TGF-β介导的内皮细胞向间充质细胞转化（EndMT）及利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对EndMT效应分子的功能评估

内皮细胞向间充质细胞转化是一种细胞过程，其中内皮细胞将其铺路石样的形态转变为成纤维细胞样表型。细胞因子TGF-β（转化生长因子β）是这一转化过程的主要驱动因素。通过分析细胞形态的变化以及内皮和间充质标志物表达水平的改变，可以评估内皮细胞向间充质细胞转化的发生情况。

越来越多的研究数据表明，内皮-间充质转化过程与多种疾病相关，包括癌症、心血管疾病和纤维化。这些数据提示，干预该过程可能具有治疗益处。通过刺激在胚胎发生和器官发育过程中发生的内皮-间充质转化，我们或许能够再生来源于间充质的组织，例如软骨、骨和肌肉。

为了通过免疫荧光染色检测细胞内蛋白，必须使用0.1% Triton X-100对细胞进行通透处理，以允许抗体穿过细胞膜。通过本视频演示，研究人员将能够充分掌握如何研究TGF-β等细胞因子在内皮细胞向间充质细胞转化过程中的作用。首先，在经0.1%明胶包被的培养板中接种1 × 10⁵个小鼠胰岛内皮MS1细胞，培养基为添加了10%胎牛血清（FBS）以及每毫升100单位青霉素和链霉素的DMEM培养基。

在细胞培养箱中过夜培养后，用 PBS 洗涤细胞，随后加入两毫升 0.25% 胰蛋白酶、0.02% EDTA 溶液，在 37 摄氏度处理两分钟。当细胞开始脱落时，加入五毫升完全培养基终止反应，并将所得细胞悬液转移至 15 毫升离心管中进行离心。用四毫升新鲜完全培养基重悬沉淀，用于细胞计数。

每立方厘米接种 1 × 10^3 个细胞至新的细胞培养容器中。过夜培养后，向两个孔中加入 5 µM TGF-β 受体激酶抑制剂 SB-431542，另两个孔中加入 DMSO 溶剂对照。将细胞置于细胞培养箱中孵育 30 分钟。

孵育结束时，用溶剂对照处理两个孔，用TGF-β2处理另外两个孔。三天后，使用倒置显微镜在明场成像下观察各细胞处理组的细胞形态。为通过免疫荧光染色评估内皮-间质转化（endMT）相关标志物的变化，按照示范方法从适当的MS1细胞培养物中分离细胞。

将细胞以1.9 × 10³个细胞的浓度接种于24孔板各孔中预先置于孔内的0.1%明胶包被的12毫米圆形盖玻片上。过夜培养后，加入1纳克/毫升的TGF-β2处理细胞，持续三天。孵育结束后，用PBS洗涤细胞，每孔加入300微升4%多聚甲醛，在室温下固定10分钟。

固定结束后，用 PBS 洗涤细胞三次，然后每孔加入 300 微升含 0.1% Triton X-100 的 PBS，室温孵育 10 分钟以通透细胞。孵育结束后，用 PBS 洗涤细胞三次，再用含 3% BSA 的 PBS 封闭细胞。室温封闭 45 分钟后，加入 PECAM-1 和 SM22-alpha 一抗，室温孵育 45 分钟，随后用 PBS 洗涤三次。

最后一次洗涤后，在室温下用相应的二抗孵育细胞45分钟，然后用PBS洗涤细胞三次，再使用含DAPI的封片剂和盖玻片对细胞进行封片。接着用透明指甲油密封盖玻片边缘，并根据标准成像方案，选用适当的滤光片通过荧光共聚焦显微镜观察细胞标志物的表达情况。经TGF-beta 2处理三天后，内皮MS1细胞失去其铺路石样的结构，分化为梭形的类似间充质细胞的形态。

当细胞暴露于TGF-β受体激酶抑制剂SB-431542时，TGF-β2诱导的分化受到抑制。TGF-β2刺激后，内皮细胞蛋白PECAM-1的表达显著降低，而间充质因子SM-22α则显著上调。此外，Snail在TGF-β2作用下明显上调，而Slug的表达则未受影响。

如观察所示，CRISPR-Cas9 基因编辑可用于将两种独立的 Snail 单导向 RNA 引入表达 Cas9 的 MS1 细胞中，从而破坏 Snail 的表达。敲除 Snail 足以抑制 TGF-beta 2 在 MS1 细胞中诱导的成纤维细胞样细胞形态，并阻断 TGF-beta 2 介导的 PECAM-1 下降和 SM-22 alpha 上调。通过免疫荧光检测细胞形态及内皮和间充质标志物表达的变化，还可通过定量 PCR 和 Western blot 分析进一步验证这些标志物的表达水平。

这种检测内皮细胞向间充质细胞转化的技术，使研究人员能够探究这一生理过程在多种疾病中日益凸显的重要意义。