使用钙荧光染料标记和纳米颗粒追踪分析法评估人体尿液中的纳米晶体

该方案可特异性检测人尿液中含钙的纳米晶体。此技术有望用于预测肾结石形成的早期阶段以及其他与尿液晶体相关的疾病。本实验操作将由本实验室的四级研究员 Parveen Kumar 博士进行演示。

让受试者连续三天摄入低草酸盐饮食，并在前一晚开始禁食。随后，在受试者摄入草酸盐负荷之前，收集其24小时尿液样本。给受试者饮用含有水果和蔬菜的思慕雪，其中草酸盐负荷量约为8毫摩尔。

在摄入草酸盐后24小时内让受试者收集尿液，并于次日送回。在处理前将所有尿液样本置于室温下保存。测量并记录尿液样本的pH值和体积。

充分混匀后，将50毫升尿液加入已标记的无菌50毫升锥形管中。使用台式离心机在室温下以1,200 ×g离心10分钟。弃去上清液，然后用5毫升100%乙醇洗涤并重新悬浮沉淀物。

使用台式离心机在室温下以1,200 × g离心样品10分钟。弃去上清液，并将沉淀物重悬于1毫升100%乙醇中。将样品于-20摄氏度保存以备后续处理，或立即进行样品染色。

将100纳米大小的金纳米颗粒按1:1,000的比例稀释于超纯水中，用于优化仪器设置。在暗处用5毫摩尔Fluo-4 AM染色30分钟之前，先将尿液样本用水稀释20倍，然后使用NTA分析样本。在进行NTA分析前，按照文本稿件中的描述制备草酸钙和磷酸钙晶体。

打开计算机和仪器，然后启动软件并开启相机。单击窗口左上角的捕获图标以进入捕获模式。使用1 mL注射器向平台内泵入空气，直至平台表面洁净，完成平台清洁。

轻轻向装置中加入水两到三次，并使用另一个1 mL注射器去除所有气泡。平台清洁后，加入水并通过摄像头观察表面是否有任何污染，然后将金纳米颗粒作为对照加入样品加载泵注射器中以校准仪器。调节屏幕上或仪器右侧旋钮上的摄像头增益水平，直至图像开始显示彩色像素，随后降低摄像头增益水平。

接下来，调整屏幕以优化图像。用鼠标左键点击视频图像，按住左键并上下拖动图像，以获得完整的视野。

设置输注速度并调节摄像头，使金纳米颗粒在摄像头屏幕上可见。初始设置时将输注速度设为高速，以确保检测到金纳米颗粒。检测到后，将速度降低至50 µL/min，以观察金纳米颗粒。

调整相机水平以观察颗粒。对于未染色的样品，将屏幕增益调至五级以实现相机聚焦，并将相机水平设为八级。聚焦完成后，记录样品图像。

优化完成后，在分析其他样品前需再次用水清洗装置，以确保管路清洁且无颗粒残留。分析染色样品时，将相机调整至装有合适荧光滤光片的滤光位置，并将稀释后的染色样品加入样品加载泵注射器中，将流速降低至20 µL/min进行分析。将屏幕增益调整为5，相机水平调整为13。

每次测量后保存数据。计算每个样本五次读数的纳米颗粒平均数量，并使用标准差或均值标准误分析数据。采用配对t检验进行数据分析。

Fluo-4 AM 能够结合草酸钙晶体，这些晶体大小在 50 至 270 纳米之间，平均浓度为每毫升 12.6 亿个颗粒，同时也能够结合磷酸钙晶体，这些晶体大小在 30 至 225 纳米之间，平均浓度为每毫升 22.2 亿个颗粒。在草酸盐负荷前收集的 24 小时尿液样本中含有一些大小为 110 至 300 纳米的尿液纳米晶体。相比之下，草酸盐负荷后的尿液样本中尿液纳米晶体数量显著增加。

为确认该方法的可重复性，对样品进行了三次测量，技术重复之间无显著差异。在尝试本方案时，向仪器中添加样品而不产生气泡可能存在一定困难。为避免此问题，可先向仪器中加入空气和水，再缓慢加入样品。

同时，务必持续监测样本，确保无气泡存在。该新方法将用于草酸钙肾结石疾病患者，以监测疾病进展和/或预测肾结石风险。