Name: 内源性表达人RYR1变异体的功能表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-09T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 了解如何使用患者来源的EBV永生化B淋巴细胞和肌肉活检卫星细胞，通过Fura-2 AM监测钙稳态变化，从而评估RYR1突变的功能影响并探索潜在治疗方案。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本手稿所述工作由瑞士国家科学基金会（SNF）和瑞士肌肉基金会的资助完成。

下述方案符合西北和瑞士中部伦理委员会（Ethikkommission Nordwest- und Zentralschweiz EKNZ）的伦理指南。
1. EB病毒永生化B淋巴细胞系的制备11
<ol>
	<li>在获得知情同意后，使用经EDTA处理的无菌试管从携带RYR1突变的先证者及无突变的健康家庭成员中采集30 mL全血。 
	注意：所有溶液均需保持无菌，并在组织培养超净台中操作。</li>
	<li>通过密度梯度离心介质（例如Ficoll-Hypaque，0.077 g/L）从全血中分离单个核细胞。
	<ol>
		<li>将30 mL无菌血液置于50 mL锥形无菌离心管中。</li>
		<li>将含有密度梯度离心介质的巴斯德吸管尖端插入管底，缓慢在血液下方加入20 mL无菌密度梯度离心介质溶液。</li>
		<li>在18°–20°C条件下以900 × g离心30分钟，不设刹车。 
		&#8203;注意：单个核细胞层表现为密度梯度介质层与上层富含血小板的血浆之间的界面处一圈浑浊环状物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用无菌吸管小心吸取含有单个核细胞的界面层（约3–5 mL），并将液体转移至一个新的50 mL无菌锥形离心管中。</li>
	<li>加入20 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，在室温下以600 × g离心10分钟，弃上清后将沉淀重悬于PBS中。重复洗涤三次；此步骤可确保完全去除残留介质。</li>
	<li>最后一次洗涤后，将细胞重悬于1–2 mL组织培养基中（RPMI培养基，添加10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺以及100单位青霉素和链霉素）。将约1 × 106个单个核细胞接种至含有20 mL组织培养基的T125组织培养瓶中。</li>
	<li>用EB病毒（Epstein-Barr病毒）感染单个核细胞。
	<ol>
		<li>使用B95.8细胞系培养物的上清液（含102–103转化单位/mL，储存于-80 °C）作为EBV来源。</li>
		<li>将步骤1.5中获得的1 × 106个单个核细胞重悬于20 mL组织培养基中，并加入2 mL B95.8细胞系上清液，在环孢素A存在下（终浓度0.2 µg/mL）进行感染。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将培养瓶置于37 °C细胞培养箱中培养，允许细胞生长。一周后更换培养基。 
	注意：一旦B细胞开始增殖，会形成明显的细胞团块并快速生长，此时可进行传代扩增并冻存。</li>
	<li>从EBV永生化B淋巴细胞系中提取基因组DNA11，以确认目标突变的存在或缺失。</li>
</ol>
2. 细胞内Ca2+浓度测定
注意：可在细胞群体中使用配备磁力搅拌器和37 °C比色皿架的光谱荧光计监测EB病毒转化的B淋巴细胞系内钙离子浓度的变化。或者，也可通过荧光显微镜在单个细胞中监测Ca2+的变化。两种情况下，均需将细胞从组织培养瓶中取出，用Krebs Ringer溶液（140 mM NaCl、5 mM KCl、1 mM MgCl2、20 mM HEPES、1 mM NaHPO4、5.5 mM葡萄糖、pH 7.4，含1 mM CaCl2）洗涤两次，并进行计数。
<ol>
	<li>使用分光荧光计进行细胞群体实验11,13,14
	<ol>
		<li>将细胞重悬于Krebs Ringer溶液中，终浓度为1 × 107 个细胞/mL，并在37°C下与终浓度为5 µM的Fura-2/AM共同孵育30分钟。</li>
		<li>以900 × g离心10分钟，将细胞沉淀重悬于Krebs Ringer溶液中，浓度为2 × 106 个细胞/mL。</li>
		<li>使用配备磁力搅拌器（调至最大转速）并设定为37 °C的分光荧光计，测量荧光变化（340/380 nm比值）。</li>
		<li>实验开始前，在微量离心机中以900 × g离心5分钟，迅速将沉淀重悬于1.5 mL含0.5 mM EGTA但不含外源Ca2+的Krebs Ringer溶液中。</li>
		<li>将细胞置于3 mL玻璃分光荧光计比色皿中，记录荧光比值（激发波长340 nm/380 nm，发射波长510 nm）。</li>
		<li>待基线稳定（约30秒）后，加入选定浓度的RyR1激动剂（4-氯-间甲酚，即4-cmc），记录钙瞬变。 
		&#8203;注：4-cmc的300 mM母液用DMSO配制，作为起始试剂使用。该溶液可预先配制，分装后于-20 °C保存数月。</li>
		<li>进行不同4-cmc浓度下的实验。 
		注：应包括75 µM、150 µM、300 µM、450 µM、600 µM、750 µM至1 mM，以生成激动剂浓度与[Ca2+]变化之间的剂量-反应曲线。不同4-cmc浓度通过从母液中取适当体积直接加入含Fura-2负载细胞的比色皿中获得。例如，为达到终浓度300 µM的4-cmc，向含1.5 mL细胞的Krebs Ringer溶液比色皿中加入1.5 µL母液。对于较低激动剂浓度，应先将300 mM母液用DMSO稀释至75 mM，再取适当体积加入含1.5 mL细胞的比色皿中。</li>
		<li>向细胞中加入400 nM毒胡萝卜素（thapsigargin），以计算细胞内储存池中总Ca2+含量。记录峰值Ca2+信号。</li>
		<li>以毒胡萝卜素诱导的峰值钙信号作为100%，绘制特定4-cmc浓度所诱导的峰值钙信号与其相对比值，并构建4-cmc的剂量-反应曲线，比较先证者与健康亲属来源的细胞反应。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>单细胞实验13
	<ol>
		<li>将聚-L-赖氨酸用无菌H2O按1:10稀释，预处理玻璃盖玻片30分钟，随后在无菌细胞培养超净台内自然晾干。</li>
		<li>将EBV转化的B淋巴细胞重悬于含1 mM CaCl2的Krebs Ringer溶液中，终浓度为1 × 106 个细胞/mL，并加入终浓度为5 µM的Fura-2/AM。</li>
		<li>取1 mL细胞悬液滴加至经聚-L-赖氨酸处理的盖玻片上，在37 °C、湿润的细胞培养箱中孵育30分钟，使EBV转化的细胞在负载过程中贴附于盖玻片表面。</li>
		<li>将盖玻片放入灌流腔室，开始以2 mL/min流速灌注含1 mM Ca2+的Krebs Ringer溶液。</li>
		<li>使用倒置荧光显微镜（配备40倍油镜（数值孔径0.17）、滤光片组（BP 340/380、FT 425、BP 500/530））进行在线检测，并连接由软件控制的电荷耦合器件（CCD）相机。</li>
		<li>以固定曝光时间（340 nm和380 nm激发波长均为100 ms），每1秒采集一次图像。使用成像软件分析荧光变化，测量每个细胞在340 nm和380 nm激发波长下的平均像素值13。</li>
		<li>为实现细胞刺激，使用含12个阀门的细胞灌流刺激系统，加入不同浓度的4-cmc。冲洗阀中使用不含外源Ca2+并添加100 µM La3+的Krebs Ringer溶液，以特异性监测仅来自细胞内储存池的钙释放。</li>
		<li>按上述方法构建4-cmc浓度与[Ca2+]变化之间的剂量-反应曲线。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 从肌肉活检样本制备人源肌管10,12,15
注意：不同实验室采用不同方法获取卫星细胞来源的成肌细胞和肌管细胞。以下是巴塞尔实验室所用方法的描述。
<ol>
	<li>用无菌 PBS 冲洗肌肉活检组织以去除多余血液，并将其切成约 0.5–1 mm 的小片段。</li>
	<li>准备带有插件的 6 孔组织培养板。每孔加入 1.5 mL 人肌肉生长培养基，每个插件中加入 0.5 mL 人肌肉生长培养基。 
	注意：生长培养基的配制如下：500 mL 高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM，4.5 mg/mL），含 10% 马血清、5 ng/mL 胰岛素、3 mM 谷氨酰胺、600 ng/mL 青霉素 G 和链霉素，以及 7 mM HEPES，pH 7.4。也可使用市售的骨骼肌生长培养基。</li>
	<li>将 2–3 个小的肌肉片段放入每个插件中（图 1A），并将培养板置于细胞培养箱中（5% CO2，37 °C）。大约 8–10 天后，可见卫星细胞从肌肉活检组织中迁移出来，并附着在插件周围（图 1，B 和 C，箭头所示）。</li>
	<li>当从活检组织中释放出足够数量的细胞后（约 10–14 天），按以下步骤进行胰酶消化：
	<ol>
		<li>移除所有培养基，用 1 mL PBS 洗涤细胞一次，加入 0.5 mL 胰酶/EDTA 溶液（0.025% 胰酶和 0.01% EDTA），在 37 °C 下孵育 5 分钟。</li>
		<li>向细胞中加入 1 mL 生长培养基以中和胰酶作用，将卫星细胞转移至新的 T25 细胞培养瓶中；加入 3 mL 生长培养基，并将细胞置于细胞培养箱中（5% CO2，37 °C）。</li>
		<li>次日更换生长培养基以去除 EDTA，之后每周更换一次培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当成肌细胞融合度达到约 75% 时，进行胰酶消化并将其转移至经层粘连蛋白处理的玻璃盖玻片上。 
	注意：按比例，一个 T25 培养瓶中生长的细胞应转移至一个直径为 43 mm 的经层粘连蛋白处理的玻璃盖玻片上。该玻璃盖玻片应放置于直径为 60 mm 的组织培养皿中，内含 3 mL 生长培养基。</li>
	<li>将细胞在玻璃盖玻片上于生长培养基中继续培养，置于细胞培养箱中（5% CO2，37 °C），每周更换一次培养基。当细胞融合度达到 90% 时，更换为分化培养基，其配制如下：高糖 DMEM（4.5 mg/mL）、0.5% 牛血清白蛋白、10 ng/mL 表皮生长因子、0.15 mg/mL 肌酸、5 ng/mL 胰岛素、200 mM 谷氨酰胺、600 ng/mL 青霉素 G 和链霉素，以及 7 mM HEPES，pH 7.4。也可使用市售的分化培养基。每周更换一次分化培养基。</li>
	<li>在分化培养基中培养 7–10 天后，可见多核肌管形成。应在一周内按照下述方法检测细胞内 [Ca2+] 的变化。</li>
</ol>
4. 使用 Fura-2 测定细胞内 [Ca2+]i 比值
<ol>
	<li>将生长在玻璃盖玻片上的成肌细胞用Fura-2/AM（终浓度为5 µM）稀释于DMEM中，在37 °C下孵育30分钟。简而言之，从生长有细胞的玻璃盖玻片中移除分化培养基，加入2 mL新鲜分化培养基。从1 mM的储备液中加入10 µL Fura-2 AM，在细胞培养箱中（5% CO2，37 °C）孵育30分钟。</li>
	<li>将玻璃盖玻片转移至灌流室中，并用含2 mM CaCl2的Krebs Ringer溶液冲洗细胞。</li>
	<li>使用20倍水浸FLUAR物镜（数值孔径0.17），按照上述EBV单细胞部分所述方法进行在线[Ca2+]测定。</li>
</ol>

<ol><li>Dlamini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+RYR1+are+a+common+cause+of+exertional+myalgia+and+rhabdomyolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+Disorders%22%5BJournal%5D)">Mutations in RYR1 are a common cause of exertional myalgia and rhabdomyolysis.</a> Neuromuscular Disorders. 23 (7), 540-548 (2013).</li>
<li>Klein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+genetic+findings+in+a+large+cohort+of+patients+with+ryanodine+receptor+1+gene-associated+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">Clinical and genetic findings in a large cohort of patients with ryanodine receptor 1 gene-associated myopathies.</a> Human Mutation. 33, 981-988 (2012).</li>
<li>Robinson, R., Carpenter, D., Shaw, M. A., Halsall, J., Hopkins, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+RYR1+in+malignant+hyperthermia+and+central+core+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">Mutations in RYR1 in malignant hyperthermia and central core disease.</a> Human Mutation. 27 (20), 977-989 (2006).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+mediated+activation+of+the+skeletal+muscle+ryanodine+receptor+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ca2+ mediated activation of the skeletal muscle ryanodine receptor ion channel.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (50), 19501-19509 (2018).</li>
<li>Treves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+intracellular+Ca2%2B+transients+in+COS-7+cells+transfected+with+the+cDNA+encoding+skeletal-muscle+ryanodine+receptor+carrying+a+mutation+associated+with+malignant+hyperthermia%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Alteration of intracellular Ca2+ transients in COS-7 cells transfected with the cDNA encoding skeletal-muscle ryanodine receptor carrying a mutation associated with malignant hyperthermia.</a> Biochemical Journal. 301 (3), 661-665 (1994).</li>
<li>Nakai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+dihydropyridine+receptor+channel+activity+in+the+presence+of+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Enhanced dihydropyridine receptor channel activity in the presence of ryanodine receptor.</a> Nature. 389 (6569), 72-75 (1996).</li>
<li>Durham, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RyR1+S-nitrosylation+underlies+environmental+heat+stroke+and+sudden+death+in+Y522S+RyR1+knockin+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RyR1 S-nitrosylation underlies environmental heat stroke and sudden death in Y522S RyR1 knockin mice.</a> Cell. 133 (81), 53-65 (2008).</li>
<li>Zvaritch, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+dysregulation+in+Ryr1%28I4895T%2Fwt%29+mice+causes+congenital+myopathy+with+progressive+formation+of+minicores%2C+cores%2C+and+nemaline+rods%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Ca2+ dysregulation in Ryr1(I4895T/wt) mice causes congenital myopathy with progressive formation of minicores, cores, and nemaline rods.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21813-21818 (2009).</li>
<li>Elbaz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-allelic+expression+of+the+RyR1+p.A4329D+mutation+decreases+muscle+strength+in+slow-twitch+muscles+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Bi-allelic expression of the RyR1 p.A4329D mutation decreases muscle strength in slow-twitch muscles in mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 295, 10331-10339 (2020).</li>
<li>Censier, K., Urwyler, A., Zorzato, F., Treves, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+homeostasis+in+human+primary+muscle+cells+from+malignant+hyperthermia+susceptible+and+normal+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigations%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium homeostasis in human primary muscle cells from malignant hyperthermia susceptible and normal individuals.</a> Journal of Clinical Investigations. 101 (6), 1233-1242 (1998).</li>
<li>Girard, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-lymphocytes+from+Malignant+Hyperthermia-Susceptible+patients+have+an+increased+sensitivity+to+skeletal+muscle+ryanodine+receptor+activators%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">B-lymphocytes from Malignant Hyperthermia-Susceptible patients have an increased sensitivity to skeletal muscle ryanodine receptor activators.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (51), 48077(2001).</li>
<li>Ducreux, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ryanodine+receptor+mutations+on+interleukin-6+release+and+intracellular+calcium+homeostasis+in+human+myotubes+from+Malignant+Hyperthermia-+Susceptible+individuals+and+patients+affected+by+Central+Core+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of ryanodine receptor mutations on interleukin-6 release and intracellular calcium homeostasis in human myotubes from Malignant Hyperthermia- Susceptible individuals and patients affected by Central Core Disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (42), 43838-43846 (2004).</li>
<li>Ducreux, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+of+ryanodine+receptors+carrying+three+amino+acid+substitutions+identified+in+patients+affected+by+multi-minicore+disease+and+central+core+disease%2C+expressed+in+immortalized+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Functional properties of ryanodine receptors carrying three amino acid substitutions identified in patients affected by multi-minicore disease and central core disease, expressed in immortalized lymphocytes.</a> Biochemical Journal. 395, 259-266 (2006).</li>
<li>Tilgen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+four+novel+mutations+in+the+C-terminal+membrane+spanning+domain+of+the+ryanodine+receptor+1%3A+association+with+central+core+disease+and+alteration+of+calcium+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of four novel mutations in the C-terminal membrane spanning domain of the ryanodine receptor 1: association with central core disease and alteration of calcium homeostasis.</a> Human Molecular Genetics. 10 (25), 2879-2887 (2001).</li>
<li>Treves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+excitation-coupled+Ca2%2B+entry+induces+nuclear+translocation+of+NFAT+and+contributes+to+IL-6+release+from+myotubes+from+patients+with+central+core+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Enhanced excitation-coupled Ca2+ entry induces nuclear translocation of NFAT and contributes to IL-6 release from myotubes from patients with central core disease.</a> Human Molecular Genetics. 20 (3), 589-600 (2011).</li>
<li>Yasuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JP-45%2FJSRP1+variants+affect+skeletal+muscle+excitation+contraction+coupling+by+decreasing+the+sensitivity+of+the+dihydropyridine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">JP-45/JSRP1 variants affect skeletal muscle excitation contraction coupling by decreasing the sensitivity of the dihydropyridine receptor.</a> Human Mutation. 34, 184-190 (2013).</li>
<li>Sei, Y., Gallagher, K. L., Basile, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+ryanodine+receptor+is+involved+in+calcium+signaling+in+human+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle ryanodine receptor is involved in calcium signaling in human B lymphocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (9), 5995-6062 (1999).</li>
<li>Tegazzin, V., Scutari, E., Treves, S., Zorzato, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorocresol%2C+an+additive+to+commercial+succinylcholine%2C+induces+contracture+of+human+malignant+Hyperthermia+Susceptible+muscles+via+activation+of+the+ryanodine+receptor+Ca2%2B+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Chlorocresol, an additive to commercial succinylcholine, induces contracture of human malignant Hyperthermia Susceptible muscles via activation of the ryanodine receptor Ca2+ channel.</a> Anesthesiology. 84, 1275-1279 (1996).</li>
<li>Kushnir, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ryanodine+receptor+calcium+leak+in+circulating+B-lymphocytes+as+a+biomarker+for+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Ryanodine receptor calcium leak in circulating B-lymphocytes as a biomarker for heart failure.</a> Circulation. 138 (11), 1144-1154 (2018).</li>
<li>Zullo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+ryanodine+receptor+sequence+variants+using+a+metabolic+assay+in+immortalized+B-lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of ryanodine receptor sequence variants using a metabolic assay in immortalized B-lymphocytes.</a> Human Mutation. 30 (4), 575-590 (2009).</li>
<li>Hoppe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypermetabolism+in+B-lymphocytes+from+malignant+hyperthermia+susceptible+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Hypermetabolism in B-lymphocytes from malignant hyperthermia susceptible individuals.</a> Scientific Reports. 6, 33372(2016).</li>
<li>Monnier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homozygous+splicing+mutation+causing+a+depletion+of+skeletal+muscle+RYR1+is+associated+with+multi-minicore+disease+congenital+myopathy+with+ophthalmoplegia%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">A homozygous splicing mutation causing a depletion of skeletal muscle RYR1 is associated with multi-minicore disease congenital myopathy with ophthalmoplegia.</a> Human Molecular Genetics. 12, 1171-1178 (2003).</li>
<li>Schartner, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dihydropyridine+receptor+%28DHPR%2C+CACNA1S%29+congenital+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Dihydropyridine receptor (DHPR, CACNA1S) congenital myopathy.</a> Acta Neuropathologica. 133, 517-533 (2017).</li>
<li>Ullrich, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+of+excitation-contraction+coupling+and+excitation+coupled+Ca2%2B+entry+in+human+myotubes+carrying+CAV3+mutations+linked+to+rippling+muscle+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">Alterations of excitation-contraction coupling and excitation coupled Ca2+ entry in human myotubes carrying CAV3 mutations linked to rippling muscle disease.</a> Human Mutation. 32, 1-9 (2010).</li>
<li>Rokach, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+human+skeletal+muscle-+derived+cell+line%3A+biochemical%2C+cellular+and+electrophysiological+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Characterization of a human skeletal muscle- derived cell line: biochemical, cellular and electrophysiological characterization.</a> Biochemical Journal. 455, 169-177 (2013).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+RYR1+mutations+in+core+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Characterization of RYR1 mutations in core myopathies.</a> Human Molecular Genetics. 15, 2791-2803 (2006).</li>
<li>Klinger, W., Baur, C., Georgieff, M., Lehmann-Horn, F., Melzer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+proton+release+from+cultured+human+myotubes+to+identify+malignant+hyperthermia+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Detection of proton release from cultured human myotubes to identify malignant hyperthermia susceptibility.</a> Anesthesiology. 97, 1043-1056 (2002).</li>
</ol>

作者无任何披露信息。

本文所述方案已被多个实验室成功用于研究RYR1突变对钙稳态的影响。该方法的关键步骤涉及无菌操作、细胞培养技能与技术以及生物材料的可获得性。原则上，使用EBV永生化B淋巴细胞的方法更为简便，可用来建立含有突变型RyR1通道的细胞系。这些细胞可冷冻并长期保存于液氮中，并可在任意时间重新复苏培养。此外，研究者可选择在细胞群体水平或单细胞水平上监测钙稳态。前一种方法较为简单，无需荧光显微镜，且可在较短时间内检测来自不同个体的细胞系。其局限性在于细胞生长速度以及是否具备配备加热装置和磁力搅拌器的光谱荧光仪。作为替代方案，可采用流式细胞术结合荧光钙指示剂来测定EBV永生化B淋巴细胞中的钙流变化；通过这种方法可以确定细胞内钙浓度的变化19。若具备荧光显微镜、灌流室和微灌流系统，则单细胞成像具有更高的灵敏度，能够提供更详细的信息，包括细胞间变异、动力学分析以及参与钙释放的亚细胞区域的鉴定。后一种方法在技术上更具挑战性，且需要更多的设备支持。
使用EBV永生化B淋巴细胞具有多种优势，包括可检测除[Ca2+]i...

迄今为止，已在人类群体中鉴定出超过700种RYR1变异体，并发现其与多种神经肌肉疾病相关，包括恶性高热易感性（MHS）、运动诱发的横纹肌溶解症、中央核心病（CCD）、多微小核心病（MmD）以及中心核肌病（CNM）1,2,3；然而，针对这些变异体功能效应的研究进展相对滞后，仅有约10%的突变经过了功能验证。可采用多种实验方法评估特定RyR1变异体的影响，包括将编码野生型（WT）和突变型RYR1 cDNA的质粒转染至异源细胞（如HEK293和COS-7细胞）4,5，将编码野生型和突变型RYR1 cDNA的质粒及载体转导至无雷诺丁受体的小鼠成纤维细胞，随后转导myo-D并诱导其分化为肌管细胞6，构建携带突变RyR1的转基因动物模型7,8,9，以及对内源性表达RYR1变异体的患者来源细胞进行功能表征10,11,12。这些方法有助于阐明不同突变对RyR1 Ca2+通道功能的影响机制。
本文描述了用于评估 RYR1 突变功能效应的方法。在内源性表达 RyR1 钙通道的人类细胞中，研究了细胞内钙稳态的多种参数，包括成肌细胞和 Epstein Barr 病毒（EBV）永生化的 B 淋巴细胞。细胞来源于患者，经体外扩增后，负载比值型荧光钙指示剂（如 Fura-2 或 indo-1）。已有报道指出，由于致病性 RYR1 突变，静息 [Ca²⁺]、兴奋-收缩耦联过程中钙释放的幅度和动力学、钙诱导的钙释放敏感性、内质网钙库的充盈状态以及钙泄漏等参数均可能发生改变。2+]，对不同药理学激动剂的敏感性以及细胞内Ca2+ 使用荧光显微镜在单细胞水平或使用荧光计在细胞群体水平上测量钙库。将来自突变携带者细胞的检测结果与来自健康对照家族成员细胞的结果进行比较。该方法已证明：（i）许多与恶性高热易感性（MHS）相关的突变会导致静息[Ca2+] 以及对KCl诱导的去极化或使用4-氯-间甲酚进行药理学RyR1激活的剂量反应曲线均出现左移10,11,12,13；（ii）与CCD相关的突变导致峰值[Ca2+] 通过药物激活 RyR1 释放，且当细胞内 Ca 浓度降低时，其尺寸减小2+ 储存12,13,14,15；（iii）某些变异体不影响 Ca2+ 稳态13该实验方法的优点包括：RyR1蛋白未过表达，处于生理水平；细胞可永生化（包括肌细胞和B淋巴细胞），从而获得携带突变的细胞系。一些局限性在于，患者可能在编码参与钙稳态和/或兴奋-收缩耦联（ECC）相关蛋白的多个基因中均存在突变，这可能使实验结论复杂化。例如，在恶性高热易感者（MHS）和对照人群中均发现了两种JP-45变异体，且其存在被证实会影响二氢吡啶受体（DHPR）对激活的敏感性。16患者需要能够配合，生物样本需新鲜采集，且须从当地伦理委员会获得伦理许可。

<table><tbody><tr><td>4-氯-间甲酚</td><td>Fluka</td><td>24940</td><td></td></tr><tr><td>血液采集管</td><td>Sarstedt</td><td>172202</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>咖啡因</td><td>Merk</td><td>102584</td><td></td></tr><tr><td>Cascade 125+ CCD 相机</td><td>Photometrics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cascade 128+ CCD</td><td>Photometrics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>肌酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-3630</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>41639</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Fluka</td><td>3778</td><td></td></tr><tr><td>表皮生长因子（EGF）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll Paque</td><td>Cytiva</td><td>17144002</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2/AM</td><td>Invitrogen Life Sciences</td><td>F1201</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630049</td><td></td></tr><tr><td>马血清</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16050122</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11382II</td><td></td></tr><tr><td>离子霉素</td><td>Sigma</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>镧</td><td>Fluka</td><td>61490</td><td></td></tr><tr><td>微灌流系统</td><td>ALA-Scientific</td><td>DAD VM 12 valve manifold</td><td></td></tr><tr><td>Origin 软件</td><td>OriginLab Corp</td><td>Software</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco Life Sciences</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>灌流腔室 POC-R</td><td>Pecon</td><td>000000-1116-079</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21875091</td><td></td></tr><tr><td>荧光分光光度计</td><td>Perkin Elmer</td><td>LS50</td><td></td></tr><tr><td>毒胡萝卜素</td><td>Calbiochem</td><td>586005</td><td></td></tr><tr><td>组织培养皿</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>组织培养瓶</td><td>Falcon</td><td>353107</td><td></td></tr><tr><td>组织培养小室</td><td>Falcon</td><td>353090</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA 溶液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Visiview</td><td>Visitron Systems GmbH</td><td>Software</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert S100 TV 显微镜</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 玻璃盖玻片</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>0727-016</td><td></td></tr></tbody></table>

内源性表达的人源ryr1变异体的功能表征

Functional Characterization of Endogenously Expressed Human RYR1 Variants

在患有不同神经肌肉疾病的患者中，已鉴定出超过700种RYR1基因变异，这些疾病包括恶性高热易感性、核心性肌病和中心核肌病。由于RYR1突变与多种表型相关，因此对其功能效应进行表征至关重要，这有助于对患者携带的变异进行分类，为未来的治疗干预提供依据，并识别非致病性变异。许多实验室致力于开发方法，以功能表征患者细胞中内源性表达的RYR1突变。该方法具有多项优势，包括：突变在内源性水平表达、RyR1蛋白不会过表达、避免使用异源表达RyR1的细胞系。然而，由于患者可能携带除RYR1以外其他基因的突变，因此比较携带相同突变但遗传背景不同的个体所提供的生物样本结果显得尤为重要。本文描述了用于研究内源性表达的RYR1变异体功能效应的方法，所用细胞包括：（a）EB病毒永生化的人B淋巴细胞；（b）从肌肉活检组织中分离并分化为肌管的卫星细胞。随后通过添加药理性RyR1激活剂，监测细胞内钙离子浓度的变化。所选细胞类型被加载一种比率型荧光钙指示剂，细胞内[Ca2+]的变化可通过荧光显微镜在单细胞水平检测，或通过分光荧光计在细胞群体中检测。通过比较健康对照个体与携带RYR1变异患者的细胞之间的静息[Ca2+]水平及激动剂剂量-反应曲线，可深入了解特定变异的功能效应。

[Ca2+]i EBV永生化B淋巴细胞群体中的测量 
原代B淋巴细胞表达作为钙离子通道功能的RyR1亚型，该亚型参与调控细胞内钙信号2+ B细胞抗原受体刺激信号过程中的释放通道17. 利用EBV永生化B细胞是一种遗传学家常规使用的方法，用于获得含有患者基因组信息的细胞系，其优势在于能够生成表达突变型RyR1 Ca2+ 携带 RYR1 突变患者中的通道11,13. [Ca2+]i 由特异性 RyR1 激动剂（如 4-氯-间甲酚）添加所引起的变化18 并且可以轻松监测咖啡因，以确定特定的 RYR1 突变是否改变了对激动剂的敏感性...

本文描述了用于研究在EB病毒永生化的人B淋巴细胞以及由肌肉活检获得的卫星细胞分化成的肌管细胞中内源性表达的RYR1突变功能效应的方法。

内源性表达的人源RYR1变异体的功能表征

在患有不同神经肌肉疾病的患者中，已鉴定出 RYR1 基因的 700 多个变异，包括恶性高热……

本方案具有重要意义，因为它使用了患者的样本材料。如果患者患有该疾病，利用其细胞将能更准确地反映患者体内的生物学反应。该技术操作简单、流程直接，且无需复杂的仪器设备。这些方法可用于诊断，例如证明 RYR1 突变在功能上改变了钙稳态，以及检测化合物潜在的治疗作用。根据研究人员的知识和技术水平，在使用实际患者样本之前应先进行测试实验。为监测 EBV 转化的 B 淋巴细胞内钙浓度的变化，将永生化 B 细胞在 Krebs Ringer 溶液中重悬，使其浓度为每毫升一乘以十的七次方个细胞，并加入 Fura-2 AM 至终浓度为五微摩尔，在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。孵育结束后，通过离心收集细胞，并将细胞沉淀重悬于新鲜的克雷布斯-林格溶液中，浓度为每毫升含 2 × 10⁶ 个细胞。在实验开始前，再次离心细胞，并迅速将细胞重悬于 1.5 毫升含有 0.5 毫摩尔/升 EGTA 但不添加钙离子的克雷布斯-林格溶液中。将细胞转移至一个 3 毫升的玻璃荧光比色皿中，并在配备磁力搅拌器（调至最高速度）和恒温 37°C 的荧光分光光度计中记录约 30 秒的荧光比值。为评估单个细胞的钙释放反应，将1 × 10⁶个负载Fura-2 AM的细胞接种于1毫升含1 mM氯化钙的Krebs Ringer溶液中，置于预先用多聚-L-赖氨酸包被的玻璃盖玻片上，随后将盖玻片置于37°C、湿度饱和的细胞培养孵箱中孵育30分钟。待细胞贴壁后，将盖玻片转移至灌流腔室中，并以每分钟2毫升含1 mM氯化钙的Krebs Ringer溶液的流速开始灌流。使用配备40倍油镜物镜及相应滤光片的倒置荧光显微镜，通过软件控制的电荷耦合器件（CCD）相机，以固定曝光时间每隔1秒连续记录荧光信号。为了实现细胞刺激，使用带有12个阀门的细胞灌流刺激仪来添加不同浓度的激动剂。为了从人体肌肉活检样本中分离成肌细胞，首先用无菌PBS冲洗活检样本以去除多余的血液，然后将组织切成0.5至1毫米大小的小块。将两到三个组织碎片分别放入六孔细胞培养板中每个孔内的插入式培养插件中，每孔加入1.5毫升人肌细胞生长培养基，每个插件中加入500微升培养基，然后将培养板放入细胞培养箱中。为了检测人成肌细胞中钙表达的变化，在观察到多核肌管时，将肌管培养物的上清液更换为新鲜的分化培养基，并添加10微升浓度为1毫摩尔的Fura-2 AM，在细胞培养箱中孵育30分钟。孵育结束后，将一片载玻片培养物转移至灌流室中，并用添加了2毫摩尔氯化钙的Krebs Ringer溶液冲洗细胞。随后使用20倍水浸物镜进行在线钙离子检测，操作方法如演示所示。在此代表性分析中，加入激动剂后，EBV永生化B淋巴细胞内的钙离子浓度迅速升高，随后随时间逐渐下降，恢复至静息水平。在类似实验中，加入400纳米浓度的毒胡萝卜素（thapsigargin）引起显著的钙瞬变，其峰值荧光值达到2.4个任意单位。在构建相应的剂量-反应曲线时，该荧光值被定义为100%。在此分析中，将永生化B细胞用5毫摩尔咖啡因刺激20秒，导致340和380纳米荧光比值立即升高。针对每个测试的咖啡因浓度，计算由咖啡因诱导产生的340/380纳米荧光比值峰值，并用于构建剂量-反应曲线。通过氯化钾灌注、不同浓度的激动剂和/或咖啡因处理，也可评估分化肌管细胞中的钙释放，并可生成正常的剂量-反应曲线。必须确保细胞正确负载Fura-2，并且340和380纳米波长均对激动剂的加入产生响应。利用荧光钙离子指示剂检测细胞内钙离子浓度的方法适用于大多数哺乳动物细胞，可用于研究不同刺激下细胞内钙离子水平的变化。

functional-characterization-endogenously-expressed-human-ryr1

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

内源性表达人RYR1变异体的功能表征

蛋白质之间的相互作用是所有细胞过程的基础。利用生物发光共振能量转移技术，可以在活细胞中实时监测一对蛋白质之间的相互作用。此外，还可以评估潜在致病性突变的影响。...

利用生物发光共振能量转移在活细胞中研究蛋白质-蛋白质相互作用

雷诺丁受体的寡聚化，一种介导Ca²⁺释放的同源四聚体离子通道2+ 来自细胞内储存的释放，对骨骼肌和心肌收缩至关重要。本文中，我们介绍互补的 体内 和 体外...

遗传学与生物化学方法 体内 和 体外 蛋白质寡聚化的评估：以兰尼碱受体为例

本文介绍了一种简便的荧光检测方法，用于评估氨基酰-tRNA合成酶/tRNA配对在哺乳动物细胞表达蛋白中掺入非经典氨基酸（ncAAs）的效率。文中还描述了将非经典氨基酸应用于G蛋白偶联受体（GPCRs）研究的实例，包括结合位点的光交联定位以及在活细胞中对GPCR进行生物正交标记。...

优化化学探针在G蛋白偶联受体中的遗传编码，用于活体哺乳动物细胞中的光交联定位与生物正交化学研究

靶向二代测序是一种高效且经济的方法，正日益广泛应用于疾病研究和临床诊断。本文所述方案介绍了用于测序的复杂工作流程，以及用于识别致病遗传变异的生物信息学分析过程。...

靶向二代测序与生物信息学分析流程用于评估先天性疾病的遗传决定因素

本文介绍了四种构建和利用酵母Saccharomyces...

酵母作为研究人类P53功能检测方法开发的底盘系统

本实验方案的目的是概述在Drosophila...

利用Drosophila进行疾病相关稀有基因变异的体内功能研究

本文介绍了一种通过接触抑制实现人原代角质形成细胞体外分化的逐步实验流程，并通过RNA-seq分析在分子水平对其进行表征。...

通过RNA-Seq分析表征人原代角质形成细胞的体外分化

在此，我们描述了一种用于检测与定位的实验方案 黑腹果蝇 从收集到预包埋和包埋、免疫染色以及 mRNA 检测的胚胎蛋白与 RNA 原位...

一种用于免疫组织化学与RNA的实验方案 原位 早期分布 果蝇 胚胎

开发了一种简单且可扩展的方法，用于评估Ube3a基因中错义变异的功能意义，该基因的功能缺失和获得与安格曼综合征及自闭症谱系障碍均有关联。...

一种可扩展的基于细胞的功能性评估 Ube3a 变异体的方法

本研究介绍了一个从DNA到蛋白质功能及神经行为的多尺度研究框架。该研究提出了一种新方法，用于探究GABAA受体亚基中预测为致病性的突变，假设致癫痫突变以及被预测为致病性的邻近突变可能在CA1锥体神经元模型上产生相似的影响。...

GABAA受体亚基错义变异在海马锥体神经元中作用的位点特异性鉴定与分类

了解如何使用患者来源的EBV永生化B淋巴细胞和肌肉活检卫星细胞，通过Fura-2 AM监测钙稳态变化，从而评估RYR1突变的功能影响并探索潜在治疗方案。

内源性表达的人源RYR1变异体的功能表征

探索更多视频