内源性表达的人源RYR1变异体的功能表征

本方案具有重要意义，因为它使用了患者的样本材料。如果患者患有该疾病，利用其细胞将能更准确地反映患者体内的生物学反应。该技术操作简单、流程直接，且无需复杂的仪器设备。

这些方法可用于诊断，例如证明 RYR1 突变在功能上改变了钙稳态，以及检测化合物潜在的治疗作用。根据研究人员的知识和技术水平，在使用实际患者样本之前应先进行测试实验。为监测 EBV 转化的 B 淋巴细胞内钙浓度的变化，将永生化 B 细胞在 Krebs Ringer 溶液中重悬，使其浓度为每毫升一乘以十的七次方个细胞，并加入 Fura-2 AM 至终浓度为五微摩尔，在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。

孵育结束后，通过离心收集细胞，并将细胞沉淀重悬于新鲜的克雷布斯-林格溶液中，浓度为每毫升含 2 × 10⁶ 个细胞。在实验开始前，再次离心细胞，并迅速将细胞重悬于 1.5 毫升含有 0.5 毫摩尔/升 EGTA 但不添加钙离子的克雷布斯-林格溶液中。将细胞转移至一个 3 毫升的玻璃荧光比色皿中，并在配备磁力搅拌器（调至最高速度）和恒温 37°C 的荧光分光光度计中记录约 30 秒的荧光比值。

为评估单个细胞的钙释放反应，将1 × 10⁶个负载Fura-2 AM的细胞接种于1毫升含1 mM氯化钙的Krebs Ringer溶液中，置于预先用多聚-L-赖氨酸包被的玻璃盖玻片上，随后将盖玻片置于37°C、湿度饱和的细胞培养孵箱中孵育30分钟。待细胞贴壁后，将盖玻片转移至灌流腔室中，并以每分钟2毫升含1 mM氯化钙的Krebs Ringer溶液的流速开始灌流。使用配备40倍油镜物镜及相应滤光片的倒置荧光显微镜，通过软件控制的电荷耦合器件（CCD）相机，以固定曝光时间每隔1秒连续记录荧光信号。

为了实现细胞刺激，使用带有12个阀门的细胞灌流刺激仪来添加不同浓度的激动剂。为了从人体肌肉活检样本中分离成肌细胞，首先用无菌PBS冲洗活检样本以去除多余的血液，然后将组织切成0.5至1毫米大小的小块。将两到三个组织碎片分别放入六孔细胞培养板中每个孔内的插入式培养插件中，每孔加入1.5毫升人肌细胞生长培养基，每个插件中加入500微升培养基，然后将培养板放入细胞培养箱中。

为了检测人成肌细胞中钙表达的变化，在观察到多核肌管时，将肌管培养物的上清液更换为新鲜的分化培养基，并添加10微升浓度为1毫摩尔的Fura-2 AM，在细胞培养箱中孵育30分钟。孵育结束后，将一片载玻片培养物转移至灌流室中，并用添加了2毫摩尔氯化钙的Krebs Ringer溶液冲洗细胞。随后使用20倍水浸物镜进行在线钙离子检测，操作方法如演示所示。

在此代表性分析中，加入激动剂后，EBV永生化B淋巴细胞内的钙离子浓度迅速升高，随后随时间逐渐下降，恢复至静息水平。在类似实验中，加入400纳米浓度的毒胡萝卜素（thapsigargin）引起显著的钙瞬变，其峰值荧光值达到2.4个任意单位。在构建相应的剂量-反应曲线时，该荧光值被定义为100%。

在此分析中，将永生化B细胞用5毫摩尔咖啡因刺激20秒，导致340和380纳米荧光比值立即升高。针对每个测试的咖啡因浓度，计算由咖啡因诱导产生的340/380纳米荧光比值峰值，并用于构建剂量-反应曲线。通过氯化钾灌注、不同浓度的激动剂和/或咖啡因处理，也可评估分化肌管细胞中的钙释放，并可生成正常的剂量-反应曲线。

必须确保细胞正确负载Fura-2，并且340和380纳米波长均对激动剂的加入产生响应。利用荧光钙离子指示剂检测细胞内钙离子浓度的方法适用于大多数哺乳动物细胞，可用于研究不同刺激下细胞内钙离子水平的变化。