监测人类痰液样本中中性粒细胞弹性蛋白酶和组织蛋白酶G的活性

我们的FRET探针和实验方案能够快速、灵敏地定量检测中性粒细胞性气道疾病患者痰液中游离及表面结合的弹性蛋白酶和组织蛋白酶G的活性。这些方法使得研究人员能够探索蛋白酶病理生理学的不同方面。使用酶标仪进行检测可实现大规模筛查。

共聚焦显微镜可实现亚细胞分辨率下酶活性的可视化。而流式细胞术则能够以个体化方式实现单细胞表型分析和蛋白酶活性的定量。该技术可拓展应用于多种气道疾病，如囊性纤维化、支气管扩张或慢性阻塞性肺疾病（COPD）。

该方法可适用于不同的生物样本，如血液、支气管肺泡灌洗液或小鼠样本。在开始痰液诱导程序之前，吸入200微克的β2受体激动剂沙丁胺醇。随后，使用雾化器吸入6%高渗盐水溶液15分钟。

将咳出的痰液收集到培养皿中。借助移液器吸头，将黏液团块与唾液分离，并放入另一培养皿中。称量黏液重量，然后按每份重量加入四倍体积的10% Sputolysin和PBS溶液。

将混合物在室温下置于摇床中孵育15分钟，以溶解黏液。每毫升10% Sputolysin加入一毫升冷PBS终止反应。用移液器吹打混合物，获得均一溶液。

将混合物通过100微米尼龙细胞滤网过滤至50毫升离心管中。再通过40微米滤网重复过滤一次，然后在4摄氏度下以300 × g离心10分钟。将上清液转移至新的离心管中，并置于冰上保存。

将细胞沉淀轻轻重悬于 500 µL 冷 PBS 中，并置于冰上。在冰上融化酶液，并按照文本稿件中的描述制备酶标准曲线。在制备标准曲线的同时，用活化缓冲液稀释痰液样本。

在酶标仪上，将NE FRET探针NEmo-1的激发波长设置为354纳米，供体发射波长设置为400纳米，受体发射波长设置为490纳米。对于CG FRET探针sSam，激发波长设置为405纳米，供体发射波长设置为485纳米，受体发射波长设置为580纳米。向黑色96孔半面积板的孔中加入40微升样品、标准品或空白溶液，然后加入预混液。

启动酶标仪，每隔 60 至 90 秒记录一次供体与受体的荧光强度比值，持续至少 20 分钟，或直至信号增长达到平台期。导出数据后，通过将每个时间点和样品的供体 RFU 除以受体 RFU，计算供体与受体的比值。然后计算供体与受体比值的平均值和标准偏差。

确定供体与受体比值在线性生长期的变化斜率。每次测量时，将30,000个痰细胞重悬于1.5毫升离心管中50微升PBS缓冲液内。将痰细胞分别与特异性抑制剂（作为阴性对照）和适当的酶（作为阳性对照）在室温下孵育10分钟。

向每根试管中加入含有FRET探针和核染料的50微升PBS，使终浓度为2微摩尔。室温孵育10至20分钟。加入100微升预冷PBS终止反应，并将样品置于冰上。

将混合物用细胞离心涂片机涂布于显微镜载玻片上。然后在空气中干燥，并用预冷的10%甲醇固定细胞10分钟。固定后，再次于空气中干燥，并用适当的封片介质封片。

使用共聚焦显微镜采集图像。每种条件下至少采集100个细胞以获得具有统计学意义的结果。将100万细胞重悬于100 µL PBS中，置于5 mL FACS聚苯乙烯圆底管内，并将试管置于冰上。

向每个样品中加入两微升 FC 封闭液，然后在室温下孵育五分钟。向每根试管中加入抗体，并在冰上避光孵育 30 分钟。

用两毫升预冷的PBS洗涤细胞，在300 × g、4 °C条件下离心。最后，重悬于200微升PBS中。将悬液均分为两管，每管100微升，并加入5微升细胞活力染料。

向阴性对照管中加入适量的特异性NSP抑制剂，在室温避光条件下孵育10分钟。向样品中加入PBS，并通过40微米滤膜过滤至洁净的FACS管中。向阴性对照样品中加入报告分子，并轻轻涡旋混匀。

开始采集用该特异性抑制剂孵育的细胞，如有必要，可轻微调整门控以及报告通道光电倍增管（PMT）的电压。为记录由于膜结合蛋白酶活性引起的供体与受体比值的变化，每隔5至10分钟从每根试管中记录1000个中性粒细胞。通过将门控后活单个中性粒细胞样本的供体通道信号值除以受体通道信号值，计算FRET比值。

此处显示的是中性粒细胞在加入报告分子 NEmo-2 前经 100 µM Sivilestat 预孵育或未经处理的图像。利用细胞核信号根据中性粒细胞特征性的分叶核来识别细胞，并手动选择感兴趣区域（ROI）。绘制了痰液中性粒细胞的供体与受体比值。

每个点代表一个ROI的平均值。通过流式细胞术设门，可区分并研究痰液中的中性粒细胞。在加入报告分子后，观察了0分钟和10分钟时的MFI分布情况。

计算了1000个痰液中性粒细胞的平均供体和受体MFI值。D/A比值在初始上升后达到平台期。健康供者的痰液诱导需要一定练习才能掌握。

请记住，在咳痰前放松并吸入气溶胶10至15分钟。此外，咳出的痰液细胞应始终置于冰上，并在咳痰后尽快进行处理。我们发现，表面结合的蛋白酶活性与儿童早期肺损伤以及成年囊性纤维化（CF）患者肺部疾病的严重程度相关。

因此，这些方法共同为探索蛋白酶作为中性粒细胞性气道疾病早期炎症生物标志物提供了可能。