从预成型微气泡生产膜过滤相移十氟丁烷纳米滴
March 23rd, 2021
该协议描述了一种使用探针尖端超声处理产生大量脂质封装的十氟丁烷微气泡的方法，然后使用高压挤出和机械过滤将它们冷凝成相移纳米滴。
该协议是减少低沸点可汽化液滴多分散性的简单方法，用于生物医学应用。该技术以可控、可扩展且相对经济高效的方式冷凝预制的气体微气泡，并按尺寸过滤产生的液滴。该方法可应用于具有不同壳体和气体材料的各种脂质微泡，使用不同的过滤器来控制最终液滴的大小。
演示该程序的将是Darrah Merillat，他是来自Dr.Sirsi实验室的本科生研究员。打开声波器的电源开关，并使用微针附件将振幅设置为允许的最大值，并确保超声处理时间设置为10秒。将温水合脂质溶液放入隔音罩中，微针位于表面下方。
将适当长度的管子连接到小瓶的颈部，以引导气体从DFB罐出口进入外壳中保存的温脂溶液中。缓慢打开罐阀，直到可以看到气体流过脂质溶液，在液体表面引起轻微的涟漪。如果气体流量过高，溶液将在微气泡形成过程中溢出。
启动超声仪，连续运行10秒钟以产生微气泡。超声处理结束后，立即关闭DFB罐阀。快速盖上微气泡溶液，并将小瓶浸没在冰浴中，将样品冷却到55摄氏度以下。
使用200纳米陶瓷过滤器根据用户手册组装高压挤出机，并将其放置在防水容器的中心，这样样品出口管就不会压在侧面或卷曲。使用制造商提供的适配器将挤出机连接到氮气罐。将出口管的末端置于闪烁小瓶中以收集挤出的样品，用胶带将管固定在容器中以保持在小瓶内。
打开和关闭释放阀，以确保挤出机内没有压力。取下腔室盖。并将五毫升PBS加入挤出机室。
盖上盖子，确保盖子卡回原位。打开氮气罐，使压力表读数为250 PSI，确保压力控制阀处于关闭位置。关闭气罐，打开挤出机腔进气阀，使PBS溶液被推过系统，并将样品出口管排出进入闪烁小瓶。
当只有气体从管道中流出时，打开释放阀，让压力降至零PSI。然后取出闪烁小瓶。打开和关闭释放阀，以确保挤出机内没有压力，并在出口管的末端放置一个新的闪烁小瓶。
在钢制容器中装满2-甲基丁烷，并加入干冰，将温度降至零下18摄氏度。将微气泡溶液插入冷却的2-甲基丁烷中，浸没样品两分钟。在两分钟内移动闪烁小瓶，轻轻混合气泡。
根据需要添加干冰，以保持温度在零下15摄氏度至零下18摄氏度之间。两分钟后，从冷藏的2-甲基丁烷中除去微气泡。轻轻旋转小瓶以混合微气泡，并将气泡转移到冷却的10毫升注射器中。
取下挤出机腔盖，并通过缓慢推动注射器上的柱塞将微泡溶液加入腔室中。更换挤出机盖，确保其卡入到位。验证挤出机的压力控制阀和释放阀是否处于关闭位置。
打开氮气罐，直到压力表读数为250 PSI。关闭油箱，将压力控制阀转动至打开位置。当溶液在出口管处填充闪烁小瓶并且只有气体离开管时，慢慢打开压力释放阀，并使压力降至零PSI。
将10毫升挤出的液滴溶液转移到15毫升的离心管中。将挤出的样品在4摄氏度下以1， 500 g离心10分钟。丢弃上清液和出现在溶液顶部的自发汽化液滴。
将包含DFP纳米滴的沉淀重新悬浮在10毫升PBS中，其中含有20%甘油和20%丙二醇。有和不带挤出的冷凝气泡溶液的尺寸分布表明，仅浓缩的样品具有更宽的分布中心，中心在400纳米附近，而挤出样品的分布范围较窄，集中在200纳米。用于分析相移液滴的可调谐电阻脉冲传感分析，因为它们已被离心洗涤以除去多余的脂质体，表明液滴尺寸接近200纳米。
加热时纳米滴蒸发的显微镜数据显示，加热前视野中一些自发蒸发的微气泡明显，加热后观察到的气体微气泡数量较多。这里显示了直接插入挤出机的纳米滴的显微镜图像，无需预冷，在零摄氏度和零下18摄氏度下冷凝。汽化前后凝聚的八氟丙烷液滴的代表性图像也显示加热后气体微气泡数量更多，类似于DFB液滴。
在此过程中要记住的最重要的事情是，液滴产量高度依赖于冷凝过程中的温度和压力，微小的变化会影响结果。在产生可蒸发的液滴后，它们可用于优化体内成像和使用超声波的药物输送，以及其他体内和离体应用。在开发该技术后，已经通过对该协议的轻微修改来探索纳米滴尺寸和气体核心含量对体内汽化阈值的影响。
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概览
本协议概述了一种使用探头式超声波处理产生脂质包裹的十氟丁烷微气泡的方法。这些微气泡随后通过高压挤压和机械过滤被凝聚成相变纳米液滴。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物医学应用
- 微气泡技术
- 相变纳米液滴
背景
- 微气泡用于各种生物医学应用。
- 减少液滴的多分散性对一致性至关重要。
- 需要可控和可扩展的方法用于实际应用。
- 该技术可以适用于不同的脂质微气泡。
研究目的
- 提供一种生成纳米液滴的成本效益方法。
- 展示气体微气泡凝聚成液体液滴的过程。
- 实现特定应用的液滴尺寸控制。
使用的方法
- 探头式超声波处理以生成微气泡。
- 高压挤压用于液滴的凝聚。
- 机械过滤用于控制液滴尺寸。
- 应用不同的过滤器处理各种脂质微气泡。
主要结果
- 该方法成功减少了液滴的多分散性。
- 展示了该技术的可扩展性和成本效益。
- 该方法可以处理各种脂质微气泡。
- 通过过滤实现了最终液滴的尺寸控制。
结论
- 本协议提供了一种可靠的生成相变纳米液滴的方法。
- 该方法可以应用于各种生物医学应用。
- 该技术适用于研究目的且效率高。
常见问题
Executive Industry Relevance
Uniform, size-controlled phase-shift nanodroplets are critical for reliable in vivo imaging and drug delivery applications in biopharma R&D. This protocol enables scalable, reproducible production of lipid-stabilized decafluorobutane nanodroplets with minimized polydispersity, directly supporting translational research and preclinical model development. The method's accessibility and efficiency facilitate broader adoption across discovery and translational pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of ultrasound-mediated delivery mechanisms in disease-relevant systems.
- Supports functional validation of nanodroplet activation thresholds for mechanistic de-risking.
- Facilitates reproducible assessment of droplet behavior in biological matrices.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, size-filtered nanodroplets for quantitative assay development.
- Improves reproducibility and comparability of compound screening involving phase-shift agents.
- Enables scalable preparation of uniform droplets for high-throughput workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns droplet properties with in vivo imaging and drug delivery requirements.
- Supports continuity from benchtop optimization to preclinical validation of delivery systems.
- Reduces biological variability by controlling activation thresholds and droplet size.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing a robust platform for generating uniform nanodroplets for imaging and delivery studies.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of phase-shift activation and delivery efficiency in controlled systems.
- Screening: Supplies reproducible, quantitative droplet preparations for assay standardization.
- Analytics: Delivers consistent size distributions and activation profiles for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges benchtop fabrication with in vivo and ex vivo application requirements.
- Enterprise Reuse: Adaptable protocol supports diverse lipid shells and gas cores for multiple R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in nanodroplet-mediated imaging and delivery studies.
- Operational Value: Streamlines production with standard lab equipment and scalable workflows.
- Strategic Value: Reduces late-stage risk by enabling early, reproducible assessment of droplet performance.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of delivery and imaging candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbubble handling and phase-shift droplet fabrication.
- Needs access to sonication, high-pressure extrusion, and analytical instrumentation.
- Demands cross-team standardization of temperature and pressure parameters for reproducibility.
- Adaptable to various lipid and gas compositions with filter and process adjustments.
- Yield and size distribution are sensitive to operational conditions and require careful control.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:46
Generating Microbubbles from Lipid Films
1:48
Preparing and Priming the Extruder for Microbubble Condensation
3:13
Pre-Cooling Microbubbles for Extrusion and Separating Droplets from Liposomes by Centrifugation
5:04
Results: Phase-Shift Droplet Analysis of DFB and OFP Nanodroplets Using DLS, TRPS and Microscopy
6:19
Conclusion
