TGF-β介质到中微过渡（末端MT）和使用CRISPR/Cas9基因编辑对末端效应器的功能评估
2021年2月26日
我们通过观察细胞形态变化和使用免疫荧光染色检查表达 EndMT 相关标记变化来描述在内皮细胞中研究 TGF-β2 诱导 EndMT 的方法。CRISPR/Cas9基因编辑被描述并用于耗尽编码蜗牛的基因，以调查其在TGF-+2诱发的EndMT中的作用。
内皮到间皮过渡是一个细胞过程，内皮细胞将其鹅卵石形态转变为成纤维细胞状表型。细胞因子TGF-beta，改变生长因子β，是这一转变的主要驱动力。分析细胞形态的变化以及内皮和间皮标记的表达水平，使我们能够评估内皮向间皮过渡的发生。
新兴数据将内皮与间质过渡过程与癌症、心血管疾病和纤维化等各种疾病联系起来。数据表明，这种干预可能具有治疗作用。通过刺激在胚胎生成和器官发育过程中发生的内皮至心肌过渡过程，我们也许能够再生软骨、骨骼和肌肉等由心肌衍生的组织。
要通过免疫荧光染色检测细胞内蛋白，使用 0.1% Triton X-100 进行细胞渗透是必要的，以便抗体通过细胞膜。通过这个视频演示，研究人员将很好地掌握如何研究细胞因子，如TGF-β在内皮到中微质过渡中的作用。首先，在DMEM中，1×10+5镜面胰岛内皮MS1细胞补充10%FBS和每毫升100单位青霉素和链霉素到0.1%明胶涂层培养板。
在细胞培养孵化器中过夜孵育后，用PBS清洗细胞，然后用两毫升0.25%的三聚辛，0.02%EDTA溶液在37摄氏度下治疗两分钟。当细胞开始分离时，用五毫升完整的培养介质抑制反应，并将产生的细胞悬架转移到15毫升的管子上进行离心。将颗粒重新注入四毫升的新鲜完整介质进行计数。
并将每立方厘米1 X 10+3个细胞放入一个新的细胞培养容器中。经过通宵培养后，用五口微摩尔TGF-β受体激酶抑制剂SB-431542和两口具有DMSO溶剂控制的油井处理两口井。并将细胞置于细胞培养孵化器中30分钟。
在孵化结束时，用车辆控制处理两口井，用TGF-beta 2处理两口井。三天后，使用倒置显微镜检查亮场成像下每个细胞治疗组的细胞形态。要评估通过免疫荧光染色来评估末端MT相关标记的变化，如所示，将细胞从适当的MS1细胞培养中分离出来。
并将细胞以1.9 X 10+3细胞浓度播种，浓度为0.1%，明胶涂层为12毫米圆形盖眼镜，放置在24井板的单独井内。经过通宵培养后，用一毫克TGF-β2的微克毫升治疗细胞三天。在孵化结束时，用PBS清洗细胞，并在室温下用每口井300微升4%甲醛修复处理培养物10分钟。
固定结束时，用PBS清洗细胞三次，然后用300微升的0.1%Triton X-100和PBS在室温下渗透细胞10分钟。在孵化结束时，在PBS中清洗细胞三次，并在PBS中用3%BSA阻断细胞。室温下45分钟后，在室温下用原发性PECAM-1和SM22-alpha抗体标记细胞45分钟，然后用PBS进行三次洗涤。
最后一次洗涤后，在室温下用适当的二次抗体孵育细胞45分钟，用PBS清洗细胞三次，然后用DAPI补充的安装介质和盖滑安装细胞。然后用清晰的指甲油密封盖滑的边缘，并根据标准成像协议使用适当的过滤器，通过荧光共焦显微镜对细胞标记表达进行成像。经过三天的TGF-beta 2治疗后，内皮MS1细胞失去了鹅卵石状结构，并分化成主轴状的间质状细胞。
当细胞暴露在TGF-β受体激酶抑制剂SB-431542中时，这种TGF-β2诱导分化被抑制。TGF-β 2刺激后内皮蛋白PECAM-1的表达量明显减少，而间质因子SM-22α则得到深刻调节。此外，蜗牛明显受到TGF-β2暴露的管制，而鼻孔表达不受影响。
正如所观察到的CRISPR-Cas9基因编辑可用于促进将两个独立的蜗牛单导RNA引入Cas9表达MS1细胞，以破坏蜗牛的表达。蜗牛的淘汰足以抑制MS1细胞中TGF-β2驱动的成纤维细胞状细胞形态，并阻止TGF-β2调解PECAM-1下降和SM-22α增强。通过测量这些标记在西方斑点分析中定量PCR上的表达，可以进一步验证免疫荧光对细胞形态变化和内皮和间质标记表达的评估。
这种检测内皮到间皮过渡的技术使研究人员能够研究这种作为多种疾病中发生的生理过程的这一新兴意义。
概述
本研究调查了TGF-β2诱导的内皮细胞向间充质转化（EndMT），重点关注形态变化和标记物表达。使用CRISPR/Cas9基因编辑来检验Snail基因的作用，评估其对这些过程的贡献。
关键研究组成部分
研究领域
- 内皮细胞向间充质转化
- 对癌症和纤维化等疾病的影响
- 调节EndMT的治疗潜力
背景
- EndMT涉及内皮细胞转变为间充质样状态。
- TGF-β2是驱动这一转变的关键细胞因子。
- 强调了EndMT在各种疾病和再生医学中的重要性。
所用方法
- 免疫荧光染色以评估细胞形态和标记物表达
- MS1内皮细胞模型
- CRISPR/Cas9基因编辑以破坏Snail表达
主要结果
- 分析显示TGF-β2处理后内皮MS1细胞的形态变化。
- PECAM-1表达降低而SM-22 alpha增加，表明EndMT发生。
- Snail敲除抑制了形态变化，验证了其在TGF-β2诱导的EndMT中的作用。
结论
- 本研究阐明了TGF-β2诱导的EndMT的机制和Snail的作用。
- 研究结果表明针对各种疾病中EndMT的潜在治疗策略。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding TGF-β2-induced endothelial to mesenchymal transition (EndMT) provides mechanistic insight into disease pathways relevant to fibrosis, cancer, and cardiovascular disorders. Genetic interrogation of EndMT effectors using CRISPR/Cas9 enables target validation and de-risking of therapeutic hypotheses in early discovery. This approach supports predictive confidence in identifying novel regulators of endothelial plasticity for translational applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates the role of specific transcription factors like Snail in TGF-β2-driven phenotypic conversion.
- Operational Value: Enables functional validation of putative EndMT modulators through genetic knockout in a relevant endothelial model.
- Predictive Value: Supports target de-risking by establishing causal links between gene expression and mesenchymal transition phenotypes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Establishes a quantitative immunofluorescence-based readout for EndMT using endothelial (PECAM-1) and mesenchymal (SM-22-alpha) markers.
- Operational Value: Provides a standardized, reproducible assay format for monitoring TGF-β2-induced phenotypic changes in MS1 cells.
- Scalability Value: Compatible with genetic and pharmacological screening formats to identify novel EndMT regulators.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Links EndMT modulation to potential therapeutic strategies in fibrosis and cancer where endothelial plasticity contributes to pathogenesis.
- Preclinical Relevance: Uses a murine pancreatic microvascular endothelial cell model to study conserved mechanisms of TGF-β2 signaling.
- Mechanistic De-risking: Validates Snail as a necessary effector of TGF-β2-induced EndMT, supporting target confidence in pathway inhibition strategies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, enabling mechanistic de-risking before compound screening or in vivo validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of cytokine-driven transcriptional programs in endothelial cells using genetic perturbation.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative morphological and biomarker readouts suitable for high-content screening adaptation.
- Analytics: Generates multiplexed protein expression and localization data via immunofluorescence to assess pathway modulation.
- Translational Research: Connects endothelial phenotype changes to disease-relevant processes like fibrosis and tumor stroma formation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying endothelial plasticity across multiple disease contexts and screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic clarity on EndMT regulation, reducing ambiguity in target selection for anti-fibrotic or anti-cancer strategies.
- Operational Value: Delivers a standardized, reproducible system for assessing endothelial phenotype transitions with built-in controls (e.g., TGF-β receptor inhibition).
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by validating target necessity in a disease-relevant cellular context prior to investment.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of EndMT-modulating targets based on genetic validation evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in endothelial cell culture, CRISPR/Cas9 gene editing, and immunofluorescence microscopy.
- Dependent on access to fluorescence confocal microscopy and standardized imaging protocols for marker quantification.
- Necessitates optimization of guide RNA efficiency and validation of knockout efficiency across clonal populations.
- Requires standardization of TGF-β2 dosing and timing to ensure reproducible EndMT induction across experiments.
- Limited to in vitro models; findings require validation in physiologically relevant systems such as co-cultures or animal models of disease.
