通过低温软X射线断层扫描对细胞进行三维制图描述
2021年3月15日
本文介绍了一种用于冷冻软X射线断层成像（SXT）的实验方案，该方案描述了对完整冷冻保存的细胞进行超微结构成像所需的样品制备和数据采集步骤，成像分辨率达到25 nm半节距。
冷冻软X射线断层成像可提供细胞水平上的定量且有价值的信息，这些信息可单独使用，也可与其他成像技术结合使用。该技术在冷冻含水状态下获取样本图像，无需染色或切片。此外，它是一种高通量技术，因为每个断层图像仅需几分钟即可采集完成。
软X射线冷冻断层成像技术为在单细胞水平上追踪感染或缺陷细胞的修复过程提供了理想的平台。该技术可用于评估新型抗病毒药物或基因治疗逆转红acted表型感染的疗效。将样品装载至透射X射线显微镜时，需使用液氮冷却转移室，直至其温度降至100开尔文以下。
向工作站中补充液氮，并打开工作站边缘加热器。当工作站边缘停止沸腾时，在低温条件下将装有载网的冷冻盒放入工作站内的相应位置，并将载网装载到预先冷却的样品 holder 上。将 holder 装载到传输 shuttle 上，并用盖子保护好。
将样品杆装入低于100开尔文的转移腔室，并将腔室抽至低真空。将转移腔室连接至显微镜，并按照屏幕上的真空操作流程，将转移腔室中的样品杆装入显微镜。当样品杆连同样品进入显微镜后，使用显微镜的机械臂将一个样品台转移至样品载台。
使用在线可见光显微镜对网格进行明场成像时，选择可见光显微镜相机，并打开可见光显微镜的LED光源以进行明场成像。点击运动、控制、样品和样品theta，将样品旋转至负60度，使其面向可见光显微镜物镜；选择运动控制和样品，调节样品X轴和Y轴，将样品移至预期的中心位置。选择显微镜、采集、采集设置、采集模式、连续和开始，然后点击运动控制和样品，选择样品Z轴，以小至五微米的步长精细调节焦距，直至细胞和/或碳支持膜上的孔清晰对焦。
然后选择显微镜、采集、采集设置、采集模式、拼接，再点击开始，以使用拼接的默认参数在明场模式下启动对载网的完整拼接图采集。对于荧光模式下的拼接成像，需关闭用于明场成像的可见光显微镜LED光源，并在设置中手动选择对应所需激发波长的LED光源及相应的光学滤光片。选择显微镜、采集、采集设置、采集模式、连续，然后点击开始，并点击运动控制和样品以选择样品Z轴位置，从而优化荧光图像的聚焦。
然后，依次点击显微镜、采集、采集设置、采集模式、马赛克图，再点击开始，以获取保留明场马赛克图中X和Y位置参数的马赛克图像。随后关闭LED光源。对于X射线马赛克图像采集，在MISTRAL上将出口狭缝调整为5微米，并使用1秒的曝光时间。
选择显微镜、采集、采集设置、相机设置和二分之一合并，通过样品Z轴平移调整焦距。选择运动控制和样品以选定样品Z轴。首先以5微米为步长，逐步优化至0.5微米步长，直至细胞或碳膜孔清晰对焦。要获取网格方格的马赛克图，请点击显微镜、采集、采集设置、采集模式、马赛克，然后开始。
获取图像后，单击运动控制和样品，调整样品 X 和样品 Y，将样品移动至平坦场位置。在 MISTRAL 上将曝光时间设置为一秒。然后，用平坦场图像对获取的图像马赛克进行归一化，以获得透射率，并保存归一化后的图像马赛克。
为了将样品在零度旋转位置时与旋转轴对齐，请选择“运动控制”和“样品”，然后调整样品X、样品Y和样品Z，以聚焦到细胞的特定结构上，使其位于旋转轴上。要将样品旋转至正theta位置，请选择“运动控制”和“样品”，然后将样品theta调整为正theta值。使用线条工具在需要置于旋转轴上的细胞结构上绘制一条直线。
要将样品旋转至负 theta 位置，请选择“运动控制”和“样品”，然后将样品 theta 调整为负值。使用线条工具在细胞的特定结构上绘制一条线，以确定旋转轴。在正或负 theta 位置时，利用样品 Z 轴平移将选定的结构移动至两条线之间的中心位置，并重复调整样品旋转，直至获得最小的线间距。
当样品的 theta 角度为零时，将样品沿 X 方向移动所需距离的两倍，使选定的特征位于视场中心，然后将泽尼克盘沿 X 方向移动，使该特征重新回到视场中心。为了针对新的旋转轴重新优化泽尼克盘 Z 方向的位置，请选择显微镜、采集、采集设置、采集模式和焦距序列，然后点击开始以记录泽尼克盘 Z 方向的焦距序列。接着，点击运动控制和泽尼克盘，选择泽尼克盘 Z，将泽尼克盘 Z 移动到样品处于焦点位置的位置。
要获取断层图像，请点击“运动控制”和“样品”，选择“样品 theta”以将负的最大角度移动至正 0.1。点击“显微镜”、“采集”、“采集设置”、“采集模式”和“断层扫描”，根据包含零度角图像在内的总角度数以及角度范围设置图像数量。选择“起始角度”和“终止角度”，然后点击“显微镜”、“采集”、“采集设置”、“相机设置”，并设置曝光时间。
单击“开始”以启动断层扫描倾斜系列的采集。理想的样品应为单个细胞位于方形网格的中心，嵌入一层薄冰中，并由分散良好的金标记物包围。由于线性吸收系数的定量重建，在最终重建的断层图中应能够区分多种不同的细胞器，如线粒体、内质网、液泡和细胞核。
在此图像中，可观察到细胞密度较高的方形区域。本示例中，吸附过程效率较低，导致形成较厚且带有裂纹的冰层。尽管在此样品中仍可识别出一些较大的结构，但由于冰层过厚导致玻璃化质量较差，精细结构细节已淹没在噪声和颗粒状背景中。
应尽量减少对冷冻保存样品的操作，因为此阶段的大多数伪影都是在处理样品时产生的。通常，在进行冷冻基底断层扫描之前，会先进行相关冷冻可见光显微成像。此外，还可针对相关化学元素进行光谱显微成像。
该方案填补了一项技术空白，可在其他直接成像技术难以实现的样本条件和分辨率范围内进行操作，达到数微米的观测尺度和30纳米半节距的分辨率。
概述
冷冻软X射线断层成像（cryo-SXT）是一种强大的成像技术，能够在无需染色或切片的情况下，对完整冷冻保存的细胞进行高分辨率的三维可视化观察。该方法利用水窗X射线能量范围，提供细胞水平上的定量结构信息，因此在生物医学研究中具有重要价值，适用于感染、疾病形态学及药物作用机制等领域的研究。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞成像
- 结构生物学
- 生物医学研究
背景
- 成像技术对于理解细胞的结构与功能至关重要。
- 冷冻软X射线断层成像（Cryo-SXT）可对厚度达10 μm的完整细胞进行成像，空间分辨率可达25–30 nm半节距。
- 该技术利用了在水窗X射线范围内，碳结构对X射线的吸收率高于水的特性。
- 冷冻软X射线断层成像可与其他成像方式（如电子显微镜和荧光显微镜）相互补充。
研究目的
- 演示使用软X射线断层成像技术对冷冻保存细胞进行制备和成像的实验方案。
- 突出冷冻软X射线断层成像（cryo-SXT）在定量、高通量细胞成像中的优势。
- 展示如何将冷冻软X射线断层成像与其他成像技术结合，用于相关性研究。
使用的方法
- 在液氮环境中、低于100 K的温度下制备冷冻保存的细胞样品载网。
- 使用真空转移室将样品装载至透射X射线显微镜中。
- 获取明场和荧光马赛克图，用于样品定位与关联分析。
- 将样品与旋转轴对齐，并采集X射线倾斜系列图像，用于断层重建。
主要结果
- 冷冻电子断层扫描技术（Cryo-SXT）可快速采集断层图像，每个倾斜系列仅需几分钟即可完成。
- 该技术可提供细胞超微结构的定量三维重建结果，能够区分线粒体、内质网、液泡和细胞核等细胞器。
- 样品质量，特别是冰层厚度和玻璃化程度，显著影响图像的分辨率和细节呈现。
- 可通过能谱显微技术对细胞内特定元素进行成像与定量分析。
结论
- 冷冻软X射线断层成像（Cryo-SXT）在细胞成像领域具有独特优势，能够在无需染色或切片的情况下提供高分辨率、定量的三维数据。
- 该方法既可独立使用，也可作为关联成像工作流程的一部分。
- 正确的样品制备与操作处理对于获得最佳成像结果至关重要。
常见问题
行业应用价值
冷冻软X射线断层成像技术（cryo-SXT）能够对完整且经冷冻保存的细胞进行高分辨率、定量的三维成像，有助于在早期发现阶段实现机制性风险降低和靶点验证。该技术无需染色或切片即可可视化细胞超微结构，从而在生物制药研发流程的关键转折点上提升预测可信度。该平台在发现研究与临床前研究之间的项目组合筛选及转化连续性方面具有战略性地位。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可直接观察细胞结构，用于验证治疗假设。
- 通过揭示与疾病或干预相关的形态学变化，支持生物学风险评估。
- 提供定量的三维数据，用于功能靶点验证及机制研究。
- 有助于在靶点选择的早期阶段做出可预测的“继续/终止”决策。
筛选与检测方法开发
- 为下游筛选工作流程制备经过验证的高分辨率细胞模型。
- 提供可重复的定量输出，用于检测方法的标准化和基准评估。
- 支持高通量断层图采集，助力可扩展的化合物评价。
- 可与关联成像技术整合，促进稳健的检测开发及平台复用。
转化与临床前研究
- 将三维细胞成像与疾病相关的形态学终点相结合。
- 通过关联结构与功能，支持从发现到临床前验证的连续性研究。
- 基于定量的细胞表型，实现风险调整后的推进决策。
- 为转化生物标志物的开发提供机制层面的风险评估支持。
流程与工作流整合
冷冻软X射线断层成像技术通过提供定量的、高内涵的细胞成像数据，在早期发现、先导物识别和临床前研究之间架起桥梁。
- 发现生物学：通过细胞过程的直接三维可视化，支持假设验证和通路阐明。
- 筛选：提供可直接用于检测的、可重复的成像结果，适用于化合物评估及平台扩展。
- 分析：生成细胞器形态和分布的定量测量数据，用于比较分析。
- 转化研究：在成像终点支持下，将细胞结构与疾病模型及生物标志物关联。
- 企业级复用：作为可复用的成像能力，应用于多个研发项目和疾病领域。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点验证中的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：提供标准化、高通量且可重复的成像工作流程。
- 战略价值：支持基于充分信息的立项/终止决策，实现资本高效的投资组合管理。
- 组合影响：支持基于风险调整的发现阶段和临床前资产的优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备低温样品制备和先进成像仪器方面的专业知识。
- 需要能够使用同步辐射或专用X射线显微镜设施。
- 为确保可重复性和数据整合，需在不同研究团队间进行严格的标准统一。
- 在多种细胞类型和疾病模型间的应用可能需要对实验方案进行优化。
- 样品玻璃化质量及最小化操作对获得最佳成像结果至关重要。
