镜的机械臂将一个样品台转移至样品载台。使用在线可见光显微镜对网格进行明场成像时，选择可见光显微镜相机，并打开可见光显微镜的LED光源以进行明场成像。点击运动、控制、样品和样品theta，将样品旋转至负60度，使其面向可见光显微镜物镜；选择运动控制和样品，调节样品X轴和Y轴，将样品移至预期的中心位置。选择显微镜、采集、采集设置、采集模式、连续和开始，然后点击运动控制和样品，选择样品Z轴，以小至五微米的步长精细调节焦距，直至细胞和/或碳支持膜上的孔清晰对焦。然后选择显微镜、采集、采集设置、采集模式、拼接，再点击开始，以使用拼接的默认参数在明场模式下启动对载网的完整拼接图采集。对于荧光模式下的拼接成像，需关闭用于明场成像的可见光显微镜LED光源，并在设置中手动选择对应所需激发波长的LED光源及相应的光学滤光片。选择显微镜、采集、采集设置、采集模式、连续，然后点击开始，并点击运动控制和样品以选择样品Z轴位置，从而优化荧光图像的聚焦。然后，依次点击显微镜、采集、采集设置、采集模式、马赛克图，再点击开始，以获取保留明场马赛克图中X和Y位置参数的马赛克图像。随后关闭LED光源。对于X射线马赛克图像采集，在MISTRAL上将出口狭缝调整为5微米，并使用1秒的曝光时间。选择显微镜、采集、采集设置、相机设置和二分之一合并，通过样品Z轴平移调整焦距。选择运动控制和样品以选定样品Z轴。首先以5微米为步长，逐步优化至0.5微米步长，直至细胞或碳膜孔清晰对焦。要获取网格方格的马赛克图，请点击显微镜、采集、采集设置、采集模式、马赛克，然后开始。获取图像后，单击运动控制和样品，调整样品 X 和样品 Y，将样品移动至平坦场位置。在 MISTRAL 上将曝光时间设置为一秒。然后，用平坦场图像对获取的图像马赛克进行归一化，以获得透射率，并保存归一化后的图像马赛克。为了将样品在零度旋转位置时与旋转轴对齐，请选择“运动控制”和“样品”，然后调整样品X、样品Y和样品Z，以聚焦到细胞的特定结构上，使其位于旋转轴上。要将样品旋转至正theta位置，请选择“运动控制”和“样品”，然后将样品theta调整为正theta值。使用线条工具在需要置于旋转轴上的细胞结构上绘制一条直线。要将样品旋转至负 theta 位置，请选择“运动控制”和“样品”，然后将样品 theta 调整为负值。使用线条工具在细胞的特定结构上绘制一条线，以确定旋转轴。在正或负 theta 位置时，利用样品 Z 轴平移将选定的结构移动至两条线之间的中心位置，并重复调整样品旋转，直至获得最小的线间距。当样品的 theta 角度为零时，将样品沿 X 方向移动所需距离的两倍，使选定的特征位于视场中心，然后将泽尼克盘沿 X 方向移动，使该特征重新回到视场中心。为了针对新的旋转轴重新优化泽尼克盘 Z 方向的位置，请选择显微镜、采集、采集设置、采集模式和焦距序列，然后点击开始以记录泽尼克盘 Z 方向的焦距序列。接着，点击运动控制和泽尼克盘，选择泽尼克盘 Z，将泽尼克盘 Z 移动到样品处于焦点位置的位置。要获取断层图像，请点击“运动控制”和“样品”，选择“样品 theta”以将负的最大角度移动至正 0.1。点击“显微镜”、“采集”、“采集设置”、“采集模式”和“断层扫描”，根据包含零度角图像在内的总角度数以及角度范围设置图像数量。选择“起始角度”和“终止角度”，然后点击“显微镜”、“采集”、“采集设置”、“相机设置”，并设置曝光时间。单击“开始”以启动断层扫描倾斜系列的采集。理想的样品应为单个细胞位于方形网格的中心，嵌入一层薄冰中，并由分散良好的金标记物包围。由于线性吸收系数的定量重建，在最终重建的断层图中应能够区分多种不同的细胞器，如线粒体、内质网、液泡和细胞核。在此图像中，可观察到细胞密度较高的方形区域。本示例中，吸附过程效率较低，导致形成较厚且带有裂纹的冰层。尽管在此样品中仍可识别出一些较大的结构，但由于冰层过厚导致玻璃化质量较差，精细结构细节已淹没在噪声和颗粒状背景中。应尽量减少对冷冻保存样品的操作，因为此阶段的大多数伪影都是在处理样品时产生的。通常，在进行冷冻基底断层扫描之前，会先进行相关冷冻可见光显微成像。此外，还可针对相关化学元素进行光谱显微成像。该方案填补了一项技术空白，可在其他直接成像技术难以实现的样本条件和分辨率范围内进行操作，达到数微米的观测尺度和30纳米半节距的分辨率。

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