Name: 患者外周血单核细胞中人心肌细胞的生成和扩增 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 38 s
Description: 了解如何利用干细胞重编程技术从患者外周血单核细胞生成和扩增心肌细胞。该方法适用于心血管疾病建模和药物心脏毒性测试，操作简便且可重复。

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本研究由美国心脏协会（AHA）职业发展奖 18CDA34110293（M-T.Z.）、Additional Ventures AVIF 和 SVRF 奖项（M-T.Z.）、美国国立卫生研究院（NIH/NHLBI）资助项目 1R01HL124245、1R01HL132520 和 R01HL096962（I.D.）提供支持。Ming-Tao Zhao 博士还获得了全美儿童医院阿比盖尔·韦克斯纳研究所启动资金的支持。

本研究中涉及人类受试者的实验方案和知情同意书已获得全美儿童医院机构审查委员会（IRB）的批准。
1. 细胞培养基、溶液和试剂的准备
<ol>
	<li>准备外周血单个核细胞（PBMC）培养基
	<ol>
		<li>将20 mL基础PBMC培养基（1x）与0.52 mL补充剂混合。加入干细胞因子（SCF）和FLT3各20 μL（储存浓度：100 μg/mL），白细胞介素-3（IL3）、白细胞介素-6（IL6）和促红细胞生成素（EPO）各4 μL（储存浓度：100 μg/mL），以及200 μL L-谷氨酰胺替代物（100x）。充分混匀。在无菌操作台中使用0.22-μm滤器过滤。将此培养基命名为完全血液培养基（Complete Blood Media）。</li>
		<li>将20 mL基础PBMC培养基（1x）与0.52 mL补充剂混合。加入200 μL L-谷氨酰胺替代物（100x）。充分混匀。使用0.22-μm滤器过滤。将此培养基命名为补充血液培养基（Supplement Blood Media）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备完全E8培养基
	<ol>
		<li>将500 mL E8基础培养基与10 mL E8补充剂（于4 °C过夜解冻）混合，配制成完全E8培养基。使用前平衡至室温（RT）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备诱导多能干细胞（iPSC）传代培养基
	<ol>
		<li>将40 μL Y-27632 ROCK抑制剂（1:5,000稀释，储存浓度：10 mM）加入200 mL完全E8培养基中。充分混匀。使用前平衡至室温（RT）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备心肌细胞分化培养基
	<ol>
		<li>培养基I：将500 mL RPMI1640培养基与10 mL不含胰岛素的B27补充剂（50x）混合。</li>
		<li>培养基II：向培养基I中加入适量体积的CHIR99021（GSK3抑制剂）储存液（终浓度为6 μM）。充分混匀。</li>
		<li>培养基III：向培养基I中加入适量体积的IWR-1（Wnt抑制剂）储存液（IWR-1&#160;终浓度为5 μM）。充分混匀。</li>
		<li>培养基IV：将500 mL RPMI1640培养基与10 mL B27补充剂（50x）混合。充分混匀。</li>
		<li>培养基V：将500 mL无葡萄糖RPMI1640培养基与10 mL B27补充剂（50x）混合。充分混匀。</li>
		<li>培养基VI：向培养基IV中加入适量体积的CHIR99021储存液（终浓度为2 μM）。充分混匀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备诱导多能干细胞来源心肌细胞（iPSC-CM）传代培养基
	<ol>
		<li>将10 mL Knockout血清替代物（KSR）加入90 mL培养基IV中（KSR终浓度为10%）。充分混匀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备诱导多能干细胞来源心肌细胞（iPSC-CM）冻存培养基
	<ol>
		<li>将1 mL DMSO加入9 mL KSR中（终浓度：10% DMSO / 90% KSR），充分混匀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备基底膜基质中等浓度包被培养板
	<ol>
		<li>于4 °C过夜解冻基底膜基质中等浓度溶液，并分装至1.5 mL离心管中。取1 mL该溶液加入250 mL DMEM/F12培养基中（1:250稀释），充分混匀。每6孔板孔中加入2 mL稀释液，于37 °C、5% CO2条件下孵育30分钟后再使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. PBMC的iPSC重编程
<ol>
	<li>从血样中分离外周血单个核细胞（PBMCs）。
	<ol>
		<li>采集患者血液样本（约5 mL），转移至血细胞分离管中（参见 材料表）。上下颠倒轻柔混匀10次。</li>
		<li>1,500 x g 离心 g 室温下孵育30分钟。</li>
		<li>小心取出试管，喷洒70%乙醇。在生物安全柜中，打开管盖时避免扰动单个核细胞（白膜层）。外周血单个核细胞（PBMCs）将位于血浆层下方的灰白色层中。图1A). 使用 1000 μL 移液器收集完整的白膜层 &#956;L 移液器转移至 15 mL 圆锥形管中。</li>
		<li>使用自动细胞计数器对细胞数量进行计数。在300 x g 在室温下持续 25 分钟。</li>
		<li>弃去上清液。用 10 mL DPBS（Ca2+/Mg2+ 免费）。</li>
		<li>以 300 x g 室温下孵育15分钟。</li>
		<li>移除上清液。将细胞沉淀重悬于1 mL冻存培养基（KSR加10% DMSO）中。调整细胞密度至1 × 10⁶6 每管细胞数。</li>
		<li>将PBMC冻存管放入细胞冻存盒中，并于-80℃保存 &#176;4°C 过夜。次日转移至液氮罐中长期保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>iPSC重编程
	<ol>
		<li>在15 mL锥形管中加入3 mL补充血液培养基。将PBMCs在37 &#176;C 水浴中，并转移至一个锥形管中。在 300 x g 室温下持续 7 分钟。</li>
		<li>弃去上清液。用完全血液培养基重悬外周血单个核细胞（PBMCs），接种至24孔组织培养板的两个孔中（无需基底膜基质）。</li>
		<li>在5% CO₂条件下孵育2 在 37 &#730;C过夜。第二天，轻轻移除一半旧培养基（0.5 mL），并加入0.5 mL新鲜的完全血液培养基。</li>
		<li>每隔一天更换一次培养基，通过补充一半体积的旧培养基进行更新。</li>
		<li>一周后，用1 mL补充血液培养基剧烈冲洗孔板，并将细胞转移至15 mL离心管中。</li>
		<li>计数细胞数量。取 2 x 105 细胞并在 300 x g 7 分钟</li>
		<li>弃去上清液。用 300 &#956;L 完全血液培养基中。根据生产商说明书，加入适量的仙台病毒重编程载体进行转染。将细胞接种至24孔板的一个孔中（无需基底膜基质）。在5% CO₂条件下培养2 在 37 &#176;C 过夜。</li>
		<li>第二天以 300 x g 7 分钟后，移除上清液，加入 2 mL 完全血液培养基重悬细胞，转移至预先包被基底膜基质的 6 孔板中的一个孔。此为第 1 天（D1）。</li>
		<li>第二天不要触碰培养板。</li>
		<li>在第3天，移除1 mL旧培养基，加入1 mL补充血液培养基。</li>
		<li>在第5天重复步骤2.2.10。</li>
		<li>在第7天，移除1 mL旧培养基，加入1 mL完全E8培养基。</li>
		<li>在第8天，重复步骤2.2.12。</li>
		<li>在第9天，移除旧培养基，加入2 mL完全E8培养基。完全重编程的细胞应已贴壁并开始形成克隆。</li>
		<li>每天用 2 mL 完全 E8 培养基更换一次。</li>
		<li>在仙台病毒转导约2周后，将出现大量可进行挑取的iPSC克隆。</li>
		<li>在生物安全柜内的体视显微镜下将iPSC集落切割，并将单个集落转移至预先加入0.5 mL iPSC传代培养基的基底膜基质包被的24孔板中。</li>
		<li>每天用 0.5 mL 完全 E8 培养基更换一次，直至 iPSC 克隆生长至足够大，可传代至新的基底膜基质包被的 6 孔板中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 人iPSC的维持与传代
<ol>
	<li>当人iPSCs达到90%以上汇合度时，移除旧培养基，用3 mL DPBS冲洗一次。</li>
	<li>加入1 mL含0.5 mM EDTA的DPBS溶液，在5% CO2、37 °C条件下孵育5–8分钟。</li>
	<li>吸除EDTA溶液，加入1 mL iPSC传代培养基，手动吹打使iPSCs脱落。</li>
	<li>取600–900 μL单细胞悬液，以1:6至1:10的比例接种至基底膜基质包被的6孔板中。在5% CO2、37 °C条件下过夜培养。</li>
	<li>每天更换2 mL完全E8培养基。iPSC培养物通常在3–4天后达到汇合状态。</li>
</ol>
4. 化学成分明确的心肌细胞分化
<ol>
	<li>将人iPSC在完全E8培养基中培养至95%汇合度（3-4天）。</li>
	<li>移除旧培养基。向6孔板的每孔加入2 mL CM分化培养基II（含6 μM CHIR的RPMI1640培养基，添加B27不含胰岛素补充剂）。此为第0天（D0）。第1天（D1）无需处理。</li>
	<li>第2天（D2），更换为2 mL CM分化培养基I（RPMI1640培养基，添加B27不含胰岛素补充剂）。</li>
	<li>第3天（D3），更换为2 mL CM分化培养基III（含5 μM IWR-1的RPMI1640培养基，添加B27不含胰岛素补充剂）。第4天（D4）无需处理。</li>
	<li>第5天（D5），更换为2 mL CM分化培养基I。</li>
	<li>第7天（D7），更换为2 mL CM分化培养基IV（RPMI1640培养基，添加B27补充剂）。此后每隔一天更换一次培养基。</li>
	<li>第11天（D11）观察到细胞收缩时，更换为2 mL CM分化培养基V（无葡萄糖）。</li>
	<li>第13天（D13），更换为2 mL CM分化培养基V。</li>
	<li>第15天（D15），更换为2 mL CM分化培养基IV。</li>
	<li>第17至21天（D17-D21），每隔一天更换一次2 mL CM分化培养基IV。</li>
</ol>
5. 传代人iPSC-CMs
<ol>
	<li>移除旧的培养基，用 3 mL DPBS 清洗细胞一次。</li>
	<li>向 6 孔板的每孔中加入 1 mL CM 解离溶液（参见材料表），在 5% CO2、37 °C 条件下孵育 5–8 分钟。</li>
	<li>通过剧烈吹打将 iPSC-CMs 机械解离为单细胞。</li>
	<li>将细胞转移至 15 mL 圆底离心管中，加入 2 mL CM 传代培养基（含 10% KSR 的 RMPI1640 加 B27 补充剂）以中和 CM 解离溶液。</li>
	<li>在室温下以 300 x g 离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，用适量 CM 传代培养基重悬细胞，接种至基底膜基质包被的培养板/皿中。人 iPSC-CMs 在传代后 1–3 天恢复搏动。</li>
</ol>
6. 人iPSC-CMs的扩增
<ol>
	<li>用 3 mL DPBS 将 6 孔板中每孔的 D10-12 期跳动的 iPSC-CMs 清洗一次。每孔加入 1 mL CM 解离液（步骤 5.2）。在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 7–10 分钟。</li>
	<li>通过剧烈吹打将 iPSC-CMs 机械解离为单细胞。</li>
	<li>将细胞转移至 15 mL 圆底离心管中。加入 2 mL CM 传代培养基以中和 CM 解离液。</li>
	<li>在室温下以 300 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液。用适量 CM 传代培养基重悬细胞，反复吹打形成单细胞悬液。将一百万个 iPSC-CMs 接种至基底膜基质包被的 10 cm 培养皿中。</li>
	<li>次日更换旧培养基，加入 10 mL 心肌细胞增殖培养基（培养基 VI：含 2 μM CHIR99021）。每隔一天更换一次培养基。</li>
	<li>当 iPSC-CMs 经 7–9 天培养达到汇合状态后，重复传代步骤以进一步扩增 iPSC-CMs。</li>
</ol>
7. 免疫荧光
<ol>
	<li>免疫荧光染色前，将iPSC-CMs接种于置于24孔板中的基底膜基质包被的盖玻片上（接种密度：0.5-1 × 106 细胞/mL）。将iPSC-CMs在培养条件下维持至少4天。</li>
	<li>用1 mL DPBS洗涤细胞一次。</li>
	<li>加入0.5 mL 4%多聚甲醛（PFA），室温孵育15分钟。</li>
	<li>用1 mL DPBS洗涤细胞，重复一次。</li>
	<li>加入0.5 mL 0.1% Triton X-100，室温孵育20分钟。</li>
	<li>用1 mL DPBS洗涤两次。</li>
	<li>加入0.5 mL含0.2% BSA的DPBS（封闭液），室温孵育1小时。</li>
	<li>加入用封闭液稀释的一抗（稀释比例：1:400–1:1000），总量200 μL，4 °C孵育过夜。</li>
	<li>用0.5 mL封闭液振荡洗涤细胞，每次3分钟，重复两次。</li>
	<li>加入200 μL用封闭液稀释的二抗，室温孵育1小时。</li>
	<li>用0.5 mL DPBS振荡洗涤细胞三次，每次3分钟。</li>
	<li>用DAPI（1:2000稀释）对细胞核进行复染，室温孵育5分钟。</li>
	<li>用0.5 mL DPBS洗涤细胞三次。</li>
	<li>取5 μL封片剂将盖玻片上的细胞封固于显微镜载玻片上，4 °C保存并避光。</li>
</ol>
8. 流式细胞术样品制备
<ol>
	<li>用 3 mL DPBS 将人 iPSC-CMs 洗涤一次。</li>
	<li>加入1 mL CM解离溶液，于5% CO₂中孵育2 在 37 &#176;C，7-10 分钟。</li>
	<li>使用 1,000-&#956;L型移液管。将细胞悬液通过滤嘴盖转移至圆底FACS管中。FACS管中预先加入1 mL iPSC-CM传代培养基（10% KSR），以中和酶活性。</li>
	<li>300 x g 离心 g 5 分钟</li>
	<li>移除上清液，注意不要扰动细胞沉淀。加入 250 &#956;L 固定/破膜溶液（见材料表）。4 ℃孵育 20 分钟 &#176;C.</li>
	<li>加入 1 mL 破膜/洗涤缓冲液。短暂涡旋振荡，然后以 300 x g 4 分钟</li>
	<li>弃去上清液。加入 100 &#956;稀释的一抗溶液（1:200–1:500）1 L，溶于1×破膜/洗涤缓冲液中。短暂涡旋混匀，4 °C过夜孵育 &#176;C.</li>
	<li>加入 1 mL 破膜/洗涤缓冲液重悬细胞，短暂涡旋振荡后，于 300 x g 4 分钟</li>
	<li>弃去上清液。加入 100 &#956;稀释后的二抗溶液（1:500–1:1,000），涡旋混匀片刻，在室温下避光孵育1小时。若二抗偶联有光敏性荧光基团，需避光处理。</li>
	<li>加入1 mL破膜/洗涤缓冲液重悬细胞，短暂涡旋后在300g下离心4分钟。</li>
	<li>弃去上清液。用 400 &#956;升 FACS 染色缓冲液（PBS/4% FBS）。4℃保存 &#176;C，直至上样至流式细胞仪。</li>
</ol>
9. 实时定量PCR
<ol>
	<li>移除人iPSC-CM培养中的旧培养基。加入500-700 &#956;加入裂解缓冲液 L 以裂解细胞，在室温孵育 3 分钟。刮取细胞裂解液并转移至 1.5 ml 无 RNase 的离心管中。立即进行总 RNA 提取，或于 -80 ℃ 保存 &#176;C.</li>
	<li>使用RNA提取试剂盒，按照制造商说明书提取总RNA。</li>
	<li>使用分光光度计测定RNA浓度并评估总RNA的质量。</li>
	<li>使用cDNA合成试剂盒进行逆转录反应。逆转录反应的总体积为20 &#956;L 包括 4 &#956;反应混合液（5倍浓度），1 L &#956;L 逆转录酶，1 &#956;总RNA 和无RNase水的克数。</li>
	<li>将完整的逆转录反应体系置于热循环仪中，按照以下程序孵育：25 &#176;C，5 分钟；46 &#176;C，20 分钟；95 &#176;C 1 分钟；4 ℃ 保存 &#176;C.</li>
	<li>使用无核酸酶水将 cDNA 按 1:10 比例稀释。通过混合 1 &#956;cDNA模板L，1 &#956;L 引物/探针，10 &#956;微升 qPCR 预混液和 8 &#956;无核酸酶水 L</li>
	<li>在实时 PCR 系统中运行。循环程序为 50 &#176;C 2 分钟（保持），95 &#730;C 10 分钟（保持），95 &#176;C 15秒，60 &#176;C 1分钟，重复40个循环。</li>
	<li>收集 CT 每个样本中每个基因的值。通过从CT 目标基因的C值T 内参基因的值。相对基因表达通过2-&#916;&#916;计算机断层扫描 方法。</li>
</ol>
10. 全细胞膜片钳记录
<ol>
	<li>使用先前所述的CM解离溶液将iPSC-CMs解离为单个细胞。</li>
	<li>将细胞以较低密度接种于包被有基底膜基质的盖玻片上，在培养基IV中培养3-4天。</li>
	<li>使用水平微电极拉制仪从硼硅酸盐玻璃毛细管中拉制移液管（电阻为0.9-1.5 MΩ）。</li>
	<li>用Tyrode溶液（pH=7.35）孵育细胞。</li>
	<li>用包含以下成分的电极溶液（pH=7.3）填充移液管：120 mM天冬氨酸、20 mM KCl、2 mM MgCl2、5 mM HEPES、10 mM NaCl、5 mM EGTA、0.3 mM Na-GTP、14 mM磷酸肌酸、4 mM K-ATP和2 mM肌酸磷酸激酶。</li>
	<li>将细胞置于电流钳模式下，使用1.5-2倍舒张期阈值、持续5 ms、频率为1 Hz的电流脉冲。</li>
	<li>使用微电极放大器和软件驱动的数据采集板记录动作电位（APs）。</li>
</ol>

<ol><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
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<li>Heallen, T. R., Kadow, Z. A., Wang, J., Martin, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+cardiac+growth+and+size%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Determinants of cardiac growth and size.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (3), 037150(2020).</li>
<li>Campa, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+activates+cell+cycle+reentry+and+progression+in+quiescent+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Notch activates cell cycle reentry and progression in quiescent cardiomyocytes.</a> Journal of Cell Biology. 183 (1), 129-141 (2008).</li>
<li>Collesi, C., Zentilin, L., Sinagra, G., Giacca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch1+signaling+stimulates+proliferation+of+immature+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Notch1 signaling stimulates proliferation of immature cardiomyocytes.</a> Journal of Cell Biology. 183 (1), 117-128 (2008).</li>
<li>Heallen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippo+pathway+inhibits+Wnt+signaling+to+restrain+cardiomyocyte+proliferation+and+heart+size%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size.</a> Science. 332 (6028), 458-461 (2011).</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

在诱导多能干细胞（iPSC）重编程过程中，外周血单个核细胞（PBMCs）需培养1周，直至细胞体积增大，核与细胞质清晰可见。由于PBMCs本身不增殖，因此用于病毒转导的细胞数量对于iPSC重编程的成功至关重要。应综合考虑并调整PBMCs的细胞数量、感染复数（MOI）以及病毒滴度，以达到最佳的转导效果。在心肌分化过程中，初始接种密度对iPSCs在给予CHIR99021当天达到90%以上汇合度尤为关键。一方面，若在心肌分化时iPSCs汇合度不足，CHIR99021将产生毒性，导致大量细胞死亡；另一方面，若iPSCs过度汇合，则会发生自发性分化，从而降低定向心肌分化的效率。在早期iPSC来源的心肌细胞（iPSC-CMs）扩增过程中，需考虑操作时机和心肌细胞质量。仅当心肌细胞纯度足够高时，早期iPSC-CMs才能有效增殖。培养物中残留的非心肌细胞也可能在CHIR99021处理下增殖，从而对早期iPSC-CMs的扩增产生负面影响。此外，必须在分化第20天左右启动心肌细胞的扩增刺激。一旦iPSC-CMs超过分化第30天，其重新进入旺盛分裂的能力将显著下降。
人类iPSC最初通过逆转录病毒介导的转...

人类诱导性多能干细胞的发现彻底改变了现代心血管医学1,2。人iPSC具有自我更新能力，并可分化为心脏中的所有细胞类型，包括心肌细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和心脏成纤维细胞。来源于患者的iPSC心肌细胞（iPSC-CMs）可作为无限的资源，用于构建遗传性心血管疾病（CVDs）模型以及新药的心脏安全性测试3。特别是，患者来源的iPSC-CMs非常适合研究源于心肌细胞缺陷的遗传性和分子病因，例如长QT综合征4和扩张型心肌病（DCM）5。结合CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术，患者iPSC-CMs为理解包括先天性心脏病（CHDs）在内的复杂遗传性心血管疾病的遗传基础开辟了前所未有的途径6,7,8。人iPSC-CMs还展现出作为自体细胞来源用于补充心肌梗死期间受损心肌的潜力9。近年来，生成具有明确亚型（心房、心室和结状）的高质量人iPSC-CMs，已成为心脏再生和药物测试中的关键任务10。
过去十年中，人类诱导多能干细胞（iPSCs）向心肌细胞的分化技术取得了巨大进展。分化方法已从基于拟胚体（EB）的自发分化发展为化学成分明确且定向的心肌分化11。通过调控胚胎心脏发育中的关键信号分子（如Wnt、BMP、Nodal和FGF），可有效促进人类iPSCs向心肌细胞的分化10,12。其中重要突破包括对Wnt信号通路进行时序性调控（先激活后抑制），从而高效生成心肌细胞13,14。研究人员已开发出化学成分明确的心肌分化方案，以支持搏动心肌细胞的大规模生产15,16，该技术有望进一步升级至工业化和临床级生产水平。此外，通过使用小分子化合物CHIR99021持续激活Wnt信号通路，可实现早期人类iPSC来源心肌细胞（iPSC-CMs）的高效扩增17。最近的研究表明，在人类iPSCs向心肌细胞谱系分化的特定时间窗口内，调控视黄酸（RA）和Wnt信号通路，可生成特定亚型的心肌细胞18,19,20,21,22。
在本方案中，我们详细描述了一种由患者外周血单个核细胞高效生成并扩增人心肌细胞的工作流程。我们提供了以下实验方案：1）将人外周血单个核细胞重编程为诱导多能干细胞（iPSCs）；2）由人iPSCs高效生成跳动的心肌细胞；3）早期iPSC来源的心肌细胞（iPSC-CMs）的快速扩增；4）人iPSC-CMs的分子表征；以及5）通过膜片钳技术在单细胞水平对人iPSC-CMs进行电生理学检测。本方案涵盖了将患者血细胞转化为跳动心肌细胞的完整实验操作步骤。

<table><tbody><tr><td>ABI 7300 Fast 实时荧光定量 PCR 系统</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axon Axopatch 200B 微电极放大器</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>微电极放大器</td></tr><tr><td>B27添加剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>B27 补充剂（不含胰岛素）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm 固定/破膜试剂盒</td><td>BD 生物科学</td><td>554714</td><td>固定/透化液，透化/洗涤缓冲液</td></tr><tr><td>BD Vacutainer CPT 管</td><td>BD 生物科学</td><td>362753</td><td>血细胞分离管</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2924</td><td></td></tr><tr><td>CytoTune-iPS 2.0 仙台病毒重编程试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A16517</td><td>仙台病毒重编程试剂盒</td></tr><tr><td>Digidata 1200B</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>采集板</td></tr><tr><td>Direct-zol RNA Miniprep 试剂盒</td><td>Zymo Research</td><td>R2050</td><td>RNA提取试剂盒</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A1517001</td><td>用于iPSC培养的E8培养基</td></tr><tr><td>GlutaMAX 补充剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>35050061</td><td>L-谷氨酰胺替代物</td></tr><tr><td>生长因子减少型基质胶</td><td>康宁</td><td>356231</td><td>基底膜基质</td></tr><tr><td>iScript cDNA合成试剂盒</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1708891</td><td>cDNA合成</td></tr><tr><td>IWR-1-endo</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S7086</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut血清替代物（KSR）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 7.0</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>电生理数据采集 &amp;和分析软件</td></tr><tr><td>重组人EPO</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>PHC9631</td><td></td></tr><tr><td>重组人 FLT3</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>PHC9414</td><td></td></tr><tr><td>重组人IL3</td><td>Peprotech</td><td>200-03</td><td></td></tr><tr><td>重组人IL6</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>PHC0065</td><td></td></tr><tr><td>重组人 SCF</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基，无葡萄糖</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11879020</td><td></td></tr><tr><td>SlowFade Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>S36936</td><td>封片剂</td></tr><tr><td>StemPro-34 SFM</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10639011</td><td>PBMC 培养基</td></tr><tr><td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4444964</td><td>qPCR预混液</td></tr><tr><td>TrypLE Select 酶 10 倍浓度，无酚红</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A1217703</td><td>CM解离溶液</td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15575020</td><td>iPSC 解离液</td></tr><tr><td>Y-27632 2HCl</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1049</td><td></td></tr></tbody></table>

从患者外周血单个核细胞生成与扩增人心肌细胞

Generation and Expansion of Human Cardiomyocytes from Patient Peripheral Blood Mononuclear Cells

通过单次抽血获取患者特异性心肌细胞在心血管疾病精准医疗领域引起了广泛关注。人类诱导性多能干细胞（iPSCs）向心肌细胞的分化过程受到若干明确信号通路的调控，这些通路在胚胎心脏发育中起关键作用。目前已有多种在二维和三维平台上进行心肌分化的技术，其效率和心肌细胞产量各不相同。由于方法种类繁多，领域外的研究人员往往难以选择和掌握。本文提供了一套完整的实验方案，详细阐述了如何从外周血单个核细胞（PBMCs）高效生成并扩增患者特异性心肌细胞。我们首先介绍一种利用非整合型仙台病毒载体从患者血液样本高效重编程为iPSC的方案。随后详述一种基于小分子的单层分化方法，该方法可稳定地将大多数人iPSC系分化为能够搏动的心肌细胞。此外，还引入了一种可放大的心肌细胞扩增方案，使用小分子CHIR99021可快速扩增患者来源的心肌细胞，适用于工业级和临床级应用。最后，详细描述了对这些iPSC来源心肌细胞（iPSC-CMs）进行分子鉴定和电生理特性表征的实验流程。本方案力求实用，即使对心血管发育和干细胞生物学知识有限的新手研究人员也能顺利操作。

由外周血单个核细胞诱导人iPSC重编程 
在外周血完全培养基中预培养7天后，外周血单个核细胞（PBMCs）体积增大，细胞核与细胞质清晰可见（图1B），表明其已适合进行病毒转染。使用仙台病毒重编程因子转染后，PBMCs将再经历约一周的表观遗传重编程过程。通常情况下，每转染1 × 105个PBMCs可获得30–50个iPSC克隆，重编程效率为0.03%–0.05%。当完全重编程的细胞被转移至完全E8培养基时，它们会贴壁并开始形成克隆（图1C）。这些早期iPSC克隆再扩增培养7天后，通过机械法逐个切割并挑取。每个iPSC克隆被转移至6孔板中的一个孔，以建立独立的iPSC细胞系。经过4–5次传代后，iPSC克隆趋于纯化，周围仅有极少量分化细胞（图1D）。在此阶段，大多数iPSC克隆中的细胞均表达OCT4和NANOG（<strong class...

本文介绍了一种从患者外周血单个核细胞稳健地生成并扩增人心肌细胞的实验方案。

通过单次抽血获取患者特异性心肌细胞，在心血管疾病的精准医疗领域引起了广泛关注。

本方案全面涵盖了从外周血单个核细胞中建立患者特异性细胞培养物的完整流程、原始增强子的生成及应用。该方法具有良好的可重复性，易于操作，尤其适合初学者，并且无需具备干细胞生物学或心血管医学方面的特殊专业知识。本方案可用于通过单次抽血获取患者特异的心肌细胞，这些细胞可应用于心血管疾病建模以及新型药物心脏毒性的检测。该方案需要投入较长时间进行干细胞重编程、维持培养及定向分化。然而，您将切实感受到所付出努力的价值。当在培养皿中观察到跳动的心肌细胞时。当人iPSC集落融合度达到90%以上时，每孔用三毫升DPBS冲洗一次，然后每孔加入一毫升含0.5毫摩尔EDTA的DPBS溶液，在37摄氏度条件下处理细胞。五至八分钟后，每孔加入一毫升iPSC传代培养基，并手动吹打使细胞脱落。将600至900微升细胞转移至已包被基底膜的6孔板中的各个孔内，在37摄氏度及5%二氧化碳条件下过夜培养。随后每天更换2毫升完全E8培养基，持续3至4天。当细胞培养达到汇合状态时，将培养基更换为2毫升心肌细胞分化培养基，每孔2毫升。第二天，将上清液更换为两毫升心肌细胞分化培养基一。第三天，将上清液更换为两毫升心肌细胞分化培养基三。第五天。在第7天至第10天，用2毫升心肌细胞分化培养基一替换上清液。在第11天和第13天，用2毫升心肌细胞分化培养基四替换上清液。观察到细胞开始收缩后，在第15、17、19和21天，将上清液更换为2毫升心肌细胞分化培养基五；之后，将上清液更换为2毫升心肌细胞分化培养基四。每七天使用完全血液培养基进行预培养后，外周血单个核细胞（PBMC）体积变大，细胞核和细胞质清晰可见，表明其已准备好用于仙台病毒重编程因子的转染。转入完全E8培养基后，完全重编程的细胞将贴壁并开始形成克隆集落。经过四到五次传代后，重编程的细胞将形成高纯度的iPSC克隆，几乎观察不到分化细胞。在此阶段，大多数细胞呈OCT4和NANOG阳性，表明其具有多能性。通常在分化12天后可观察到跳动的心肌细胞。葡萄糖饥饿后，重铺板的iPSC心肌细胞表现出自发性搏动，以及排列整齐的肌节结构，并表达交错分布的心肌肌钙蛋白T和α-辅肌动蛋白。这些细胞集落保持了其纯度，表现为表达肌钙蛋白T。尽管iPSC心肌细胞相较于成人心肌细胞相对不成熟。通过全细胞膜片钳技术检测，它们表现出类似心室和心房的动作电位。心室样心肌细胞表达肌球蛋白轻链2，而心房样诱导多能干细胞来源的心肌细胞则以NR2F2的表达为特征。Wnt激活可刺激细胞分裂，并促进细胞周期调控因子的表达。有趣的是，与对照组相比，Wnt 激活还可诱导早期 iPSC 心肌细胞在连续传代两次过程中显著增殖，尽管这种增殖能力会随着时间推移而减弱。在引入 iPSC 重编程载体之前，必须确保 PBMS 细胞体积增大，并具有清晰的细胞核和细胞质，因为 PBM 细胞的状态对 iPSC 重编程至关重要。患者特异性心肌细胞对于在体外建立心血管疾病模型以及为心脏干细胞治疗提供大量供体细胞具有重要价值。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

患者外周血单核细胞中人心肌细胞的生成和扩增

我们已建立了一种在特定条件下利用小分子直接从多能性人胚胎干细胞诱导心肌母细胞的方案，该方法能够大量获得用于心血管修复的人心脏前体细胞和功能性心肌细胞。...

高效诱导多能人胚胎干细胞生成人心脏前体细胞和心肌细胞的小分子方法

生成排列整齐的心肌组织是将干细胞生物学的最新进展应用于临床实用目的的关键要求。本文中，我们描述了一种微接触印刷技术，可精确控制细胞形态与功能。利用高度纯化的胚胎干细胞来源的心脏前体细胞，我们进而生成了各向异性的功能性心肌组织。...

通过微接触印刷技术生成取向功能性心肌组织

多能干细胞，包括胚胎干细胞或诱导性多能干细胞（iPS细胞），是获取人类分化细胞（包括心肌细胞）的重要来源。本文将重点介绍iPS细胞向心脏细胞的诱导分化，展示如何通过基于拟胚体的方案获得功能性人类心肌细胞。...

人类心肌细胞的生成：从无饲养层人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞制备方案

本论文描述了利用表面标志物表达和细胞分选技术构建明确组成的工程化心肌组织的方法。这些明确组成的心肌组织随后可用于多组织生物反应器，以研究心脏细胞治疗的机制，从而提供一个具有功能性且可控的人类心脏模型系统。...

构建定义明确的人源工程化心肌组织以研究心肌细胞治疗机制

人类心脏组织中含有多种具有多向分化潜能的血管周围前体细胞群体，这些细胞可能适用于心肌再生。本文所述技术可同时分离和纯化两种与天然血管相关的多能间充质细胞群体， 即 CD146+CD34- 周细胞和CD34+CD146-...

从人心脏组织中分离血管周围多能前体细胞群体

我们提出了三种新颖且更高效的方案，用于将人诱导性多能干细胞分化为心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞，并提供了一种递送方法，通过结合细胞注射与补片介导的细胞因子递送，提高移植细胞的定植效率。...

多能干细胞来源的心脏细胞用于心肌修复

本文介绍了一种高效利用年轻来源的人类间充质干细胞的心脏分化潜能以生成具有功能且能够收缩的心肌样细胞的方法。...

体外 人源间充质干细胞向功能性类心肌细胞的分化

本文介绍一种可扩展的方法，通过简单组合使用Activin...

从人多能干细胞生成第一心场样心脏前体细胞及心室样心肌细胞

本文详细描述了一种实验方案，用于在干细胞移植前对其DNA完整性进行评估的分析。...

评估用于心脏细胞治疗的干细胞DNA完整性

本文介绍一种易于使用的3D自组装心脏微组织阵列制备方法，该阵列由预先分化的人诱导多能干细胞来源的心肌细胞、心脏成纤维细胞和内皮细胞组成。这种操作简便且所需细胞量少的心脏微组织制备技术，可用于疾病建模及药物研发的早期阶段。...

利用人iPSC来源的心肌细胞、心脏成纤维细胞和内皮细胞构建三维心脏微组织阵列

本文介绍了一组从人诱导性多能干细胞衍生的心肌细胞在高通量、多维度培养条件下生成心脏类球体（CSs）并进行冷冻保存的实验方案。该三维模型可作为疾病建模和高通量筛选的可靠平台，并在冷冻保存后仍能维持其功能特性。...

人诱导多能干细胞来源心脏类球体的生成、高通量筛选与生物样本库保存

了解如何利用干细胞重编程技术从患者外周血单核细胞生成和扩增心肌细胞。该方法适用于心血管疾病建模和药物心脏毒性测试，操作简便且可重复。

从患者外周血单个核细胞生成与扩增人心肌细胞

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