由预成型微泡制备膜过滤相变十氟丁烷纳米液滴

本方案是一种降低低沸点可汽化液滴多分散性的简便方法，可用于生物医学应用。该技术通过可控、可放大且相对经济的方式，将预先形成的气体微泡冷凝，并对生成的液滴按尺寸进行过滤。该方法可适用于多种具有不同壳材和气体成分的脂质微泡，并可通过使用不同的滤膜来调控最终液滴的尺寸。

本实验操作将由来自Sirsi博士实验室的本科研究人员Darrah Merillat进行演示。打开超声波破碎仪的电源开关，将振幅调节至微尖附件允许的最大值，并确保超声时间为10秒。将温热的水合脂质溶液放入隔音箱中，使微尖探头刚好置于液面下方。

将适当长度的导管连接到小瓶的瓶口，以引导DFB储气罐出口的气体进入密闭腔室内温热的脂质溶液中。缓慢打开储气罐阀门，直至观察到气体流经脂质溶液表面，在液面上产生轻微的涟漪。若气体流速过高，在微泡形成过程中溶液会溢出。

启动超声波破碎仪，连续运行10秒以生成微泡。超声处理结束后，立即关闭DFB反应罐的阀门。迅速盖紧微泡溶液瓶盖，并将样品瓶浸入冰浴中，使样品温度降至55摄氏度以下。

根据使用手册，使用200纳米陶瓷滤膜组装高压挤出器，并将其置于密闭容器中央，确保样品出口管未被压在容器侧壁上或发生折弯。使用制造商提供的接头将挤出器连接至氮气瓶。将出口管末端放入闪烁计数瓶中以收集挤出的样品，并用胶带将管子固定在容器上，确保其保持在瓶内。

打开并关闭释放阀，确保挤出机内部无压力。取下腔室盖，向挤出机腔室内加入 5 毫升 PBS。

盖上盖子，确保其牢固扣合到位。打开氮气罐，使压力表读数为 250 PSI，同时确保压力控制阀处于关闭状态。关闭气罐，打开挤出器腔室的进气阀，使 PBS 溶液被推动通过系统，从样品出口管排出至闪烁瓶中。

当仅有气体从管路中排出时，打开泄压阀，使压力降至0 PSI。随后取下闪烁计数小瓶。反复打开和关闭泄压阀，确认挤出器内部无残留压力，然后在出口管末端放置一个新的闪烁计数小瓶。

将钢制容器中装入2-甲基丁烷，并加入干冰以使温度降至零下18摄氏度。将微泡溶液插入冷却后的2-甲基丁烷中，使样品浸没两分钟。在两分钟内轻轻移动闪烁小瓶，以温和混匀气泡。

根据需要添加干冰，以维持温度在负15至负18摄氏度之间。两分钟后，将微泡从冷却的2-甲基丁烷中取出。轻轻旋转小瓶以混匀微泡，并将气泡转移至预冷的10毫升注射器中。

取下挤出器腔室盖，通过缓慢推动注射器活塞将微泡溶液加入腔室中。重新装上挤出器盖，确保其牢固卡紧。检查挤出器的压力控制阀和释放阀是否处于关闭位置。

打开氮气罐阀门，直至压力表读数为250 PSI。关闭气罐阀门，将压力控制阀调至开启位置。当溶液已充满出口管路中的闪烁小瓶且仅有气体从管路中排出时，缓慢打开压力释放阀，使压力逐渐降至0 PSI。

将10毫升挤出的液滴溶液转移至15毫升离心管中。在4°C条件下，以1,500 ×g离心力离心10分钟。弃去上清液以及在溶液顶部自发蒸发形成的液滴。

将含有DFP纳米液滴的沉淀物重悬于10毫升含20%甘油和20%丙二醇的PBS中。经或未经挤出处理的浓缩气泡溶液的粒径分布显示，仅浓缩的样品分布范围更宽，峰值集中在约400纳米附近，而经过挤出处理的样品分布更窄，峰值位于200纳米。采用可调电阻脉冲传感分析对经离心洗涤以去除过量脂质体后的相变液滴进行分析，结果显示液滴大小约为200纳米。

加热时纳米液滴汽化的显微镜数据显示，在加热前视野中已有一些自发汽化的微气泡，而加热后观察到更多的气体微气泡。此处展示了未预冷却直接注入挤出器、在0摄氏度下冷凝以及在零下18摄氏度下冷凝的纳米液滴的显微镜图像。代表性图像显示，八氟丙烷液滴在汽化前后均有冷凝现象，且加热后气体微气泡数量显著增加，与DFB液滴的结果相似。

在此操作过程中，最重要的是要记住，液滴的产率高度依赖于冷凝过程中的温度和压力，微小的波动都会影响实验结果。在生成可气化的液滴后，可将其用于优化基于超声的活体成像和药物递送，以及其他活体和离体应用。在本技术建立之后，已通过对此方案进行微小修改，探索了纳米液滴尺寸和气体核心含量对活体内气化阈值的影响。