Name: 监测人类痰样中的中性粒细胞和导管素 G 活性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 了解使用FRET探针和流式细胞术在人类痰样中定量检测中性粒细胞弹性蛋白酶和导管素G活性的计算方法。该方法支持抗炎治疗评估和生物标志物验证研究。

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本项目得到了德国联邦教育与研究部（资助号：FKZ 82DZL004A1，授予 M.A.M）和德国研究基金会（SFB-TR84TP B08，授予 M.A.M）的资助。本论文所述工作得到了德国肺研究中心（DZL）以及海德堡欧洲分子生物学实验室（EMBL）对 M.G. 提供的博士奖学金的支持。我们感谢 J. Schatterny、S. Butz 和 H. Scheuermann 提供的专业技术协助。

以下方案描述了对人类痰液样本的分析。人体样本处理已获得海德堡大学伦理委员会批准，并已从所有患者或其父母/法定监护人（S-370/2011）以及健康对照者（S-046/2009）处获得书面知情同意。
注意：以下方案描述了中性粒细胞丝氨酸蛋白酶（NSPs）活性的样品制备与定量方法。本文所述实验流程主要针对人痰液中中性粒细胞弹性蛋白酶14,20,21（NE）或组织蛋白酶G15（CG）活性的测定。然而，通过对样品制备方案进行轻微调整，也可实现对血液来源细胞及肿瘤组织匀浆的分析。此外，通过特异性的FRET探针，同样可对基质金属蛋白酶12及组织蛋白酶S的活性进行类似检测22,23,24,25,26。
1. 样品制备：细胞分离与上清液分离
注意：尽可能在咳痰后120分钟内对痰液进行处理，并在进一步处理前将痰液置于冰上保存。
<ol>
	<li>若无法自发咳出痰液，则按照先前所述方法诱导痰液19。简言之，在开始诱导痰液前，先吸入200 µg的β-2受体激动剂沙丁胺醇。随后，使用雾化器吸入高渗（6%）生理盐水溶液15分钟。将咳出的痰液收集至培养皿中。</li>
	<li>借助移液器吸头，将黏液团块与唾液分离，并置于培养皿中。</li>
	<li>称量黏液。 
	注意：黏液样本的平均重量为0.8 g（范围在0.1 g至5 g之间）；通常0.1 g已足以进行上述操作。</li>
	<li>向痰液中加入4倍体积（v/w）的10% Sputolysin（溶于PBS中）（例如：每克痰液加入4 mL的10% Sputolysin）。 
	警告：Sputolysin由磷酸盐缓冲液中的高浓度二硫苏糖醇组成，操作时需格外小心。</li>
	<li>将混合物在室温（RT）下置于摇床上振荡孵育15分钟，以溶解黏液。出于安全考虑，应将摇床置于通风橱内。</li>
	<li>通过加入等体积的冷PBS（例如：每1 mL 10% Sputolysin加入1 mL冷PBS）终止反应。</li>
	<li>通过移液混匀，获得均一溶液。</li>
	<li>将混合液经100 µm尼龙细胞滤网过滤至50 mL离心管中。</li>
	<li>重复过滤步骤，使用40 µm尼龙细胞滤网再次过滤。</li>
	<li>在4 °C条件下，以300 × g离心10分钟。</li>
	<li>小心将上清液转移至新离心管中，并置于冰上保存。 
	注意：上清液可于-20 °C或-80 °C保存，直至进一步分析。</li>
	<li>用500 µL冷PBS轻柔重悬细胞沉淀，并置于冰上。 
	注意：细胞组分必须立即处理。</li>
</ol>
2. 中性粒细胞丝氨酸蛋白酶活性测定
注意：此处介绍了利用FRET探针定量NSPs活性的不同方法。技术的选择取决于具体的生物医学问题和实验目的。所介绍的探针已针对一组与肺相关的酶进行了广泛特异性验证14,15。尽管这些探针对其靶标酶具有特异性，但仍需始终在感兴趣的临床样本上验证探针的特异性。可通过在添加探针前将样本与特异性蛋白酶抑制剂共同孵育来实现验证，该处理应能消除D/A比值的任何升高。
<ol>
	<li>通过荧光计或酶标仪检测可溶性中性粒细胞丝氨酸蛋白酶（NSPs）活性
	 
	​注意：样品可溶性组分中的蛋白酶活性可使用任何具备荧光检测能力的仪器进行检测。
	<ol>
		<li>将酶置于冰上解冻。</li>
		<li>在使用前，将中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）和组织蛋白酶G（CG）保存于酸性储存缓冲液（50 mM 醋酸钠，200 mM NaCl，pH 5.5）中，以防止其发生自切割。</li>
		<li>为建立酶标准曲线，使用活化缓冲液（10 mM Tris-HCl，500 mM NaCl，pH 7.5）对酶进行1:2倍比稀释（NE：33.9 – 0.271 nM；CG：42.6 – 0.333 nM）。活化缓冲液为中性pH，可有效促进酶催化反应的进行。
		<ol>
			<li>为配制最高浓度标准品（NE浓度：33.9 nM），将1 µL NE（33.9 µM）加入999 µL活化缓冲液中进行稀释。</li>
			<li>为配制第二级标准品（NE浓度：16.95 nM），将200 µL第一级稀释液与200 µL活化缓冲液混合。</li>
			<li>依此类推，制备后续的1:2倍比稀释液。</li>
			<li>最后一级标准品为空白对照，仅含纯活化缓冲液。建议对技术重复样本进行双复孔或三复孔检测。在标准品与样品制备过程中，尽量将离心管置于冰上。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在进行标准品制备的同时，使用活化缓冲液对痰液样品进行稀释。为确保检测信号（供体/受体比值）的增加处于线性范围内，在测定其蛋白酶活性前需对人源样品进行稀释。若患者样品未经稀释，底物切割速度过快，将导致无法进行可靠的数据拟合。由于健康供体痰液中活性蛋白酶含量低于囊性纤维化（CF）和慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者，通常采用不同稀释倍数（健康痰液上清：1:10；COPD或CF患者痰液上清：1:20–500）。
		 
		注意：为定量测定蛋白酶浓度未知样品中的酶活性，需在同一实验板上平行测定已知酶浓度的标准曲线。人源痰液中活性酶的浓度通过将样品测得的斜率与标准曲线斜率进行插值计算获得。</li>
		<li>在准备检测样品前，预先设置仪器参数。将NE FRET探针（NEmo-114）的激发波长设为354 nm，检测波长设为供体400 nm、受体490 nm；将CG FRET探针（sSAM15）的激发波长设为405 nm，发射波长设为485 nm（供体）和580 nm（受体）。</li>
		<li>向黑色96孔半面积板的各孔中加入40 µL样品、标准品或空白对照。</li>
		<li>为配制含报告分子的主混合液（主混合液中报告分子终浓度为10 µM），将探针原液（1 mM，DMSO中）用活化缓冲液1:100稀释。根据所需孔数计算主混合液总体积（10 µL × 所需孔数）。为达到荧光检测的最佳终浓度（2 µM），向每孔（含40 µL样品、标准品或空白）中加入10 µL主混合液，并立即开始读数。NEmo-1和sSAM探针将分别用于监测可溶性中性粒细胞弹性蛋白酶和组织蛋白酶G的活性。
		 
		​注意：若无试剂加样器，应在加入报告分子后尽快开始读数，以减少信号损失。</li>
		<li>启动酶标仪检测，每60–90秒记录一次供体/受体比值，持续至少20分钟，或直至信号增长达到平台期。</li>
		<li>导出数据后，通过将每个时间点和样品的供体相对荧光单位（RFU）除以受体RFU，计算供体/受体比值（D/A比值）。</li>
		<li>计算各样品D/A比值的均值与标准差。</li>
		<li>确定D/A比值在线性增长阶段的斜率。该斜率反映FRET探针对酶切割速率的响应。通过将人源样品测得的线性回归斜率与酶标准曲线斜率进行拟合，计算痰液中活性酶的浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过荧光计或酶标仪检测膜结合型中性粒细胞丝氨酸蛋白酶（NSPs）活性
	<ol>
		<li>按前述方法分离痰液细胞。将3 × 104个细胞重悬于40 µL PBS中，并加入酶标仪检测孔中。</li>
		<li>设置仪器参数。将膜结合型NE FRET探针（NEmo-214）的激发波长设为405 nm，检测波长设为供体485 nm、受体580 nm；将膜结合型CG FRET探针（mSAM15）的激发波长设为405 nm，发射波长设为485 nm（供体）和580 nm（受体）。</li>
		<li>为配制含报告分子的主混合液，将探针原液用活化缓冲液稀释至10 µM。根据所需孔数计算主混合液总体积（10 µL × 所需孔数）。为达到NEmo-2和mSAM探针荧光检测的最佳终浓度（2 µM），向每孔（含40 µL样品、标准品或空白）中加入10 µL主混合液，并立即开始读数。NEmo-2和mSAM探针将分别用于监测膜结合型中性粒细胞弹性蛋白酶和组织蛋白酶G的活性。
		 
		注意：可使用细胞阴性对照，例如不主动分泌NSPs的细胞。例如，将报告分子与3 × 104个HL-60早幼粒细胞共同孵育，可作为有效的切割阴性对照。</li>
		<li>记录供体/受体比值变化，持续至少20分钟，或直至信号增长达到平台期。数据分析方法同上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过荧光显微镜检测膜结合型中性粒细胞丝氨酸蛋白酶（NSPs）活性
	<ol>
		<li>确定需分析的实验条件数量。
		 
		​注意：每次痰液样品检测时，建议同时制备并分析阳性对照（PC）和阴性对照（NC）。</li>
		<li>每次检测时，将3 × 104个痰液细胞重悬于1.5 mL离心管中的50 µL PBS中。</li>
		<li>作为阴性对照，将痰液细胞与特异性抑制剂（Sivelestat，特异性NE抑制剂；或组织蛋白酶G抑制剂I，特异性CG抑制剂）共同孵育，终浓度为100 µM，室温孵育10分钟。</li>
		<li>作为阳性对照，将痰液细胞与相应酶（NE：340 nM；CG：200 nM）共同孵育10分钟，室温。</li>
		<li>向各离心管（阳性对照处理细胞、阴性对照处理细胞及未处理细胞）中加入含FRET报告分子和细胞核染料（终稀释倍数1:1000）的PBS溶液50 µL，使探针终浓度为2 µM。室温孵育10–20分钟。
		 
		重要提示：加入细胞核染料有助于荧光显微镜成像，可在不使用FRET探针通道的情况下定位目标痰液细胞，从而避免报告分子光漂白。此外，DNA染色可依据细胞核形态对痰液细胞进行分割。例如，中性粒细胞可通过其多叶核被轻易识别。同时，还可获取有关细胞活力的额外信息（核分叶更明显的中性粒细胞更可能存活）。
		 
		​注意：除膜结合型外，还可通过H-NE和H-CG（可结合细胞外DNA的FRET探针27）以相同方法检测人源痰液中DNA结合型NE或CG的活性。配制主混合液时，可将H-NE和H-CG以10 µM浓度加入，并在细胞离心涂片和载玻片制备前与痰液共同孵育。细胞外DNA上D/A比值的定量方法与NEmo-2和mSAM相同，唯一区别在于对细胞外DNA聚集体而非单个细胞进行分割27。</li>
		<li>加入100 µL预冷PBS终止反应，并将样品置于冰上。</li>
		<li>将混合液通过细胞离心涂片仪沉积于显微镜载玻片上，空气干燥，用预冷甲醇（10%）固定10分钟，再次空气干燥，最后用合适的封片剂封片。
		 
		​注意：制备好的显微镜载玻片可在4 °C避光条件下保存最多一个月，待后续分析。</li>
		<li>使用共聚焦显微镜配合PL APO 40x或63x油镜进行图像采集。为提高图像质量并缩短采集时间，建议采用顺序成像模式。
		<ol>
			<li>首先使用氦氖激光（633 nm激发）采集细胞核染料信号，检测波长为650–715 nm。</li>
			<li>使用氩离子激光（458 nm激发）采集FRET报告分子供体（香豆素343）信号，检测波长为470–510 nm；在仅激发供体的条件下，采集敏化受体（5,6-TAMRA）发射信号，检测波长为570–610 nm。</li>
			<li>使用二极管泵浦固态（DPSS）激光器（561 nm激发）在独立通道中采集受体直接发射信号，检测波长为470–510 nm。</li>
			<li>在实验开始时设定针孔大小，并在整个成像过程中保持不变。
			 
			​注意：由于中性粒细胞体积较小，建议使用40x或63x物镜以实现清晰成像。通常按从长波长到短波长的顺序依次采集多个通道图像，以避免成像过程中报告分子的光漂白。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>每种实验条件至少采集100个细胞，以确保统计学意义。使用合适的图像分析软件进行显微图像分析：对细胞进行分割，并逐像素计算D/A比值，随后计算由用户手动选定的感兴趣区域的均值或中位数。代表性结果见图1。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="荧光显微镜，D/A 比值成像，抑制剂效应，箱形图分析，细胞研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62193/62193fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：从囊性纤维化（CF）患者痰液中分离的中性粒细胞膜结合型中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）活性的代表性图像及定量分析。 a) 在加入报告分子 NEmo-2（2 µM）前，中性粒细胞预先孵育（上图）或未孵育（下图）100 µM Sivelestat 10 分钟的代表性共聚焦显微镜图像。从左起第一列为细胞核染色，第二列为供体通道，第三列为受体通道，最后一列为通过逐像素计算供体与受体通道比值得到的 D/A 比值。感兴趣区域（单个中性粒细胞）的边界以虚线表示。标尺（10 µm）和校准条（D/A 比值）已标明。 b) 箱形图与散点图显示一名代表性 CF 患者痰液中性粒细胞的 D/A 比值。经抑制剂处理的细胞和未处理细胞分别以灰色和蓝色表示。每个点代表一个细胞（N：含抑制剂 = 113，无抑制剂 = 96）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62193/62193fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="4">
	<li>通过流式细胞术测量膜结合型中性粒细胞丝氨酸蛋白酶（NSPs）活性
	<ol>
		<li>将 1 × 106 个细胞重悬于 100 µL PBS 中，置于 5 mL FACS 聚苯乙烯圆底管内，并将试管置于冰上。</li>
		<li>为圈选痰液中性粒细胞，使用以下抗体：CD14（1:50）、CD16（1:50）、CD45（1:33）和 CD66b（1:50）。为所有样本配制足够量的混合抗体工作液，并在避光条件下置于冰上保存。</li>
		<li>按照图2中所述设置圈门策略。中性粒细胞定义为 7AAD-CD45+CD14-CD16+CD66b+ 的细胞事件。对圈选后的细胞事件进一步分析其供体（λexc = 405 nm，λem = 450/50 nm）和受体（λexc = 405 nm，λem = 585/42 nm）的平均荧光强度（MFIs），以评估膜结合型蛋白酶的活性。</li>
		<li>向每个样本中加入 2 µL FcBlock，室温孵育 5 分钟。</li>
		<li>向每根试管中加入选定的抗体，避光冰上孵育 30 分钟。</li>
		<li>加入 2 mL 冷 PBS 洗涤细胞，在 4 °C 条件下以 300 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞重悬于 200 µL 冷 PBS 中。</li>
		<li>将 200 µL 细胞悬液均分至两根试管中，每管 100 µL，并向每管加入 5 µL 细胞活力染色液。将试管置于冰上。</li>
		<li>向阴性对照（NC）试管中加入适当的特异性 NSP 抑制剂（针对中性粒细胞弹性蛋白酶 NE，使用终浓度为 225 µM 的 Sivelestat；针对组织蛋白酶 G CG，使用终浓度为 100 µM 的 cathepsin G Inhibitor I）。样本在避光条件下室温孵育 10 分钟。</li>
		<li>向样本中加入 100 µL 冷 PBS，并通过 40 µm 滤膜过滤至洁净的 FACS 管中，以防止仪器堵塞。</li>
		<li>向 NC 样本中加入报告探针（针对 NE，使用终浓度为 4 µM 的 NEmo-2；针对 CG，使用终浓度为 2 µM 的 mSAM），轻轻涡旋混匀试管。</li>
		<li>开始采集经特异性抑制剂孵育的细胞样本，必要时可微调圈门及报告探针 PMT 的电压。</li>
		<li>至少记录 1000 个中性粒细胞。样本保持室温状态。 
		​注意：尽管可采集更多细胞事件，但 1000 个细胞可在统计学合理性和采集时间之间达到良好平衡。</li>
		<li>按相同步骤处理后续试管（未经处理的痰液样本）。</li>
		<li>为记录因膜结合型蛋白酶活性引起的供体/受体（D/A）比值变化，每隔 5 至 10 分钟从每根试管中记录 1000 个中性粒细胞。 
		​注意：FRET 报告探针成功切割后，供体通道的平均荧光强度（MFIs）将随时间逐渐增强；受体通道的 MFIs 强度应随时间降低或保持不变。</li>
		<li>通过将供体通道数值除以受体通道数值，计算门控后活单个中性粒细胞样本的 FRET 比值。</li>
		<li>将样本测量值除以对应 0 分钟时间点的数值进行归一化处理（代表性结果与分析见图2）。 
		​注意：为动态测量 D/A 比值的变化，至少需记录两个时间点（例如 0 和 10 分钟）的数据。为归一化每个样本的活性测量值，将后续时间点（如 10 分钟）测得的 D/A 比值除以探针加入后立即测得的比值（0 分钟）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="细胞流式细胞术分析：FSC-SSC图、CD标记物、抑制剂图表、数据表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62193/62193fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：通过囊性纤维化（CF）患者痰液中分离的中性粒细胞检测膜结合型中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）活性的设门策略及代表性图谱。 a) 为设门痰液中性粒细胞，使用以下抗体：CD14（1:50）、CD16（1:50）、CD45（1:33）和CD66b（1:50）。中性粒细胞定义为7-AAD-CD45+CD14-CD16+CD66b+ 事件。对设门后的细胞事件分析其供体（λexc= 405 nm，λem= 450/50 nm）和受体（λexc= 405 nm，λem= 585/42 nm）的平均荧光强度（MFI）。 b) 囊性纤维化（CF）痰液中性粒细胞膜结合型NE活性的代表性直方图。左列为供体信号，右列为受体信号。首行显示在加入报告分子前用西维来司他（Sivelestat）处理10分钟的细胞的平均荧光强度；末行显示未经处理（w/o）的细胞，在加入报告分子后立即（0分钟，灰色）和10分钟后（蓝色）测量其报告分子荧光。中性粒细胞的设门依据a图所示策略进行。 c) 数据表显示一组代表性数据，包括在多个时间点（0-3-5-10-15-20 min）测得的中性粒细胞供体与受体信号的原始MFI值，以及计算所得的D/A比值。D/A比值可进行归一化处理，例如以0分钟时间点为基准（白色字体）。0分钟表示在将报告分子加入含染色痰细胞的流式管后尽快进行的记录。MFI数据以1000个中性粒细胞的均值±标准差表示。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62193/62193fig2v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本文报道的实验方案介绍了定量检测人痰液样本中中性粒细胞弹性蛋白酶和组织蛋白酶G活性的不同方法。成功测定酶活性的关键要点包括：i）操作步骤的精确计时与标准化；ii）可靠阴性对照和阳性对照的使用。若满足上述条件，所述方法不仅限于痰液样本，还可轻松适用于血液、支气管肺泡灌洗液以及组织切片或匀浆中蛋白酶活性的分析。
这三种技术各有优势与局限性，且常常相互补充。例如，流式细胞术能够快速分析稀有细胞群体以及进行细胞表型鉴定，但缺乏显微镜技术所能提供的空间分辨信息。而酶标仪检测则允许以高通量方式平行评估多个样本或条件。由于新鲜痰液细胞无法冷冻保存，因此这三种方法均要求样本在咳出后需迅速处理。这限制了膜结合活性检测的灵活性和通量。若能建立一种在加入探针并完成酶切反应后即可固定细胞的流式细胞术方案，将有望实现更多样本管的平行检测。此外，必须特别注意FRET探针的处理与保存。事实上，肽底物中某些氨基酸（如甲硫氨酸）易发生氧化，导致报告分子的灵敏度下降。为延长报告分子的保存期限（在20 °C下估计约为&#160;三个月），可将其分装为小体积（1–2 µL）并在惰性气体（如氮气或氩气）环境中储存。
在囊性纤维化（CF）及其他慢性炎症性肺部疾病中，尽早检测出炎症至关重要，而可靠的生物标志物有望实现这一目标。检测表面结合型中性粒细胞丝氨酸蛋白酶（NSPs）活性的可能性——即使在游离中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）活性极少或不存在的情况下，该活性仍被证实对周围组织具有损害作用——提供了另一层次的重要信息，而现有其他方法难以实现这一点4,11。
这些报告基因可用于研究膜结合相关NSP活性与肺部疾病严重程度及进展之间的关联，尤其是在疾病早期阶段。该方法可用于监测治疗效果（例如抗炎治疗或高效CFTR调节剂和增效剂28），并探究中性粒细胞驱动的炎症反应由此受到的抑制作用。此外，这些实验方案基于非侵入性采样程序，对患者风险极低，因此可广泛应用于多种令人期待的研究领域。

中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）、组织蛋白酶G（CG）、蛋白酶3（PR3）和中性粒细胞丝氨酸蛋白酶4（NSP4）是四种中性粒细胞丝氨酸蛋白酶（NSPs）1。它们与髓过氧化物酶一起储存在中性粒细胞的初级颗粒或嗜天青颗粒中。由于这些颗粒具有较高的蛋白水解活性，其分泌受到严格调控，中性粒细胞必须依次接受启动和激活刺激才能释放其内容物2。
在吞噬溶酶体内，中性粒细胞丝氨酸蛋白酶（NSPs）发挥细胞内杀菌剂的作用3。当被分泌到胞外时，NSPs 成为强烈的炎症介质：它们可切割细胞因子和表面受体，激活多条促炎信号通路3。重要的是，炎症状态下 NSPs 的分泌失去控制。例如，在炎症气道中，过量的弹性蛋白酶（NE）活性可导致黏液过度分泌、杯状细胞化生、CFTR 失活以及细胞外基质重塑4,5。组织蛋白酶 G（Cathepsin G, CG）也参与炎症反应：它特异性切割并激活白细胞介素-1 家族的两个成员，IL-36α 和 IL-36β6。与 NE 协同作用时，CG 可切割气道上皮细胞上的蛋白酶激活受体，并激活 TNF-α 和 IL-1β。
内源性抗蛋白酶，如α-1-抗胰蛋白酶、α-1-抗糜蛋白酶和分泌型白细胞蛋白酶抑制剂，可调节中性粒细胞弹性蛋白酶和组织蛋白酶G的活性5。然而，在肺部疾病进展过程中，蛋白酶的持续分泌在化学计量上超过了抗蛋白酶屏障，导致气道中中性粒细胞持续增多、炎症加重以及组织损伤5,7。尽管患者气道可溶性组分中弹性蛋白酶（NE）的浓度和活性已被证明是疾病严重程度有前景的生物标志物8，但NE和CG还可通过静电相互作用与中性粒细胞质膜及细胞外DNA结合9,10，在此状态下它们对抗蛋白酶的可及性降低。重要的是，临床前研究已明确，与可溶性蛋白酶相比，细胞表面相关蛋白酶活性出现得更早和/或独立发生4,11。事实上，游离蛋白酶活性需首先突破抗蛋白酶屏障才可被检测到；而在细胞表面，由于大分子抑制剂难以接近细胞质膜，膜结合的蛋白酶活性至少部分得以保留12。这种复杂的蛋白酶行为对中性粒细胞介导的炎症起始与传播具有重要影响，因此需要借助精确且信息丰富的工具加以研究。
多年来，基于荧光共振能量转移（FRET）的探针作为高效且快速评估人体样本中特定蛋白酶活性的工具，在生物医学领域得到了广泛应用13。蛋白酶报告探针的功能依赖于识别基序（即一段肽序列），该基序可被目标酶识别，并利用FRET这一物理过程：在激发时，供体荧光基团将能量转移至受体分子。当酶对报告探针进行加工，即切割识别部分后，受体分子会从供体附近扩散离去；因此，酶的活性可通过供体与受体荧光信号随时间变化的比值进行测量。这种检测方式具有自归一化和比率化的特点，因而受pH值、探针局部浓度等环境因素的影响极小。NEmo-114 和 sSAM15 是分别特异性报告中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）和组织蛋白酶G（CG）活性的FRET探针。然而，这类探针无法特异性地定位于任何细胞区室，因此主要用于监测人体体液中存在的蛋白酶活性。为了实现对蛋白酶活性的空间特异性监测，我们及其他研究者开发了通过分子标签与亚细胞结构结合的FRET探针14,15,16,17,18,19。这种合成策略促成了NEmo-2和mSAM的开发，二者均为携带脂质锚定结构的FRET探针，可定位于质膜。这些报告探针推动了对囊性纤维化和慢性阻塞性肺疾病中NE与CG蛋白酶功能的深入理解14,15。
本文提供了利用FRET探针NEmo和SAM系列对人类痰液中可溶性及膜结合型NE和CG活性进行可视化与定量的详细方案。为探讨中性粒细胞丝氨酸蛋白酶（NSPs）病理生理学的多个方面，并根据使用者的具体需求提供一系列可选方法，本文展示了通过荧光光谱、荧光显微镜和流式细胞术进行分析的操作流程。

<table><tbody><tr><td>100 &amp;micro;m 尼龙细胞滤网</td><td>Corning Inc.</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>2300 EnSpire（多功能酶标仪）</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35x10 mm 培养皿，Nunclon Delta</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150318</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m 尼龙细胞滤网</td><td>Corning Inc.</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Sarstedt</td><td>10535253</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD，活率染料</td><td>Bio Legend</td><td>420404</td><td>5 &amp;micro;L/100 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>天平</td><td>OHAUS Instruments (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>PR124</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 圆底试管 5 mL</td><td>BD Bioscience</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>BD LSRFortessa 细胞分析仪</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>黑色平底 96 孔半面积板</td><td>Corning Life Science</td><td>3694</td><td></td></tr><tr><td>组织蛋白酶 G</td><td>Elastin Products Company</td><td>SG623</td><td></td></tr><tr><td>组织蛋白酶 G 抑制剂 I</td><td>Merck KGaA</td><td>219372</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5418R 离心机</td><td>Eppendorf AG</td><td>EP5401000137</td><td></td></tr><tr><td>Combitips advanced 1.0 mL 吸头</td><td>Eppendorf AG</td><td>0030 089 430</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete 蛋白酶抑制剂</td><td>Roche</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>改进型 Neubauer 计数板</td><td>Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH &amp;amp; Co KG</td><td>40442</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片 &amp;Oslash; 25 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MENZCB00250RA003</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 4 细胞离心涂片机</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5（细胞核染色剂）</td><td>BioStatus Limited</td><td>DR50050</td><td>1:10000</td></tr><tr><td>FACSDiva 软件，v8.0.1</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FcBlock</td><td>BD Bioscience</td><td>564219</td><td></td></tr><tr><td>Fiji（Fiji 即 ImageJ）</td><td>fiji.sc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow Jo 软件，v10</td><td>TreeStar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FluoQ 插件，v3-97</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Megafuge 16R 离心机</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>人痰白细胞弹性蛋白酶</td><td>Elastin Products Company</td><td>SE563</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 共聚焦显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini Rock-Shaker 摇床</td><td>PEQLAB Biotechnologie GmbH</td><td>MR-1</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD14，Pe-Cy7，克隆 M5E2</td><td>BD Bioscience</td><td>557742 批号：8221983</td><td>1:50</td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD16，AF700，克隆 3G8</td><td>BD Bioscience</td><td>557820 批号：8208791</td><td>1:50</td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD45，APC-Cy7，克隆 2D1</td><td>BD Bioscience</td><td>557833 批号：8059688</td><td>1:33</td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD66b，PE/Dazzel 594，克隆 G10F5</td><td>BioLegend</td><td>305122 批号：B241921</td><td>1:50</td></tr><tr><td>mSAM</td><td>本实验室制备</td><td></td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Multipette plus 移液器</td><td>Eppendorf AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEmo-1</td><td>SiChem</td><td>SC-0200</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>NEmo-2E</td><td>SiChem</td><td>SC-0201</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Pari Boy SX 配 LC Sprint 喷射式雾化器</td><td>Pari</td><td>085G3001</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>ROTI Histokitt（封片介质）</td><td>Carl Roth GmbH + Co.KG</td><td>6638.1</td><td></td></tr><tr><td>沙丁胺醇</td><td>Teva GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>西维列司他</td><td>Cayman Chemicals</td><td>17779</td><td></td></tr><tr><td>Sputolysin</td><td>Calbiochem</td><td>560000-1SET</td><td></td></tr><tr><td>sSAM</td><td>本实验室制备</td><td></td><td>2 mM</td></tr><tr><td>SuperFrost Plus 黏附载玻片</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10149870</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr></tbody></table>

监测人类痰液样本中中性粒细胞弹性蛋白酶和组织蛋白酶g的活性

Monitoring Neutrophil Elastase and Cathepsin G Activity in Human Sputum Samples

蛋白酶调控着无数的生理过程，其活性的精确研究仍然是一个引人入胜的生物医学挑战。在人类基因组编码的大约600种蛋白酶中，中性粒细胞丝氨酸蛋白酶（NSPs）因其在包括呼吸系统疾病在内的炎症性疾病发生和发展中的作用而受到广泛研究。独特的是，分泌的NSPs不仅在细胞外液中扩散，还能定位于质膜。在中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）形成过程中，NSPs成为分泌染色质的组成部分。这种复杂的行为使得理解NSPs的病理生理学变得极具挑战性。本文展示了详细的实验方案，用于在痰液样本中可视化、定量并区分游离型和膜结合型中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）与组织蛋白酶G（CG）的活性。NE和CG是NSPs家族成员，其活性在囊性纤维化（CF）和慢性阻塞性肺疾病（COPD）的发病机制中具有多效性作用：它们促进组织重塑、调控下游免疫反应，并与肺部疾病的严重程度相关。该方案展示了如何分离痰液中的液体组分和细胞组分，以及从中分离中性粒细胞，进而利用基于小分子Förster共振能量转移（FRET）的报告系统定量酶活性。为了深入理解NE和CG活性的相对作用，可通过不同技术测量FRET信号：i）体外微孔板读数技术可实现蛋白酶活性的高通量和整体检测；ii）共聚焦显微镜可在时空上解析细胞表面膜结合活性；iii）小分子FRET流式细胞术可通过单细胞水平的蛋白酶活性定量和表型分析，快速评估抗炎治疗效果。这些方法的应用为探索NSPs的病理生物学特性及其作为CF和COPD疾病严重程度生物标志物的潜力打开了新的途径。鉴于这些技术具备标准化潜力、结果稳健且易于转移，所描述的方法可立即在科研和诊断实验室之间共享并推广应用。

如图1a所示的结果展示了一个典型的显微镜数据集。通过中性粒细胞特有的分叶状细胞核来识别中性粒细胞的细胞核信号。感兴趣区域（ROI）通过手动选择（图1a中的虚线所示）。D/A 比值图像通过逐像素将供体通道的强度除以受体通道的强度计算得到。最后一步是计算每个细胞（ROI）的平均 D/A 比值。图1b中每个点代表一个 ROI（中性粒细胞）的平均值。建议每种实验条件下成像并分析约100个细胞。
典型的流式细胞术设门策略如图2a所示。该设门策略可用于区分和研究痰液中性粒细胞。为避免荧光溢出或补偿伪影，建议使用单独的激光通道（例如蓝色激光）检测FRET探针的荧光信号。流式细胞术的荧光补偿应针对抗体进行，而不应对FRET探针进行补偿。图2b显示了加入报告分子后0和10分钟时MFI的分布情况。图2c中的每一行表示1000个痰液中性粒细胞的供体和受体MFI平均值。D/A比值通过将供体MFI除以受体MFI计算得出。右侧图2c中的时间进程显示了测量结果的变化趋势：D/A比值在初始阶段迅速上升，随后达到平台期，这与膜结合酶的活性一致。

本文所述方案提供了可视化和定量人类痰液中中性粒细胞蛋白酶活性的指南。此类分析的应用范围广泛，包括抗炎治疗的评估、生物标志物验证、药物筛选以及大规模队列临床研究。

监测人类痰液样本中中性粒细胞弹性蛋白酶和组织蛋白酶G的活性

蛋白酶是无数生理过程的调控因子，其活性的精确研究仍是引人入胜的生物医学课题……

我们的FRET探针和实验方案能够快速、灵敏地定量检测中性粒细胞性气道疾病患者痰液中游离及表面结合的弹性蛋白酶和组织蛋白酶G的活性。这些方法使得研究人员能够探索蛋白酶病理生理学的不同方面。使用酶标仪进行检测可实现大规模筛查。共聚焦显微镜可实现亚细胞分辨率下酶活性的可视化。而流式细胞术则能够以个体化方式实现单细胞表型分析和蛋白酶活性的定量。该技术可拓展应用于多种气道疾病，如囊性纤维化、支气管扩张或慢性阻塞性肺疾病（COPD）。该方法可适用于不同的生物样本，如血液、支气管肺泡灌洗液或小鼠样本。在开始痰液诱导程序之前，吸入200微克的β2受体激动剂沙丁胺醇。随后，使用雾化器吸入6%高渗盐水溶液15分钟。将咳出的痰液收集到培养皿中。借助移液器吸头，将黏液团块与唾液分离，并放入另一培养皿中。称量黏液重量，然后按每份重量加入四倍体积的10% Sputolysin和PBS溶液。将混合物在室温下置于摇床中孵育15分钟，以溶解黏液。每毫升10% Sputolysin加入一毫升冷PBS终止反应。用移液器吹打混合物，获得均一溶液。将混合物通过100微米尼龙细胞滤网过滤至50毫升离心管中。再通过40微米滤网重复过滤一次，然后在4摄氏度下以300 × g离心10分钟。将上清液转移至新的离心管中，并置于冰上保存。将细胞沉淀轻轻重悬于 500 µL 冷 PBS 中，并置于冰上。在冰上融化酶液，并按照文本稿件中的描述制备酶标准曲线。在制备标准曲线的同时，用活化缓冲液稀释痰液样本。在酶标仪上，将NE FRET探针NEmo-1的激发波长设置为354纳米，供体发射波长设置为400纳米，受体发射波长设置为490纳米。对于CG FRET探针sSam，激发波长设置为405纳米，供体发射波长设置为485纳米，受体发射波长设置为580纳米。向黑色96孔半面积板的孔中加入40微升样品、标准品或空白溶液，然后加入预混液。启动酶标仪，每隔 60 至 90 秒记录一次供体与受体的荧光强度比值，持续至少 20 分钟，或直至信号增长达到平台期。导出数据后，通过将每个时间点和样品的供体 RFU 除以受体 RFU，计算供体与受体的比值。然后计算供体与受体比值的平均值和标准偏差。确定供体与受体比值在线性生长期的变化斜率。每次测量时，将30,000个痰细胞重悬于1.5毫升离心管中50微升PBS缓冲液内。将痰细胞分别与特异性抑制剂（作为阴性对照）和适当的酶（作为阳性对照）在室温下孵育10分钟。向每根试管中加入含有FRET探针和核染料的50微升PBS，使终浓度为2微摩尔。室温孵育10至20分钟。加入100微升预冷PBS终止反应，并将样品置于冰上。将混合物用细胞离心涂片机涂布于显微镜载玻片上。然后在空气中干燥，并用预冷的10%甲醇固定细胞10分钟。固定后，再次于空气中干燥，并用适当的封片介质封片。使用共聚焦显微镜采集图像。每种条件下至少采集100个细胞以获得具有统计学意义的结果。将100万细胞重悬于100 µL PBS中，置于5 mL FACS聚苯乙烯圆底管内，并将试管置于冰上。向每个样品中加入两微升 FC 封闭液，然后在室温下孵育五分钟。向每根试管中加入抗体，并在冰上避光孵育 30 分钟。用两毫升预冷的PBS洗涤细胞，在300 × g、4 °C条件下离心。最后，重悬于200微升PBS中。将悬液均分为两管，每管100微升，并加入5微升细胞活力染料。向阴性对照管中加入适量的特异性NSP抑制剂，在室温避光条件下孵育10分钟。向样品中加入PBS，并通过40微米滤膜过滤至洁净的FACS管中。向阴性对照样品中加入报告分子，并轻轻涡旋混匀。开始采集用该特异性抑制剂孵育的细胞，如有必要，可轻微调整门控以及报告通道光电倍增管（PMT）的电压。为记录由于膜结合蛋白酶活性引起的供体与受体比值的变化，每隔5至10分钟从每根试管中记录1000个中性粒细胞。通过将门控后活单个中性粒细胞样本的供体通道信号值除以受体通道信号值，计算FRET比值。此处显示的是中性粒细胞在加入报告分子 NEmo-2 前经 100 µM Sivilestat 预孵育或未经处理的图像。利用细胞核信号根据中性粒细胞特征性的分叶核来识别细胞，并手动选择感兴趣区域（ROI）。绘制了痰液中性粒细胞的供体与受体比值。每个点代表一个ROI的平均值。通过流式细胞术设门，可区分并研究痰液中的中性粒细胞。在加入报告分子后，观察了0分钟和10分钟时的MFI分布情况。计算了1000个痰液中性粒细胞的平均供体和受体MFI值。D/A比值在初始上升后达到平台期。健康供者的痰液诱导需要一定练习才能掌握。请记住，在咳痰前放松并吸入气溶胶10至15分钟。此外，咳出的痰液细胞应始终置于冰上，并在咳痰后尽快进行处理。我们发现，表面结合的蛋白酶活性与儿童早期肺损伤以及成年囊性纤维化（CF）患者肺部疾病的严重程度相关。因此，这些方法共同为探索蛋白酶作为中性粒细胞性气道疾病早期炎症生物标志物提供了可能。

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