从患者外周血单个核细胞生成与扩增人心肌细胞

本方案全面涵盖了从外周血单个核细胞中建立患者特异性细胞培养物的完整流程、原始增强子的生成及应用。该方法具有良好的可重复性，易于操作，尤其适合初学者，并且无需具备干细胞生物学或心血管医学方面的特殊专业知识。

本方案可用于通过单次抽血获取患者特异的心肌细胞，这些细胞可应用于心血管疾病建模以及新型药物心脏毒性的检测。该方案需要投入较长时间进行干细胞重编程、维持培养及定向分化。然而，您将切实感受到所付出努力的价值。

当在培养皿中观察到跳动的心肌细胞时。当人iPSC集落融合度达到90%以上时，每孔用三毫升DPBS冲洗一次，然后每孔加入一毫升含0.5毫摩尔EDTA的DPBS溶液，在37摄氏度条件下处理细胞。五至八分钟后，每孔加入一毫升iPSC传代培养基，并手动吹打使细胞脱落。

将600至900微升细胞转移至已包被基底膜的6孔板中的各个孔内，在37摄氏度及5%二氧化碳条件下过夜培养。随后每天更换2毫升完全E8培养基，持续3至4天。当细胞培养达到汇合状态时，将培养基更换为2毫升心肌细胞分化培养基，每孔2毫升。

第二天，将上清液更换为两毫升心肌细胞分化培养基一。第三天，将上清液更换为两毫升心肌细胞分化培养基三。第五天。

在第7天至第10天，用2毫升心肌细胞分化培养基一替换上清液。在第11天和第13天，用2毫升心肌细胞分化培养基四替换上清液。

观察到细胞开始收缩后，在第15、17、19和21天，将上清液更换为2毫升心肌细胞分化培养基五；之后，将上清液更换为2毫升心肌细胞分化培养基四。

每七天使用完全血液培养基进行预培养后，外周血单个核细胞（PBMC）体积变大，细胞核和细胞质清晰可见，表明其已准备好用于仙台病毒重编程因子的转染。转入完全E8培养基后，完全重编程的细胞将贴壁并开始形成克隆集落。

经过四到五次传代后，重编程的细胞将形成高纯度的iPSC克隆，几乎观察不到分化细胞。在此阶段，大多数细胞呈OCT4和NANOG阳性，表明其具有多能性。通常在分化12天后可观察到跳动的心肌细胞。

葡萄糖饥饿后，重铺板的iPSC心肌细胞表现出自发性搏动，以及排列整齐的肌节结构，并表达交错分布的心肌肌钙蛋白T和α-辅肌动蛋白。这些细胞集落保持了其纯度，表现为表达肌钙蛋白T。尽管iPSC心肌细胞相较于成人心肌细胞相对不成熟。

通过全细胞膜片钳技术检测，它们表现出类似心室和心房的动作电位。心室样心肌细胞表达肌球蛋白轻链2，而心房样诱导多能干细胞来源的心肌细胞则以NR2F2的表达为特征。Wnt激活可刺激细胞分裂，并促进细胞周期调控因子的表达。

有趣的是，与对照组相比，Wnt 激活还可诱导早期 iPSC 心肌细胞在连续传代两次过程中显著增殖，尽管这种增殖能力会随着时间推移而减弱。在引入 iPSC 重编程载体之前，必须确保 PBMS 细胞体积增大，并具有清晰的细胞核和细胞质，因为 PBM 细胞的状态对 iPSC 重编程至关重要。患者特异性心肌细胞对于在体外建立心血管疾病模型以及为心脏干细胞治疗提供大量供体细胞具有重要价值。