Name: 从预成型微气泡生产膜过滤相移十氟丁烷纳米滴 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: 了解利用预成型微气泡制备十氟丁烷相移纳米滴的方法。该方案通过冷凝与高压挤出技术控制液滴尺寸，显著降低多分散性，为生物医学成像和药物递送提供均匀、可扩展的纳米颗粒制备途径。

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我们感谢 Ken Hoyt 博士实验室的 Dominique James 提供可汽化相变纳米液滴的 TRSP 分析

1. 制备脂质膜
<ol>
	<li>使用90% DSPC和10% DSPE-PEG2K制备用于微泡生成的脂膜，按以下步骤以正确比例混合脂质：
	<ol>
		<li>将DSPC和DSPE-PEG2K溶于氯仿中配制储备液。分别称取50 mg脂质粉末置于不同的样品瓶中，使用1 mL玻璃注射器向每个样品瓶中加入1 mL氯仿。</li>
		<li>使用玻璃注射器将287 µL DSPC储备液（50 mg/mL）和113 µL DSPE-PEG2K储备液（50 mg/mL）加入20 mL闪烁瓶中。</li>
		<li>通入氮气干燥混合脂质以去除氯仿。将适当长度的管路连接至实验室氮气源，轻轻将氮气通入样品瓶顶空区域，同时进行混合。持续操作直至观察不到氯仿残留，剩余脂膜开始变为白色。使用聚丙烯螺旋盖，在通入氮气时覆盖样品。</li>
		<li>将样品瓶置于真空干燥器中过夜，以去除任何残留的氯仿。最终将留下一层覆盖瓶底的薄而半透明的脂膜。</li>
		<li>将样品瓶于-20 °C保存，待用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 从脂质膜制备微泡
<ol>
	<li>制备微泡时，向干燥的脂质膜中加入 10 mL 含 20% v/v 丙二醇和 20% v/v 甘油的 1×磷酸盐缓冲液（PBS）（最终 pH 为 7.2–7.4）。</li>
	<li>盖紧样品管，将样品置于加热块（或恒温水浴）中，在 65 °C 下加热 30 分钟。</li>
	<li>在样品加热的同时，将水浴超声仪的温度升至 65 °C。 
	注意：在将水浴超声仪加热前，先用微波炉或加热板对水进行预热，可加快该过程。</li>
	<li>将装有已加热样品的闪烁瓶放入水浴超声仪中，确保只有含有脂质溶液部分的瓶体浸入水浴中。</li>
	<li>对温热的脂质溶液进行至少 15 分钟的超声处理。确保水温保持在 65 °C。以 10–15 分钟为间隔持续超声，直至溶液完全澄清（图 2）。 
	​注意：若无水浴超声仪，也可使用探头超声仪在 10% 功率下超声至溶液澄清。但此时探头磨损较快，更换成本较高。</li>
</ol>
<img alt="水浴超声处理过程、分散性改善前后的结果对比图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62203/62203fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：水合脂质膜的示例。 水合脂质膜在水浴超声处理前（A）和处理后（B）的图像，以形成单层囊泡。经过水浴超声处理后，脂质溶液应由较浑浊的状态转变为半透明溶液。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62203/62203fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="6">
	<li>仍处于温热状态时，取下瓶盖，并将小瓶夹紧固定于超声破碎仪的隔音罩内，使超声破碎仪的微探头刚好浸没于气液界面下方（图3）。</li>
	<li>将十氟丁烷储气罐放置在超声破碎仪隔音罩旁边。</li>
	<li>准备一个冰浴，并将其置于隔音罩旁，供后续步骤2.14中使用。</li>
	<li>打开超声破碎仪的电源开关。</li>
	<li>系统启动后，将功率设置为70%。使用微探头时，振幅不得超过70%，此时暂不启动超声。</li>
	<li>连接一段适当长度的导管，将DFB储气罐出口的气体导入隔音罩内盛有温热脂质溶液的小瓶中。导管应插入小瓶颈部，以便在超声过程中使气体进入顶空空间（图3）。</li>
	<li>缓慢打开储气罐阀门，直至观察到气体流过脂质溶液表面，液体表面将出现轻微波纹。若气体流速过高，脂质溶液会在微泡形成过程中溢出。</li>
	<li>启动超声破碎仪，持续超声10秒以生成微泡。若超声过程中溶液开始溢出，应立即停止超声。</li>
	<li>关闭超声破碎仪，并立即关闭DFB储气罐阀门。</li>
	<li>迅速盖紧微泡溶液瓶盖，并将小瓶浸入冰浴中，使样品温度迅速降至55 °C以下（DSPC的玻璃化转变温度）。</li>
	<li>将微泡样品保留在冰浴中，直至后续使用。</li>
</ol>
<img alt="实验室回流装置中的气体入口设置；用于控制反应和气体传递。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62203/62203fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：将探针尖端置入脂质溶液中的位置，以优化微泡的形成。 注意避免探针尖端接触玻璃。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62203/62203fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
3. 准备用于微泡冷凝的挤出机
<ol>
	<li>按照用户手册中的说明，使用制造商提供的 200 nm 陶瓷滤膜组装高压挤出器。</li>
	<li>将挤出器置于一个防水容器的中央，确保样品出口管未被压在侧壁上或发生弯折。</li>
	<li>使用制造商提供的连接适配器将挤出器与氮气瓶连接。</li>
	<li>在挤出器周围的防水容器中，用 400 mL 水和 10 g 氯化钠制备 -2 °C 的冰盐浴。</li>
	<li>将出口管末端放入闪烁计数小瓶中，以收集挤出的样品。 
	​注意：若管路无法平放或固定在小瓶内，请用胶带将其固定在容器上。</li>
</ol>
4. 用于微泡冷凝的挤出机预启动
<ol>
	<li>打开并关闭释放阀，确保挤出器内部无压力。</li>
	<li>取下腔室盖，向挤出器腔室内加入 5 mL 的 1× PBS。</li>
	<li>重新装上盖子，确保其牢固卡入到位。</li>
	<li>打开氮气罐，使压力表读数为 250 psi。确保压力控制阀处于关闭位置。</li>
	<li>关闭气罐，打开挤出器腔室进气阀。PBS 溶液将被推动通过系统，从样品出口管流入闪烁瓶中。</li>
	<li>当仅有气体从管路中排出时，打开释放阀，使压力降至 0 psi。</li>
	<li>取下闪烁瓶。</li>
</ol>
5. 挤压前微泡的预冷却
<ol>
	<li>打开并关闭释放阀，确保挤出机内部无压力。在出口管末端放置一个新的闪烁瓶。</li>
	<li>用2-甲基丁烷填充一个钢制容器，并加入干冰，使温度降至-18 °C。</li>
	<li>将微泡溶液插入冷却的2-甲基丁烷中，使样品浸没2分钟。在2分钟内轻轻移动闪烁瓶，以温和混合气泡。根据需要添加干冰，维持温度在-15至-18 °C之间。注意温度不要低于-20 °C，否则辅料溶液会冻结，破坏气泡样品。 
	注意：步骤5.2和5.3也可通过将气泡样品置于实验室冰箱中较长时间冷却完成。但应谨慎操作，密切监控冰箱温度，避免样品冻结。</li>
	<li>2分钟后，将微泡从冷却的2-甲基丁烷中取出，轻轻摇动闪烁瓶以混匀微泡，并使用预冷的10 mL注射器将溶液转移至挤出机中。</li>
	<li>取下挤出机腔室盖，通过缓慢推动注射器活塞将微泡溶液加入腔室。重新盖上挤出机盖，确保其牢固卡紧到位。</li>
	<li>确认挤出机的压力控制阀和释放阀处于关闭状态。</li>
	<li>打开氮气罐，直至压力表读数为250 psi，然后关闭气罐，并将压力控制阀转至开启位置。</li>
	<li>当溶液充满出口管末端的闪烁瓶，且仅有气体从管中排出时，缓慢打开压力释放阀，使压力逐渐降至0 psi。</li>
	<li>将闪烁瓶置于冰浴或冰箱中保存。</li>
	<li>为长期保存并减少自发汽化，可将样品存放在标准冷冻柜中。确保温度不低于-20 °C，以避免样品冻结（含20% PPG和20%甘油的辅料溶液通常可防止样品在大多数实验室冷冻柜中冻结）。</li>
</ol>
6. 通过离心分离脂质体中的液滴
<ol>
	<li>将10 mL乳化后的液滴溶液转移至15 mL离心管中。</li>
	<li>在4 °C条件下，以1,500 x g离心10分钟。离心后可见由DFB纳米液滴组成的沉淀物聚集在管底（图4）。自发气化的液滴将浮于溶液上层，应予以弃去。</li>
</ol>
<img alt="离心管中可见细胞沉淀，蛋白质纯化实验装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62203/62203fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：离心后相变 DFB 液滴沉淀的示例。 DFB 纳米液滴的密度高于脂质体，因此在离心后会聚集于离心管底部形成沉淀（红色框）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62203/62203fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="3">
	<li>移除上清液，并将沉淀重悬于 2 mL 含 20% 甘油和 20% 丙二醇的 1x PBS 中。</li>
	<li>轻轻混匀试管以获得均一溶液，并将液滴转移至较小的 2 mL 离心管中。</li>
	<li>在 2 mL 离心管中再用上述溶液洗涤样品两次。</li>
	<li>最后一次洗涤后，将沉淀重悬于 100 µL 含 20% 甘油和 20% 丙二醇的 1x PBS 中，并置于冰上或冷冻保存，直至使用。</li>
</ol>
7. 液滴汽化的显微镜验证
<ol start="1">
	<li>通过将 2.5 µl 浓缩液滴加入 7.5 µl 的 1x PBS 中，制备稀释的液滴溶液。</li>
	<li>取 10 µl 稀释后的样品置于显微镜载玻片上。使用 40x 物镜观察样品，并保存图像。</li>
	<li>将载玻片从显微镜上取下，置于 65 ˚C 的加热板上 1 分钟，使纳米液滴汽化为微气泡。</li>
	<li>加热后，使用相同的 40x 物镜观察样品，以确认液滴的汽化情况。</li>
</ol>

<ol><li>Sirsi, S., Borden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbubble+compositions%2C+properties+and+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Bubble+Science+Engineering+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Microbubble compositions, properties and biomedical applications.</a> Bubble Science Engineering and Technology. 1 (1-2), 3-17 (2009).</li>
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<li>Wu, S. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ultrasound-facilitated+brain+drug+delivery+using+optimized+nanodroplets%3A+vaporization+efficiency+dictates+large+molecular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Focused ultrasound-facilitated brain drug delivery using optimized nanodroplets: vaporization efficiency dictates large molecular delivery.</a> Physics in Medicine and Biology. 63 (3), 035002(2018).</li>
<li>Li, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+Nucleation+of+stable+perfluorocarbon+emulsions+for+ultrasound+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Spontaneous Nucleation of stable perfluorocarbon emulsions for ultrasound contrast agents.</a> Nano Letters. 19 (1), 173-181 (2019).</li>
<li>Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+ultrasonically-activatable+nanoparticles+using+low+boiling+point+perfluorocarbons%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons.</a> Biomaterials. 33 (11), 3262-3269 (2012).</li>
<li>Kawabata, K., Sugita, N., Yoshikawa, H., Azuma, T., Umemura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+with+multiple+perfluorocarbons+for+controllable+ultrasonically+induced+phase+shifting%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles with multiple perfluorocarbons for controllable ultrasonically induced phase shifting.</a> Japanese Journal of Applied Physics. 44 (6), 4548-4552 (2005).</li>
<li>Shakya, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaporizable+endoskeletal+droplets+via+tunable+interfacial+melting+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Vaporizable endoskeletal droplets via tunable interfacial melting transitions.</a> Science Advances. 6 (14), 7188(2020).</li>
<li>Kopechek, J. A., Zhang, P., Burgess, M. T., Porter, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+phase-shift+nanoemulsions+with+narrow+size+distributions+for+acoustic+droplet+vaporization+and+bubble-enhanced+ultrasound-mediated+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Synthesis of phase-shift nanoemulsions with narrow size distributions for acoustic droplet vaporization and bubble-enhanced ultrasound-mediated ablation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e4308(2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

已有大量文献讨论了用于体内成像和治疗的微泡及相变液滴的配方、物理特性及其潜在应用。本文重点讨论如何利用低沸点的全氟丁烷（DFB）气体和高压挤出技术，制备脂质微泡并将其转化为亚微米级的相变液滴。本方案旨在结合先前的微泡冷凝方法与液滴挤出技术，通过一步法相对简便地大量制备脂质微泡和DFB相变液滴。该方法的优势在于，可通过滤膜选择获得高浓度、粒径分布窄的微泡，进而形成DFB液滴。粒径分布窄的意义在于可实现样品汽化阈值的一致性。相比其他常用于获得窄粒径分布的方法，本方法更简便且成本更低，同时可处理的溶液体积也更大。该实验流程可分为三个主要步骤：（1）制备脂质微泡，（2）冷凝并挤出微泡，（3）通过离心分离相变液滴与脂质体。
使用探针尖端超声法生成微泡是制备脂质微泡的常用方法之一。已有大量文献描述了该操作流程。本实验方案改编自Feshitan等人的研究11，并优化为制备10 mL微泡溶液，此体积为台式挤出器的最大容量。通过移除微尖附件并将脂质溶液体积增加至100 mL或更大，该方法也可放大以制备更大体积的脂质微泡溶液，如Feshitan等人<su...

超声造影剂（UCAs）在成像和治疗应用中的使用正迅速增长。微泡作为最初的超声造影剂，目前仍是临床诊断应用中的主流试剂。微泡是充满气体的球形颗粒，直径通常为1-10 µm，外层由脂质、蛋白质或聚合物壳包裹1。然而，其尺寸和体内稳定性在许多应用中可能限制其功能。相变纳米液滴含有过热液体核心，因其更小的尺寸和更长的循环寿命，可克服其中一些局限2。当受到热或声能刺激时，其内部的过热液体核心会汽化，形成气体微泡2,3,4,5。由于汽化阈值与液滴尺寸直接相关5,6，制备尺寸均一的液滴悬浮液将有助于实现一致的激活阈值。能够产生均一液滴尺寸的制备方法通常复杂且成本较高，而成本较低的方法则往往产生多分散体系的溶液7。另一个局限在于能否稳定制备含有低沸点全氟碳（PFC）气体的相变液滴，这对于体内高效激活至关重要8。本文描述了一种用于生成稳定的、经过滤的、低沸点可汽化相变液滴的实验方案，适用于体内成像和治疗应用。
制备单分散亚微米相变液滴的方法有多种7。其中最可靠的一种尺寸控制方法是使用微流控装置。然而，这类装置成本较高，液滴生成速率较慢（约 ~104-106 滴/秒）7，且需要经过 extensive 培训才能操作。微流控装置通常还需使用高沸点气体，以避免发生自发汽化及系统堵塞7。然而，de Gracia Lux 等人最近的一项研究9表明，通过冷却微流化器，可利用低沸点的十氟丁烷（DFB）或八氟丙烷（OFP）生成高浓度的亚微米相变液滴（1010-1012/mL）。
通常，对于低沸点气体（如 DFB 或 OFP），使用预先形成的气泡进行操作更为简便。可通过低温和加压使气体冷凝，从而从脂质稳定的前体气泡中制备可汽化的液滴5,10。该方法所制备液滴的浓度取决于前体微泡的浓度以及气泡向液滴转化的效率。已有研究报道，通过探头超声处理可获得浓度高达 &gt; 1010 MB/mL 的微泡11，而另一项研究则报道了由冷凝的 OFP 和 DFP 气泡所形成的液滴浓度范围约为 ~1–3 × 1011 个/mL12。当对单分散液滴无特殊要求时，冷凝法是利用低沸点全氟碳化合物（PFC）制备脂质稳定相变液滴最直接且成本最低的方法。在冷凝前采用生成均一尺寸气泡的方法，有助于获得单分散性更高的液滴群体。然而，制备单分散的前体气泡本身也存在困难，往往需要微流控技术或重复差速离心等成本较高的方法11。最近有研究报道了一种利用脂质体中液滴自发成核来制备 DFB 和 OFB 纳米液滴的新方法13。该方法基于“Ouzo”效应，无需气泡冷凝步骤即可简便地生成低沸点 PFC 液滴。通过精确滴定并混合用于引发液滴成核的 PFC、脂质和乙醇组分，可调控 PFC 液滴的粒径分布。此外，值得注意的是，通过混合不同种类的全氟碳化合物可调节纳米液滴的稳定性及激活阈值14,15。Shakya 等人近期的研究进一步表明，可通过在烃类内核中乳化高沸点 PFC 以促进液滴核心内的异相成核，从而调节纳米液滴的激活特性16，该策略可与其他液滴尺寸筛选方法结合使用。
形成后，可通过挤出相变液滴以获得更均一的液滴群体。事实上，Kopechek 等人此前已发表过与此处所述方法类似的方案17，使用高沸点的十二氟戊烷（DDFP）作为液滴核心。若读者希望使用高沸点全氟碳化合物（室温下稳定）制备相变液滴，应参考上述文献。而使用低沸点气体（如 DFB 和 OFP）生成并挤出液滴的过程更为复杂，最佳方法是通过冷凝预先形成的气泡来实现。
本方案描述了一种使用探头式超声法生成具有DFB气体核心的预制脂质微泡的常用方法。随后，利用商用挤出器将预制微泡压缩为亚微米级相变纳米液滴（图1）。所得液滴可被热和超声激活。该方法相比传统压缩方法，可在无需昂贵微流控装置的情况下，制备出体积更大、粒径分布更窄的纳米液滴溶液。制备粒径分布窄的纳米液滴溶液，有望产生更均一的汽化阈值，从而最大化其在成像、消融、药物递送和栓塞等多种应用中的潜力1,3,4,6。
<img alt="压力系统下的微泡过滤过程示意图，显示微泡与液滴的分离。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62203/62203fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：通过高压挤出装置将预形成的微泡压缩为相变纳米液滴的示意图。 将微泡溶液加入并置于挤出室中，来自氮气罐的250 psi压力通过室入口阀施加。氮气将推动微泡溶液穿过室底部的滤膜，使样品压缩为纳米液滴。最终，溶液通过样品出口管被推出挤出器并收集。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62203/62203fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Falcon</td><td>352095</td><td>收集和离心液滴</td></tr><tr><td>200 nm 聚碳酸酯滤膜</td><td>Whatman</td><td>110606</td><td>挤出器滤膜</td></tr><tr><td>2-甲基丁烷</td><td>Fisher Chemical</td><td>03551-4</td><td>挤出前快速预冷微泡溶液</td></tr><tr><td>三爪夹 X2</td><td>Fisher</td><td>02-217-002</td><td>固定闪烁瓶以进行探头超声处理</td></tr><tr><td>400W 模拟探头式超声仪（带喇叭头）</td><td>Branson</td><td>101-063-198R</td><td>用于从脂质溶液中生成脂质微泡</td></tr><tr><td>水浴超声仪</td><td>Fisher Scientific</td><td>15337402</td><td>帮助将脂质体分解为单层囊泡</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>C298-4</td><td>用于制备微泡前的脂质薄膜</td></tr><tr><td>十氟丁烷（全氟丁烷）气体</td><td>FluoroMed L.P.</td><td>1 kg</td><td>通过探头超声法生成微泡</td></tr><tr><td>干冰</td><td>-</td><td>-</td><td>挤出前快速预冷微泡溶液</td></tr><tr><td>DSPC 脂质粉末</td><td>NOF America</td><td>COATSOME MC-8080</td><td>脂质薄膜组分</td></tr><tr><td>DSPE-PEG-2K 脂质粉末</td><td>NOF America</td><td>SUNBRIGHT DSPE-020CN</td><td>脂质薄膜组分</td></tr><tr><td>普通温度计</td><td>-</td><td>-</td><td>用于测量冰浴和2-甲基丁烷的温度（需可测量-20°C温度）</td></tr><tr><td>玻璃注射器</td><td>Hamilton</td><td>81139</td><td>用于在氯仿中混合脂质</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP229-1</td><td>降低PBS溶液的冰点</td></tr><tr><td>加热金属块</td><td>VWR Scientific Products</td><td></td><td>加热脂质薄膜及汽化液滴</td></tr><tr><td>Lipex 10 mL 挤出器</td><td>Evonik</td><td></td><td>商用高压挤出系统</td></tr><tr><td>小型涡旋混合器</td><td>Fisher brand</td><td>14-955-151</td><td>用于去除脂质薄膜中残留的氯仿</td></tr><tr><td>氮气罐</td><td>-</td><td>-</td><td>用于驱动挤出器运行</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>用于水合脂质薄膜及洗涤液滴</td></tr><tr><td>聚酯排水盘</td><td>Whatman</td><td>230600</td><td>为聚碳酸酯滤膜提供支撑</td></tr><tr><td>聚丙烯盖帽</td><td>Fisher Scientific</td><td>298417</td><td>用于溶液储存</td></tr><tr><td>丙二醇</td><td>Fisher Chemical</td><td>P355-1</td><td>降低PBS溶液的冰点</td></tr><tr><td>闪烁瓶</td><td>DWK Life Sciences Wheaton</td><td>986532</td><td>用于制备脂质薄膜及生成微泡</td></tr><tr><td>小锤</td><td>-</td><td>-</td><td>用于击碎干冰以冷却甲基丁烷</td></tr><tr><td>超声仪微探头附件</td><td>Branson</td><td>101148070</td><td>用于从脂质溶液中生成微泡</td></tr><tr><td>钢制容器</td><td>Medegen</td><td>79310</td><td>挤出前快速预冷微泡溶液（任何可耐-20°C的容器均可使用）</td></tr><tr><td>真空干燥器</td><td>Bel-Art SP Scienceware</td><td>08-648-100</td><td>去除脂质薄膜中残留的氯仿</td></tr><tr><td>2 mL 离心管</td><td>Fisher</td><td>02682004</td><td>用于浓缩纳米液滴</td></tr></tbody></table>

由预成型微泡制备膜过滤相变十氟丁烷纳米液滴

Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles

有多种方法可用于制备适用于成像和治疗的可汽化相变液滴。每种方法采用的技术不同，在价格、材料和用途方面也各不相同。许多这些制备方法会产生粒径分布不均的液滴群体，其激活阈值不一致。此外，控制液滴尺寸通常需要使用高激活阈值的稳定全氟碳液体，而这类液体在体内应用中并不实用。使用低沸点气体生成尺寸均一的液滴，将有利于体内的成像和治疗实验。本文介绍一种简单且经济的方法，用于制备经尺寸筛选、脂质稳定的低沸点十氟丁烷（DFB）相变纳米液滴。文中描述了一种常见的脂质微泡制备方法，以及一种通过高压挤出在单一步骤内将其冷凝的新颖方法。该方法旨在节省时间、提高效率，并利用许多生物实验室常见的常规实验设备，制备出适用于多种应用的大体积微泡和纳米液滴溶液。

通过动态光散射（DLS）和可调电阻脉冲传感（TRPS）分析，展示了粒径分布的代表性结果。图5显示了经或未经挤出处理的浓缩气泡溶液的粒径分布。未进行挤出处理时，实验流程在步骤5.3结束。在低温条件下将样品释放至大气压，使冷却后的气泡发生浓缩。仅浓缩的样品显示出较宽的粒径分布，峰值集中在约400 nm附近；而经过挤出处理的样品则具有更窄的分布，峰值位于200 nm。两种样品均包含脂质体和液滴，但DLS无法区分二者。图6展示了在通过离心洗涤去除多余脂质体后（步骤6.7）的相变液滴的代表性样品。本分析采用TRPS技术，以单独评估液滴的粒径分布和浓度。与DLS结果类似，TRPS显示液滴粒径集中在200 nm左右。将最终液滴溶液100 µL全部重悬于1 mL溶液中后，液滴浓度范围为每毫升1011–1012个。TRPS数据为每个样品三次测量的平均值。
图7 展示了纳米液滴受热...

本方案描述了一种利用探头式超声法生成大量脂质包裹的全氟丁烷微泡，并通过高压挤出和机械过滤将其进一步冷凝为相变纳米液滴的方法。

可用于制备可汽化相变液滴以用于成像和治疗的方法有多种。每种方法均采用不同的……

本方案是一种降低低沸点可汽化液滴多分散性的简便方法，可用于生物医学应用。该技术通过可控、可放大且相对经济的方式，将预先形成的气体微泡冷凝，并对生成的液滴按尺寸进行过滤。该方法可适用于多种具有不同壳材和气体成分的脂质微泡，并可通过使用不同的滤膜来调控最终液滴的尺寸。本实验操作将由来自Sirsi博士实验室的本科研究人员Darrah Merillat进行演示。打开超声波破碎仪的电源开关，将振幅调节至微尖附件允许的最大值，并确保超声时间为10秒。将温热的水合脂质溶液放入隔音箱中，使微尖探头刚好置于液面下方。将适当长度的导管连接到小瓶的瓶口，以引导DFB储气罐出口的气体进入密闭腔室内温热的脂质溶液中。缓慢打开储气罐阀门，直至观察到气体流经脂质溶液表面，在液面上产生轻微的涟漪。若气体流速过高，在微泡形成过程中溶液会溢出。启动超声波破碎仪，连续运行10秒以生成微泡。超声处理结束后，立即关闭DFB反应罐的阀门。迅速盖紧微泡溶液瓶盖，并将样品瓶浸入冰浴中，使样品温度降至55摄氏度以下。根据使用手册，使用200纳米陶瓷滤膜组装高压挤出器，并将其置于密闭容器中央，确保样品出口管未被压在容器侧壁上或发生折弯。使用制造商提供的接头将挤出器连接至氮气瓶。将出口管末端放入闪烁计数瓶中以收集挤出的样品，并用胶带将管子固定在容器上，确保其保持在瓶内。打开并关闭释放阀，确保挤出机内部无压力。取下腔室盖，向挤出机腔室内加入 5 毫升 PBS。盖上盖子，确保其牢固扣合到位。打开氮气罐，使压力表读数为 250 PSI，同时确保压力控制阀处于关闭状态。关闭气罐，打开挤出器腔室的进气阀，使 PBS 溶液被推动通过系统，从样品出口管排出至闪烁瓶中。当仅有气体从管路中排出时，打开泄压阀，使压力降至0 PSI。随后取下闪烁计数小瓶。反复打开和关闭泄压阀，确认挤出器内部无残留压力，然后在出口管末端放置一个新的闪烁计数小瓶。将钢制容器中装入2-甲基丁烷，并加入干冰以使温度降至零下18摄氏度。将微泡溶液插入冷却后的2-甲基丁烷中，使样品浸没两分钟。在两分钟内轻轻移动闪烁小瓶，以温和混匀气泡。根据需要添加干冰，以维持温度在负15至负18摄氏度之间。两分钟后，将微泡从冷却的2-甲基丁烷中取出。轻轻旋转小瓶以混匀微泡，并将气泡转移至预冷的10毫升注射器中。取下挤出器腔室盖，通过缓慢推动注射器活塞将微泡溶液加入腔室中。重新装上挤出器盖，确保其牢固卡紧。检查挤出器的压力控制阀和释放阀是否处于关闭位置。打开氮气罐阀门，直至压力表读数为250 PSI。关闭气罐阀门，将压力控制阀调至开启位置。当溶液已充满出口管路中的闪烁小瓶且仅有气体从管路中排出时，缓慢打开压力释放阀，使压力逐渐降至0 PSI。将10毫升挤出的液滴溶液转移至15毫升离心管中。在4°C条件下，以1,500 ×g离心力离心10分钟。弃去上清液以及在溶液顶部自发蒸发形成的液滴。将含有DFP纳米液滴的沉淀物重悬于10毫升含20%甘油和20%丙二醇的PBS中。经或未经挤出处理的浓缩气泡溶液的粒径分布显示，仅浓缩的样品分布范围更宽，峰值集中在约400纳米附近，而经过挤出处理的样品分布更窄，峰值位于200纳米。采用可调电阻脉冲传感分析对经离心洗涤以去除过量脂质体后的相变液滴进行分析，结果显示液滴大小约为200纳米。加热时纳米液滴汽化的显微镜数据显示，在加热前视野中已有一些自发汽化的微气泡，而加热后观察到更多的气体微气泡。此处展示了未预冷却直接注入挤出器、在0摄氏度下冷凝以及在零下18摄氏度下冷凝的纳米液滴的显微镜图像。代表性图像显示，八氟丙烷液滴在汽化前后均有冷凝现象，且加热后气体微气泡数量显著增加，与DFB液滴的结果相似。在此操作过程中，最重要的是要记住，液滴的产率高度依赖于冷凝过程中的温度和压力，微小的波动都会影响实验结果。在生成可气化的液滴后，可将其用于优化基于超声的活体成像和药物递送，以及其他活体和离体应用。在本技术建立之后，已通过对此方案进行微小修改，探索了纳米液滴尺寸和气体核心含量对活体内气化阈值的影响。

production-membrane-filtered-phase-shift-decafluorobutane

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

从预成型微气泡生产膜过滤相移十氟丁烷纳米滴

相变型纳米乳剂（PSNE）可通过高强度聚焦超声触发汽化，从而增强局部加热效果，提高肿瘤热消融效率。本报告描述了具有窄粒径分布的稳定PSNE的制备方法，并在模拟组织的体模中展示了汽化后PSNE对超声介导消融效果的影响。...

用于声致液滴汽化及气泡增强超声介导消融的窄分布相变型纳米乳液的合成

用于单个DNA分子大规模并行蛋白质合成的飞升级液滴阵列

本文所述方案可用于表征用于超声触发药物递送应用的荧光标记微泡的响应特性，包括其激活机制及其生物效应。本文涵盖了一系列 体外 和 体内...

用于表征荧光标记微泡在超声触发药物释放中应用的多时间尺度显微方法

本方案概述了多模态相变卟啉液滴的合成与表征方法。...

多模态相变卟啉液滴的合成与表征

光激活的全氟碳纳米液滴在血管系统外的成像应用中展现出良好的前景。本文将演示如何合成这些颗粒、交联聚丙烯酰胺仿组织体模，并通过声学调控增强其信号。...

光触发汽化全氟碳纳米液滴的制备及声学调控

本方案概述了脂质微泡的制备方法，以及一种兼容的“一锅法”微泡放射性标记技术，该方法标记效率超过&gt;95%，无需纯化步骤，且能保持微泡的理化特性。该方法适用于多种不同的脂质微泡配方，可根据需要定制，以制备放射性标记和/或荧光标记的微泡。...

制备并使用荧光和放射性示踪剂标记微泡

尽管蜘蛛丝具有优异的机械和生化特性，但无法通过传统方法大量采集这种材料。本文介绍了一种高效制备人造蜘蛛丝纤维的策略，这对于研究蜘蛛丝生成及其作为新一代生物材料应用的科研人员而言，是一项重要的工艺过程。...

实验室规模的合成蜘蛛丝生产

我们介绍一种利用市售微孔板生成大量（数千至数十万个）尺寸和组分均一可控的肿瘤类球体的实验方案。...

使用微孔板大规模制备尺寸可控的肿瘤球体

我们提供了利用特定长度的硫代磷酸酯DNA制备单价靶向量子点（mQDs）的详细步骤。DNA缠绕反应产率高，因此产物无需纯化。我们展示了如何利用SNAP标签将mQDs靶向至细胞表面受体，用于活细胞成像应用。...

单价量子点的制备与靶向

竹粉经NaOH预处理后进行酶水解。将竹粉水解产物作为底物，用于肺炎克雷伯菌（Klebsiella...

化学品的生产 肺炎克雷伯菌 使用竹类水解物作为原料

了解利用预成型微气泡制备十氟丁烷相移纳米滴的方法。该方案通过冷凝与高压挤出技术控制液滴尺寸，显著降低多分散性，为生物医学成像和药物递送提供均匀、可扩展的纳米颗粒制备途径。

由预成型微泡制备膜过滤相变十氟丁烷纳米液滴

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